Elektrochemotherapie bei 3D-Sphäroiden des okulären Melanoms mit einer maßgeschneiderten Elektrode

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung von 3D-Sphäroiden für das konjunktivale und aderhaute Melanom und die Verwendung von tragbaren kundenspezifischen Elektroden für die in vitro Elektrochemotherapie von 3D-Sphäroiden in einer Kulturvertiefung vor. Dies bietet neue Perspektiven für den Einsatz der Elektrochemotherapie bei der Behandlung des okulären Melanoms.

Die Elektrochemotherapie (EKT) ist die Kombination der vorübergehenden Porenbildung nach der Anwendung von elektrischen Impulsen mit der Verabreichung von Zytostatika, die die zytotoxische Wirkung des applizierten Mittels aufgrund von Membranveränderungen verstärkt. In vitro 3D-Kultursysteme simulieren das in vivo Tumorwachstum und bewahren die biologischen Eigenschaften von Tumoren genauer als herkömmliche Monolayer-Zellkulturen. Wir beschreiben ein Protokoll für die Entwicklung von 3D-Tumororganoiden unter Verwendung von Zelllinien des konjunktivalen Melanoms (CM) und des Aderhautmelanoms (UM) sowie die Verwendung von tragbaren kundenspezifischen Elektroden, die für die in vitro EKT in der Kulturvertiefung ohne Zerstörung der Tumorumgebung geeignet sind. Dieses Protokoll analysiert die Kultur und das Wachstum von 3D-CM- und UM-Sphäroiden und ihre Reaktion auf Bleomycin (2,5 μg/ml) allein, Elektroporation (EP) (750 Volt/cm, 8 Pulse, 100 μs, 5 Hz) allein und EKT als Kombination aus EP und Bleomycin. Die Wirkstoffkonzentration und die EP-Einstellungen, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurden nach früheren Experimenten als bevorzugte ECT-Bedingungen festgelegt. Der Assay zur Bestimmung der Lebensfähigkeit des Sphäroids wurde 3-7 Tage nach der Behandlung durchgeführt. Der Effekt auf die Lebensfähigkeit und das Wachstum der 3D-Tumorsphäroide war erst nach der EKT signifikant. Die kundenspezifischen Elektroden werden detailliert beschrieben, um die Anwendung von Impulsen in der Kulturvertiefung zu erleichtern. Diese neuartige Behandlung von 3D-UM- und CM-Sphäroiden stellt ein Sprungbrett für die zukünftige klinische Anwendung dar.

Das Aderhautmelanom (UM) ist der häufigste primäre intraokulare Tumor bei Erwachsenen, während das Bindehautmelanom (CM) 2% aller okulären Melanome ausmacht 1,2,3,4,5,6. Brachytherapie, Protonenstrahlentherapie und Phototherapie sind die Erstlinienbehandlungen bei UM, während eine Enukleation des Globus erforderlich sein kann ^1,2,3. Die Behandlung von CM variiert zwischen den Zentren für Augenonkologie; Die Exzisionsbiopsie mit anschließender lokaler Chemotherapie und/oder Strahlentherapie ist der häufigste Behandlungsansatz⁴. Trotz Behandlung ist CM mit einer Mortalität von 25 % bis 30 % ^verbunden5.

Es gibt einen Mangel an Literatur über die Bildung von CM- und UM-Sphäroiden und die Anwendung von EKT beim okulären Melanom ^6,7,8. Tumor-Sphäroide haben bessere biologische Eigenschaften als herkömmliche 2D-Zellkulturen und wurden als nützliches Werkzeug zur Nachahmung der In-vivo-Tumorumgebung vorgeschlagen⁹. Die Elektrochemotherapie (EKT) kombiniert den Einsatz von undurchlässigen Zytostatika mit der Elektroporation (EP)¹⁰. EP ist die lokale Anwendung von kurzen und intensiven elektrischen Impulsen, die Zellen vorübergehend permeabilisieren, um die Aufnahme von Krebsmedikamenten in Krebszellen lokal zu erhöhen und zu einem erhöhten Zelltod zu führen¹¹. In dieser Studie wird ein Protokoll erstellt, das die Entwicklung von CM- und UM-Sphäroiden beschreibt, und die Ergebnisse nach EKT mit Bleomycin untersucht. Dieses Protokoll könnte Forschern auf dem Gebiet der okulären Onkologie helfen, andere therapeutische Modalitäten für Sphäroide anzuwenden oder weitere Auswirkungen der EKT zu untersuchen. Aufgrund der begrenzten Anwendung der EKT in der Augenheilkunde gibt es nur wenige Erkenntnisse über die Wirkung und den Ablauf dieser Modalität. Somit könnte dieses Experiment das Spektrum der Behandlungsmöglichkeiten in Zukunft erweitern. Wir schlagen eine neuartige, kundenspezifische Handplattenelektrodeneinstellung vor, die die EKT des Sphäroids in den Kulturvertiefungen ohne Zerstörung der Tumorumgebung ermöglicht.

1. Sphäroidbildung

1. Verwenden Sie adhärent wachsende Krebszelllinien für die Sphäroidbildung.
2. Führen Sie alle mit Zellkulturen verbundenen Schritte unter sterilen Laborbedingungen durch.
3. Bereiten Sie das vollständige Standard-Kulturmedium wie für die gewünschten Zelllinien empfohlen vor und erwärmen Sie es mit einem Wasserbad auf 37 °C.
   HINWEIS: Hier wurden die humanen Bindehautzelllinien CM2005.1, CRMM1, CRMM2 sowie die Aderhautmelanomzelllinien 92.1, OMM1 und OMM2 verwendet und in Ham F-12-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum bzw. RPMI mit 10 % fötalem Rinderserum kultiviert.
4. Lösen Sie die interessierenden Zellen mit standardmäßigen enzymatischen Verdauungsmethoden (z. B. Trypsin-EDTA-Lösung).
5. Um die Anzahl der vitalen Zellen zu bestimmen, resuspendieren Sie 10 μl der Zellsuspension in 10 μl Trypanblau-Lösung (1:1) und zählen Sie die Zellen mit einer Kammer (Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler) innerhalb von 5 Minuten. Die Zellen sollten <90% der Konfluenz betragen und in gutem Zustand sein.
6. Um Sphäroide zu bilden, säen Sie 5 x 10³ Zellen pro Vertiefung mit einem Gesamtvolumen von 200 μl vollständigem Kulturmedium in 96-Well-Platten mit extrem niedrigem Anheften. Die Platte wird bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubiert.
   HINWEIS: Für eine wirksame Hemmung der zellulären Bindung verwenden Sie Platten mit extrem niedrigem Anhaftungsgrad mit einem kovalent gebundenen hydrophilen, nichtionischen, neutral geladenen Hydrogel auf der Oberfläche. Dieses Hydrogel hemmt die Immortalisierung von Zellen und zwingt sie in einen schwebenden Zustand, um 3D-Sphäroide zu bilden.
7. Überprüfen Sie die Sphäroidbildung mit einem Mikroskop.
   HINWEIS: Einige Zelllinien bilden im ersten Durchgang keine runden 3D-Tumorsphäroide. Durchlaufen Sie die Tumorsphärenkultur, bevor sie beginnen, ein dunkles Zentrum zu entwickeln. Dissoziieren Sie die Tumormassen je nach Zelllinie nach 4-10 Tagen durch Trypsinisierung. Anschließend säen Sie die einzelnen Zellen in eine frische 96-Platte mit extrem niedrigem Anheften. Durch die Wiederholung dieses Verfahrens für mehrere Passagen passen sich die Zellen an die 3D-Kultur an.

2. Elektrochemotherapie der Tumorsphäroide

1. Verwenden Sie als Assay-Kontrolle unbehandelte Sphäroide und Sphäroide, die nur mit EP oder Bleomycin allein behandelt wurden.
2. Passen Sie die Einstellungen für den Elektroporator an (Impulsanzahl, Impulsfrequenz, Dauer und Spannung; siehe Materialtabelle). Verwenden Sie für Melanomzellen 8 elektrische Rechteckimpulse mit einer Stärke von 750 Volt/cm, einer Impulsdauer von 100 μs und einer Wiederholfrequenz von 5 Hz.
3. Bereiten Sie am Tag 3 der Sphäroidkultur frische Bleomycinsulfatlösung in sterilem PBS in einer Konzentration von 5 μg/ml in einem 15-ml-Röhrchen vor.
4. Tauschen Sie das Zellkulturmedium der Sphäroide aus, indem Sie 200 μl Kulturmedium entfernen und für jede Vertiefung mit 100 μl frischem vollständigem Kulturmedium nachfüllen.
5. Geben Sie 100 μl Bleomycinsulfatlösung in jede Vertiefung (Endkonzentration 2,5 μg/ml). 100 μl frisches Medium zu unbehandelten Kontrollen und Sphäroiden hinzufügen, die nur mit EP anstelle von Bleomycinsulfatlösung behandelt wurden.
6. Führen Sie die Elektroporation durch.
   HINWEIS: Die in Abbildung 1 gezeigten Elektroden wurden in der Forschungswerkstatt der Universität Halle-Wittenberg hergestellt. Sie sind aus Edelstahl gefertigt und passen auf den Griff des Elektroporators. Die Elektroden wurden für den Einsatz in 96-Well-Platten mit extrem niedrigem Aufsatz entwickelt. Ähnliche Edelstahlelektroden können auch für alternative Anwendungen problemlos hergestellt werden.
   1. Elektroden mit 70% Ethanol sterilisieren und Elektroden trocknen lassen. Der Durchmesser der Elektroden beträgt 1 mm, der Abstand zwischen den beiden Elektroden 4 mm und die Länge jeder Elektrode 8 mm (Abbildung 1a).
   2. Platzieren Sie die Elektroden am Boden der Vertiefung, mit den Sphäroiden zwischen den Elektroden. Dies ermöglicht die ideale Positionierung des Sphäroids zwischen den beiden Elektroden (Abbildung 1b).
   3. Schütteln Sie die Platte, damit sich die Sphäroide vom Boden der Vertiefung bewegen und zwischen den Elektroden platziert werden können. Der Sphäroid befindet sich nur für ein paar Sekunden zwischen den Elektroden.
   4. Starten Sie die Elektroporation mit den bevorzugten Einstellungen.
   5. Ersetzen Sie die Bleomycinsulfatlösung in der Vertiefung, indem Sie 150 μl Medium gegen 150 μl frisches Medium austauschen.
   6. Inkubieren Sie die Zellen bis zu 10 Tage lang bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % CO_{2 enthält}. Wenn die unbehandelten Sphäroide beginnen, ein dunkles Zentrum zu entwickeln, beenden Sie das Experiment. Tauschen Sie alle 2-3 Tage 150 μl des Zellkulturmediums aus. Vermeiden Sie dabei eine Unterbrechung der Sphäroide, indem Sie die Pipettenspitze am Rand der Vertiefung positionieren, die Platte kippen und langsam pipettieren.

3. Bestimmung der Sphäroidgröße

1. Messen Sie die Sphäroidgröße am Tag der Behandlung (Ausgangspunkt) und 3-7 Tage nach der Behandlung mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie, indem Sie die Querschnittsfläche der Sphäroide mit ImageJ Fiji¹¹ berechnen.
2. Nehmen Sie mit der Maßstabsleiste ein Bild der einzelnen Sphäroide auf. Verwenden Sie eine Vergrößerung, bei der das gesamte Sphäroid sichtbar ist. Zum Beispiel wurde für CM2005.1 eine 5-fache Vergrößerung verwendet. Speichern Sie das Bild als JPEG.
3. Analysieren Sie die Sphäroidgröße, indem Sie die Querschnittsfläche mit ImageJ/Fiji berechnen.
   1. Installieren Sie die Software (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   2. Starten Sie ImageJ/Fiji. Importieren Sie das Sphäroid-Bild: Datei > Öffnen.
   3. Um den Maßstab einzustellen, wählen Sie die Linienschaltfläche der Symbolleiste und markieren Sie die Linie der Maßstabsleiste im Bild per Mausklick: Analysieren > Maßstab einstellen. Geben Sie mit einer bekannten Entfernung die Entfernung der Maßstabsleiste ein. Ändern Sie die Längeneinheit in μm. Klicken Sie auf das Feld global, um die Einstellungen für alle Bilder mit demselben Vergrößerungsfaktor zuzuweisen.
   4. Konvertieren Sie das Bild in 8-Bit: Bild > Geben Sie > 8-Bit ein.
   5. Wählen Sie Bild > Anpassen > Automatischen Schwellenwert (wählen Sie > Bereich nicht zurücksetzen). Das Sphäroid wird je nach gewählter Schwellenwertmarkierung rot oder schwarz markiert. Passen Sie die Schieberegler so an, dass die Sphäroidpixel rot werden, die Farbe der Nicht-Sphäroidpixel jedoch nicht. Schließen Sie das Dialogfeld "Schwellenwert", ohne auf eine der Schaltflächen zu klicken.
   6. Um die Querschnittsfläche des Sphäroids zu berechnen, wählen Sie Analysieren > Messungen festlegen und klicken Sie auf Fläche, Auf Schwellenwert begrenzen und Beschriftung anzeigen. Schließen Sie das Dialogfeld "Messungen einstellen ", indem Sie auf "OK" klicken.
   7. Um die Ergebnisse anzuzeigen, wählen Sie Analysieren > Partikel analysieren und ändern Sie die Größe (μm²) = 10000-unendlich, um Rauschen zu entfernen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ergebnisse anzeigen und schließen Sie das Fenster mit OK. In den Ergebnissen werden die Sphäroide mit der Beschriftung und dem Bereich angezeigt. Durch Wiederholen der Analysen mehrerer Sphäroide werden die Ergebnisse im Ergebnisfenster aufgelistet.
   8. Um das relative Behandlungsansprechen der mit EKT behandelten Sphäroide im Vergleich zu den unbehandelten und einfach behandelten Kontrollen zu bestimmen, berechnen Sie die prozentualen Veränderungen der Querschnittsfläche.

4. Bestimmung der Lebensfähigkeit der Sphäroide

1. Messen Sie die Sphäroid-Viabilität 3-7 Tage nach der Behandlung mit einem Zellviabilitätsassay, der für 3D-Zellkulturen gemäß den Anweisungen des Herstellers geeignet ist. Der Assay muss große Sphäroide durchdringen und lysieren, um den Nachweis der Lebensfähigkeit durch Quantifizierung von ATP zu ermöglichen, das das Vorhandensein von metabolisch aktiven Zellen signalisiert.
   HINWEIS: In diesem Experiment wurde ein Lumineszenz-basierter Assay als Auslesemethode verwendet. Die Lebensfähigkeit der mit der EKT behandelten Sphäroide wurde sieben Tage nach der Behandlung mit der der Kontrollen verglichen.

Die Experimente wurden mit maßgeschneiderten Handelektroden durchgeführt, die aus hochwertigem Edelstahl bestehen. Die Dicke der Elektroden beträgt 1 mm, die Breite 4 mm, der Abstand zwischen den beiden Elektroden 4 mm und die Länge jeder Elektrode 8 mm (Abbildung 1). EP und Bleomycin allein haben keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit und das Wachstum von UM- und CM-Tumorsphäroiden. Die EKT zeigt eine signifikante Verringerung der Tumorviabilität und der Sphäroidgröße. Bei allen getesteten Sphäroiden wurde nach EKT mit Bleomycin ein Verlust der Sphäroidarchitektur mit dekonstruierten Zellfragmenten um die Sphäroide und eine Nekrose im zentralen und peripheren Bereich beobachtet. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der CM2005.1-Zelllinien. Metastasierte UM-Zelllinien zeigten nach EKT⁸ ein höheres Ansprechen im Vergleich zu primären Zelllinien.

Abbildung 1: Kundenspezifische Handelektroden. Die Elektroden sind aus hochwertigem Edelstahl gefertigt. Der Griff der Elektroden ist mit dem Elektroporator versehen. Die Dicke der Elektroden beträgt 1 mm, die Breite 4 mm, der Abstand zwischen den beiden Elektroden 4 mm und die Länge jeder Elektrode 8 mm (a); Elektroporation von Sphäroiden in einem 96-Well-Format (b). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Zytotoxische Wirkung der Elektrochemotherapie auf Tumorsphäroide der konjunktivalen Melanom-Zelllinie CM2005.1. Die Elektrochemotherapie (EKT, 750 V/cm nach Applikation von 2,5 μg/ml Bleomycin) führte bei Sphäroiden zu stärkeren zytotoxischen Effekten im Vergleich zur alleinigen Elektroporation (EP) oder zur Chemotherapie mit Bleomycin (2,5 g/ml) allein. Die zytotoxische Wirkung wurde gemessen, indem sowohl die Querschnittsfläche als auch ein Viabilitätsassay als Prozentsatz der unbehandelten Kontrolle sieben Tage nach der Behandlung berechnet wurden. Boxplots zeigen die mittlere Querschnittsfläche von Sphäroiden (a); die mittlere Lebensfähigkeit von Sphäroiden (b); Repräsentative Bilder von Sphäroiden, Maßstabsbalken = 200 μm (c). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

EP wird in verschiedenen biotechnologischen und klinischen Anwendungen eingesetzt¹². Neue technologische Entwicklungen, wie z. B. speziell entwickelte Elektroden mit hoher Spezifität für jede Zielzelle und -stelle, können dazu beitragen, dass die EKT überall im Körper auf Gewebe abzielt¹². Das Design und die Position der Elektroden müssen einen vollständigen Zugang zum Tumor ermöglichen und sicherstellen, dass gesundes Gewebe durch die Behandlung nur minimal beeinträchtigt oder nicht geschädigt wird¹³.

Frühere Publikationen zeigten die Wirkung der EKT in humanen Melanomzellsuspensionen in vitro ^7,8. Die Literatur, die sich auf die Anwendung von EKT in 3D-Augenzellmodellen oder anderen ähnlichen in vivo-Umgebungen bezieht, die eine sicherere therapeutische Anwendung ermöglichen, ist begrenzt. Brun et al. postulieren, dass die 3D-Zellen im Gerüst während der morphologischen Analyse eine runde Form haben, die sich von der länglichen Form unterscheidet, die in den 2D-Kulturen gezeigt wird, aber den Zellen aus Biopsien von Patienten extrem ähnlich^{ist 9}. Die Verfeinerung der Therapieeinstellungen und Instrumente, die in 3D-Kulturen verwendet werden, kann zu einer Optimierung der ECT-Parameter führen, was einen genaueren klinischen Ansatz ermöglicht⁹.

Wir beschreiben eine technologische Entwicklung im Hinblick auf neue Elektroden für die Anwendung von EKT in 3D-Zellkulturen. Bleomycin ist das am häufigsten verabreichte Zytostatikum in Kombination mit ECT¹¹. Frühere Studien unserer Gruppe zeigten, dass die angewandten EP-Einstellungen (750 Volt/cm, 8 Pulse, 100 ms, 5 Hz) für die Behandlung von Augentumoren in vitro geeignet waren. Zu den kritischen Schritten der Technik gehören die kurze Zeit, die benötigt wird, um die EKT durchzuführen, während das Sphäroid nach der Mobilisierung sinkt, sowie die genaue Abmessung der Elektroden. Die Notwendigkeit für die kundenspezifischen Elektroden war auf Schwierigkeiten bei der Durchführung der EKT in den Vertiefungen mit den verfügbaren Instrumenten zurückzuführen. Unveröffentlichte Daten aus unserer Gruppe zeigten eine erhöhte Sphäroidschädigung, wenn die Sphäroide in eine größere Vertiefung oder in eine Küvette überführt wurden, um sie für die Behandlung vorzubereiten und dann wieder in die Kulturvertiefung zurückzukehren. Ein Vorteil der beschriebenen Technik ist das Fehlen von Sphäroidmanipulationen zur Durchführung der Behandlung, da die Organoide nicht in größere Platten oder Vertiefungen übertragen werden. Daher behalten alle Sphäroide ihre Form. Ein weiterer Vorteil ist die Verwendung robusterer 3D-Viabilitätsassays zur Bestimmung der Zytotoxizität von EKT im Vergleich zu Standard-Viabilitätsassays, wie z. B. dem MTT-Assay. Dabei werden alle Zellen des Sphäroids lysiert und es sind zusätzliche Zellwaschungen, die Entfernung des Mediums und mehrere Pipettierschritte erforderlich.

Einschränkungen der beschriebenen Methoden sind die kurze Lebensdauer der Sphäroide, die sich sowohl auf die Größe des Tumors als auch auf die Zellnekrose auswirkt, wie sie im Zentrum des Tumororganoids zu sehen ist. Die damit verbundene hohe Mortalitätsrate sowohl bei CM als auch bei UM und die eingeschränkten Therapiemöglichkeiten erfordern eine Anreicherung der bestehenden therapeutischen Möglichkeiten. Die EKT kann eine adjuvante Modalität zur Verbesserung der Lebensqualität des Patienten und zur Verlängerung des Überlebens des Patienten bieten. Diese In-vitro-Bedingungen imitieren eine In-vivo-Umgebung mit höherer Präzision und bieten vielversprechende Ergebnisse für die weitere Anwendung am Menschen. Zukünftige Studien mit Sphäroiden, die aus Primärkulturen hergestellt wurden, können repräsentativere Ergebnisse für die Optimierung der ECT-Einstellungen für eine gezielte Behandlung liefern.

Für diesen Bericht gab es keine spezifische Zuwendung von einer Förderagentur im öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Sektor.

Diese Studie wurde von der Dr. Rolf M. Schwiete-Stiftung unterstützt. Die Autoren danken Martine J. Jager (Laboratory of Ophthalmology am LUMC, Leiden, Niederlande) und Helen Kalirai (Liverpool Ocular Oncology Research Group, Molecular and Clinical Cancer Medicine, University of Liverpool, UK) für die Bereitstellung der UM-Zelllinien. Wir danken auch Sabine Hecht (Klinik für Augenheilkunde, Universitätsklinikum Halle (Saale), Deutschland) für die technische Unterstützung.