Method Article
Первым шагом в опонимание биомолекулы-неорганического взаимодействия твердых фаз является выявление фундаментальных физикохимических констант, которые могут быть оценены путем создания адсорбции изотермс. Адсорбция от жидкой фазы ограничена кинетикой, емкостью поверхности, рН и конкурентоспособной адсорбцией, которую все следует осторожно рассмотреть перед установкой эксперимента по адсорбции.
Основы неорганических органических взаимодействий имеют решающее значение для открытия и разработки новых биоинтерфейсов, поддающимся использованию в биотехнологии и медицине. Недавние исследования показывают, что белки взаимодействуют с поверхностями через ограниченные сайты адсорбции. Фрагменты белка, такие как аминокислоты и пептиды, могут быть использованы для моделирования взаимодействия между сложными биологическими макромолекулами и неорганическими поверхностями. В течение последних трех десятилетий, многие действительные и чувствительные методы были разработаны для измерения физической химии основы этих взаимодействий: изотермальной титрации калореметрии (ITC), поверхностный плазмон резонанс (SPR), кварцевый кристаллический микробаланс (ККМ), общее внутреннее отражение флуоресценции (TIRF), и аттенированной общей спектроскопии отражения (ATR).
Самый простой и доступный метод измерения адсорбции – метод истощения, при котором вычисляется изменение концентрации сорбата (истощение) после контакта с рассеянным сорбентом, рассеянным раствором. Адсорбция изотермс, основанная на данных об истощении, обеспечивает все основные физикохимические данные. Однако адсорбция от решений требует более длительного времени уравновешенности из-за кинетической ограничения и сорбентов с высокой конкретной площадью поверхности, что делает его почти неприменимым к макроскопическим фиксированным поверхностям плоскости. Кроме того, при изучении адсорбирующих пептидов следует учитывать такие факторы, как нестабильность зол, агрегаты наночастиц, кристалличность сорбента, распределение размеров наночастиц, рН раствора и конкуренция за адсорбцию. Истощение данных является частью конструкции обеспечивает всеобъемлющие данные физической химии буквально для каждого растворимого сорбата, но остается наиболее доступной методологией, так как она не требует дорогостоящих населенных конструкций. В этой статье описывается базовый протокол экспериментального исследования пептидной адсорбции на неорганический оксид и охватывает все критические моменты, влияющие на процесс.
За последние 50 лет взаимодействие неорганических поверхностей и пептидов привлекло большое внимание из-за его высокой важности в материаловедении и медицине. Биомедицинские исследования направлены на совместимость и стабильность биоинорганических поверхностей, которые имеют прямые последствия для регенеративной медицины, тканевой инженерии1,,2,,3,и имплантации4,,,5,6,7. Современные биочувствительные устройства, такие как датчики и приводы, основаны на функциональных белках, обездвижемых на оксидных полупроводниковых поверхностях88,9,,10,,11,,12,,13. Современные методы очистки для производства белка часто полагаются на свойства взаимодействия биомолекулы в вниз по течению очистки и разделения14.
Среди нескольких неорганических оксидов, диоксид титана остается наиболее часто используемым в сочетании с биологически значимыми субстратами15,16. Исследования в области биоинтерфейсов на основе TiO2были сосредоточены на установлении прочного и специфического связывания белков и пептидов без изменения их биологических и структурных свойств. В конечном счете, основной целью является высокая плотность поверхности слоя биомолекул с высокой стабильностью и повышенной функциональностью, которая будет способствовать созданию титана на основе биотехнологических и медицинских приложений17.
Титан и его сплавы широко используются в качестве хирургического материала имплантата, по крайней мере шесть десятилетий, потому что поверхность TiO2 слой с толщиной в несколько нанометров коррозии устойчивы и экспонатов высокий уровень биосовместимости во многих in vivo приложений18,19,20. Диоксид титана также широко считается неорганическим субстратом, производимым в биоминерализации, где нуклеация и неорганический фазовый рост, сопровождаемый белками и пептидами, могут обеспечить материалы с многообещающими каталитическими и оптическими свойствами21,22,,23,,24.
Учитывая высокую актуальность взаимодействия между неорганическими материалами и биомолекулами в целом и белково-Тио2 взаимодействий, в частности, было много исследований для решения манипуляции и контроля адсорбции белков на TiO2. Благодаря этим исследованиям, некоторые фундаментальные свойства этого взаимодействия были выявлены, такие как адсорбция кинетики, поверхностного покрытия, и биомолекулы конформации, давая существенную поддержку для дальнейшего прогресса в биоинтерфейсах5,13.
Однако, сложность протеина добавляет значительные ограничения на полное определение и понимание взаимодействия молекулярного уровня белка с неорганическими поверхностями. Предполагая, что биомолекулы взаимодействуют с неорганическими поверхностями через ограниченные участки, некоторые белки с известными структурами и аминокислотными последовательностями были сведены к их компонентам-пептидам и аминокислотам, которые изучаются отдельно. Некоторые из этих пептидов продемонстрировали значительную активность, что делает их уникальным предметом исследований адсорбции без необходимости предыдущего разделения белка25,26,27,28,29,30.
Количественная характеристика пептидной адсорбции на ТиО2 или других неорганических поверхностях может быть достигнута с помощью физических методов, которые были адаптированы специально для биомолекул в течение последних нескольких десятилетий. Эти методы включают в себя итермальной титрации калоремии (ITC), поверхностный плазмон резонанс (SPR), кварцевый кристалл микробаланс (ККМ), полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF), и ослабленной общей спектроскопии отражения (ATR),31все из которых позволяют обнаружить прочность адсорбции, предоставляя ключевые термодинамические данные:
Адсорбция биомолекул к неорганическому материалу может быть осуществлена двумя способами: 1) ЦМТ, а также метод истощения использования частиц, рассеянных в растворе, связывающем с фиксированными макроскопическими поверхностями; 2) SPR, ККМ, TIRF и ATR используют макроскопические поверхности, модифицированные неорганическим материалом, такими как стеклянные или металлические чипсы с золотым покрытием, кристаллы кварца, кристаллы сульфида цинка и чипы PMMA, соответственно.
Изотермальная калория титрации (ITC) является без этикетки физический метод, который измеряет тепло производится или потребляется при титроре растворов или неоднородных смесей. Чувствительные калориметрические клетки обнаруживают тепловые эффекты размером до 100 наноджоулей, что делает возможным измерение тепла адсорбции на поверхностях наночастиц. Тепловое поведение сорбата во время непрерывного добавления - титрования, обеспечивает полный термодинамический профиль взаимодействия выявление enthalpy, связывающей постоянной, и энтропии при заданной температуре32,33,34,35,36.
Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса (SPR) представляет собой поверхностно-чувствительный оптический метод, основанный на измерении рефракционного индекса носителей в непосредственной близости от исследуемой поверхности. Это метод мониторинга обратимой адсорбции и толщины адсорбированного слоя в режиме реального времени и без этике. Связывающая константа может быть рассчитана из коэффициентов ассоциации и диссоциации. Эксперименты по адсорбции, проводимые при различных температурах, могут дать информацию о температурной зависимости энергии активации и последовательно других термодинамических параметров37,,38,,39.
Метод микробаланса кварцевого кристалла измеряет изменение колеблющихся частот ыпизоэлектрических кристаллов во время процессов адсорбции и дезорпации. Связывающая константа может оцениваться по соотношению констант скорости адсорбции и desorption. ККМ используется для измерения относительной массы и, следовательно, не нуждается в калибровке25,,27,,40. ККМ используется для адсорбции как из газа, так и из жидкости. Техника жидкости позволяет использовать цКМ в качестве инструмента анализа для описания осаждения на различных модифицированных поверхностях41.
Полная внутренняя флуоресценция внутреннего отражения (TIRF) является чувствительной оптической межфалетовой техникой, основанной на измерении флуоресценции адсорбированных флюорофоров, возбужденных внутренне отраженными эвакуационными волнами. Метод позволяет обнаружить флуоресцентные молекулы, покрывающие поверхность толщиной на порядок в десятки нанометров, поэтому он используется при изучении макромолекулярного адсорбции на различных поверхностях42,,43. На месте мониторинга динамики флуоресценции при адсорбции и desorption обеспечивают адсорбции кинетики и, следовательно, термодинамические данные42,43.
Ослабленная общая отражательная лента (ATR) была использована Роддиком-Ланзилоттой для создания изотермов изазомерм изазомермизии лизиновых спектров на уровне 1600 и 1525 см-1. Это первый случай, когда связывающая константа для пептида на TiO2 была определена с помощью инфракрасного метода in situ44. Этот метод был эффективен в создании асотермации для полилизиновых пептидов45 и кислых аминокислот46.
В отличие от вышеупомянутых методов, где параметр адсорбции измеряется на месте, в обычном эксперименте количество адсорбированных биомолекул измеряется изменением концентрации после того, как поверхность связалась с раствором. Поскольку концентрация сорбата распадается в подавляющем большинстве случаев адсорбции, этот метод называется методом истощения. Измерения концентрации требуют проверенного аналитического исследования, который может быть основан на внутреннее аналитическое свойство сорбата или на основе маркировки47,,48,,49,,50 или произвобления51,,52 из них.
Эксперименты по адсорбции с использованием ККМ, SPR, TIRF или ATR требуют специальной подготовки поверхности чипов и датчиков, используемых для исследований адсорбции. Подготовленные поверхности должны использоваться один раз и требуют изменения при переключении адсорбата, в связи с неизбежным гидратации поверхности оксида или возможной chemisorption сорбата. Только один образец в то время может быть запущен с помощью ЦМТ, ККм, SPR, TIRF, или ATR, в то время как в методе истощения можно запустить десятки образцов, для которых количество ограничено только емкостью термостата и наличием сорбента. Это особенно важно при обработке больших выборочных партий или библиотек биологически активных молекул. Важно отметить, что метод истощения требует не дорогостоящего оборудования, а только термостата.
Однако, несмотря на очевидные преимущества, метод истощения требует сложных процедурных функций, которые могут показаться громоздкими. В этой статье представлено, как выполнить всеобъемлющее физико-химическое исследование дипептидного адсорбции на TiO2 с использованием метода истощения и рассматриваются проблемы, с которыми исследователи могут столкнуться при проведении соответствующих экспериментов.
1. Приготовление растворов дипептидных запасов и разбавлений
2. Приготовление титании соль
3. Смешивание и термостатирование
4. Фильтрация термоустановленных образцов
5. Анализ дериватизации и HPLC
Адсорбция дипептида на нанокристаллическом диоксиде титана изучалась в биосовместимых условиях в температурном диапазоне от 0 до 40 градусов по Цельсию. Экспериментальная дипептидная адсорпация (A, mmol/g) на поверхности диоксида титана
Где C0 и Ce являются дипептидные начальные и равновесные концентрации в миллимолях, соответственно; V - это объем дипептидного раствора в литрах; и м вес сорбента в граммах.
Измерения дипептидного адсорбции были обработаны данными с помощью модели Генри. Эта модель предполагает адсорбцию в относительно низких концентрациях с молекулами сорбата, изолированными друг от друга на поверхности сорбента, и подходит для описания экспериментальных данных(рисунок 3). Обратите внимание, однако, что эта модель может быть применена только в случае обратимого адсорбции, который также должен быть подтвержден. Для этого подходит ИК-спектроскопия материала, промытого несколько раз. Полученные равновесные пептидные количества на TiO2 и растворе связаны в соответствии с линейным уравнением:
где KH является константой адсорбции Генри.
Равновесие, связывающее постоянную KH, было получено со склона зависимости дипептидной адсорбции(A) от концентрации дипептидного равновесия(Ce). Стандартная свободная энергия Гиббса(ЗГ,кДж/мол) для каждой температуры T была определена с помощью уравнения Ван'т Хоффа:
где R является идеальной газовой константой в J/mol'K, а T - это температура процесса адсорбции в Кельвине.
Дипептид Гиббс свободных энергий определяется при каждой температуре (Рисунок 4) раскрыты enthalpy (ЗГ) как перехват линейной регрессии с оси. Переменная регрессии, энтропия процесса (QS), была выведена из фундаментального уравнения:
Рассчитанные значения равновесной связывающей постоянной(KH), стандартные энергии Гиббса (ЗГ), enthalpy (ЗГ), и энтропии() для Иль-Его представлены в таблице 1.
Рисунок 1: Разбавление раствора дипептидного запаса 16 мМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Кривая калибровки при различной концентрации дипептида. Концентрация дипептида составила 0,4-16,0 мМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Дипептидадсид изотермс, рассчитанный по модели Генри для каждой температуры. Дипептидадсид изотермсывания при (A) 0 КС (B) 10 C (C) 20 градусов по Цельсию(D) 30 градусов по Цельсию, и (E) 40 градусов по Цельсию, соответственно. Расчетные коэффициенты корреляции (R2) упали в диапазон 0,96-0,99 для всех полученных истеромов модели Henry. Бары ошибок представляют 95% доверительный интервал для каждой концентрации образца, измеренной в тройном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Зависимость стандартного Гиббса свободной энергии дипептидного адсорбции от температуры. Ошибки баров представляют 95% доверительный интервал для Гиббса свободной энергии в качестве косвенного измерения на основе модели Генри. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
T, K | KH | ЗГ0, kJ/mol | ЗХ0, kJ/mol | ΔS0, kJ/mol K |
273.15 | 0,32 и 0,01 | 2,6 и 0,0 | - - 41 и 9 | - 0,16 и 0,03 |
283.15 | 0,25 и 0,01 | 3,2 и 0,1 | ||
293.15 | 0,17 и 0,06 | 4,3 и 0,9 | ||
303.15 | 0,050 и 0,002 | 7,6 и 0,1 | ||
313.15 | 0,037 и 0,002 | 8,3 и 0,1 |
Таблица 1: Термодинамические параметры дипептидного адсорбции.
Адсорбция от растворов для изотермовой конструкции требует более длительного времени для уравновешенности из-за кинетических ограничений и сорбентов с высокой специфической площадью поверхности. Кроме того, при адсадосировании аминокислот следует учитывать нестабильность зол, агрегатов наночастиц, кристалличность, распределение размеров наночастиц, рН раствора и конкуренцию за адсорбцию. Тем не менее, адсорбция является отермом строительства с использованием метода истощения остается наиболее доступной методологией, потому что она не требует дорогостоящих населенностей, и все же она обеспечивает исчерпывающие данные физической химии буквально для каждого растворимого сорбата.
Необходимо проводить различие между режимами адсорбции (т.е. раствором, рассеянным частицами или на фиксированной поверхности), когда кристаллический материал используется в качестве сорбента. Следует ожидать существенной разницы в распределении кристаллических граней на макроскопически плоских поверхностях и на частицах. Результат термодинамических параметров, определяемых с адсорбцией пептидов на наночастицах, может не соответствовать термодинамическим параметрам пептидного адсорбции на макроскопически плоские поверхности.
Среднее количество пептидов, адсорбируется на неорганических поверхностях, крайне низко. При комнатной температуре это значение составляет около нескольких сотен микрограммов на квадратный метр28. Это небольшое количество адсорбате требует точных методов измерения и твердых веществ с хорошо развитыми поверхностями. Поэтому мелкие частицы веществ с большой конкретной поверхностью (сотни квадратных метров) следует использовать для экспериментов по адсорбции43,,56,,57,,58,,59,,60.
Пептиды, как и белки, нестабильны и сохраняют свою функциональность в узком диапазоне условий. Проводились адсорбционные эксперименты на нанокристаллическом диоксиде титана при биосовместимых температурах 0 кс-40 кС (273,15 К-313,15 К), которые аналогичны экспериментам нормального, функционирующего живого организма. Адсорбция при более высоких или низких температурах не имеет значения и не должна рассматриваться для эксперимента.
Многофункциональные биологически активные соединения также обладают высокой восприимчивостью к рН носителей, так как это влияет на поверхностный заряд и, следовательно, взаимодействие Кулона между заряженными функциональными группами61,,62,,63. Сорбентный заряд оксидных материалов также зависит от рН-зависимых из-за активного обрыва протона на гидратаной поверхности64. Для создания pH стабильных условий для адсорбционного равновесия требуется использование буфера. В этом исследовании, MES буфер используется для его некоординирующих свойств65, поэтому он не будет конкурировать с пептидом для адсорбции на поверхности оксида металла, в отличие от фосфатных буферов66.
Это недавнее испытание аминокислоты адсорбции показывает, что основным местом связывания на наночастицы является дефект поверхности55. Распределение дефектов на поверхности является одной из наименее контролируемых особенностей нанокристаллических субстратов, поэтому следует использовать сорбент из одной партии для поддержания консистенции в исследованиях адсорбции.
ККМ, плазмонный резонанс и ЦМТ являются подлинными методами с тонкой чувствительностью, которые в сочетании спектроскопических методов выявляют структурные особенности адсорбата во время взаимодействия с поверхностью. Однако они не преодолевают кинетические ограничения и по-прежнему требуют значительного времени для достижения уравновешивания адсорбции. Кроме того, может быть обработан только один образец за один раз, что затрудняет анализ пакетных образцов. С другой стороны, представленный метод истощения прост и ограничен только емкостью термостата, что делает возможным обработку большого количества образцов.
Термоизированные образцы должны быть отфильтрованы, как только они будут удалены из термостата, чтобы избежать переимеченности, вызванной температурой. Хотя уравновешивать при новой температуре может занять до нескольких часов, сохранение образцов адсорбции при другой температуре должно быть сведено к минимуму. Центругирование образцов для сверхнатантного разделения также не рекомендуется, так как оно занимает до нескольких минут и может привести к изменению концентрационного равновесия. Выбор фильтровального материала зависит от характера сорбата и должен уменьшить возможную привязку фильтра для максимального восстановления. Лучше всего следовать инструкциям и рекомендациям поставщиков при выборе конкретных фильтров.
Кроме того, следует иметь в виду, что изменение концентрации в исследованиях адсорбции должно контролироваться с помощью проверенного метода количественной оценки с использованием масс-спектрометрии, радиоспектроскопии или уф-видимой спектроскопии. Анализ прост, если адсорбировать является спектроскопически активным, в противном случае требуется дополнительная маркировка или производная адсорбация.
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была финансово поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (Грант No 15-03-07834-а).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | TCI Chemicals | 4432-31-9 | MES, >98% |
Acetonitrile | Panreac AppliChem | HPLC grade | |
Chromatography vials | glass | ||
Dipeptide Ile-His | Bachem | 4000894 | |
Double-distilled water | DDW was obtained on spot | ||
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" | J.P. Selecta | 3000865 | 5 L, 40 kHz, 120 Watts |
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector | Shimadzu, LC-20 Prominence | HPLC | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich (Merck) | 67-63-0 | 99.70% |
LabSolutions Lite | Shimadzu | 223-60410 | Software for high-performance liquid chromatography system |
Nanocrystalline TiO2 | Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details. | ||
Phenyl isothiocyanate | Acros Organics | 103-72-0 | PITC, 98% |
Reversed-phase Zorbax column | ZORBAX LC | 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm | |
Syringe filter | Vladfilter | 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate | |
Test sterile polymeric tube | polypropylene | ||
Thermostat TC-502 | Brookfield | Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich (Merck) | 121-44-8 | TEA; 99% |
Trifluoroacetic acid | Panreac AppliChem | 163317 | TFA, 99% |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены