Простой подход к выполнению измерений TEER с использованием самодельного Вольт-Ампереметра с программируемой частотой вывода

Здесь мы демонстрируем, как настроить недорогой вольт-ампереметр с программируемой частотой вывода, который может быть использован с коммерчески доступными электродами палочки для трансэпителиальных/эндотелиальных измерений электрического сопротивления.

Трансэпителиальное/эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) используется с 1980-х годов для определения выпуклости и проницаемости систем модели in vitro. В большинстве случаев электроды палочки используются для определения электрического беспредела между верхним и нижним отсеком системы вставок фильтра клеточной культуры, содержащей клеточные монослои. Мембрана фильтра позволяет клеткам придерживаться, поляризовываться и взаимодействовать, строя плотные соединения. Этот метод был описан с различными линиями клеток (например, клетки гематоэнцефалического барьера, гематробризолочной жидкости барьер, или желудочно-кишечного тракта и легочного тракта). Измерительные приборы TEER могут быть легко получены от различных поставщиков лабораторного оборудования. Однако существуют более экономичные и настраиваемые решения, которые только можно себе представить, если соответствующий вольттамметр будет самостоятельно собран. Общая цель этой публикации заключается в создании надежного устройства с программируемой частотой вывода, которые могут быть использованы с коммерчески доступными электродами палочки для измерения TEER.

Эпителиальные и эндотелиальные клетки функционируют как клеточные границы, разделяя апикальные и базолатеральные стороны тела. Если они соединены через плотные соединения, пассивное распространение вещества через параклеточные пространства ограничено^1,что приводит к образованию выборочно проницаемого барьера. Несколько искусственных барьерных систем были разработаны² с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток (HBMEC, гематоэнцефалический барьер^3,4,5,6,7), сосудистое сплетение эпителиальные клетки (HIBCPP/PCPEC, кроветворно-спинномозговой жидкости барьер^{8,9,10,11,12,13,14}), колоректальные аденокарциномы клеток (Caco-2, модели желудочно-кишечного тракта¹⁵), или дыхательных путей / альвеолярных клеточных линий (легочные модели^16,17). Эти системы обычно состоят из клеток, выращенных в монослой на проницаемых мембранах (т.е. системы вставки фильтра), чтобы обеспечить доступ к апиальным и базолатеральным сторонам. Важно, чтобы целостность модельной системы соответствовала условиям in vivo. Таким образом, несколько методов были разработаны для анализа барьерной функции путем измерения параклеточного распространения трассирующие соединения по всему клеточному слою. Эти вещества включают радиомаркированную сахарозу, краситель-маркированный альбумин, FITC-маркированный инулин, или краситель-маркированный dextrans². Тем не менее, химические красители могут сделать клетки непригодными для дальнейших экспериментов. Для мониторинга барьерных систем неинвазивно, измерение трансэпителилиального/трансендотелелиального электрического сопротивления (TEER) по всей клеточной монослойной может быть использовано^2,18,19. Поскольку биполярные электродные системы находятся под влиянием электронной поляризации импедеданности на электроде-электролитный интерфейс, тетраполярные измерения, как правило, используются для преодоления этого ограничения²⁰. Техника подкладки четырехтерминального зондирования (4T), который был впервые описан в 1861 году Уильям Томсон (Лорд Кельвин)²¹. Короче говоря, ток вводится парой ток-несущих электродов, в то время как вторая пара электродов напряжения зондирования используется для измерения падения напряжения^20. В настоящее время так называемые электроды палочки состоят из пары двойных электродов, каждый из которых содержит серебряные/серебряные хлоридные гранулы для измерения напряжения и серебряный электрод для прохождения тока². Электрический импеданс измеряется между акическим и базолатеральным отсеком с клеточного слоя между ними (Рисунок 1). Сигнал квадратной волны с частотой обычно 12,5 Гц применяется на внешних электродах и в результате переменный ток (AC) измеряется. Кроме того, потенциальное падение по всему клеточному слою измеряется второй (внутренней) электродной парой. Электрический импедан затем рассчитывается в соответствии с законом Ома. Значения TEER нормализуются путем умножения импеданса и площади поверхности клеточного слоя и, как правило, выражаются в виде 2 см.

Существуют системы, в которых клетки и электроды расположены более изощренным способом, но также основаны на принципе измерения 4T и могут быть использованы с теми же измерительными устройствами. Системы EndOhm, например, в которые вставляется фильтр, содержат камеру и крышку с парой концентрических электродов с той же структурой, что и электрод палочки. Форма электродов позволяет более равномерное ток плотность потока через мембрану, тем самым уменьшая различия между показаниями. Еще более сложным (но и более точным) является ussing камера, где клеточный слой отделяет две камеры заполнены решением Ringer²². Сама камера может быть газом с кислородом, CO₂, или N₂, и перемешивают или дополнены экспериментальными веществами. По мере того как перенос иона через слой клетки происходит, потенциальная разница может быть измерена 2 электродами напряжения-зондируя около ткани. Это напряжение отменяется двумя ток-несущими электродами, расположенными рядом с клеточным слоем. Измеренный ток затем даст чистый ионный транспорт и трансэпителиальной устойчивости, которая отражает целостность барьера, может быть определена²². Измерение TEER также может быть применено на системах кузова-на-чипе, которые представляют модели барьерной ткани^23,24. Эти системы имитируют условия виво клеток и часто состоят из нескольких типов клеток, уложенных друг на друга слоями.

В следующем протоколе объясняется, как настроить экономически эффективный и надежный вольттамметр с программируемой частотой вывода, который не производит статистически значимых различий в TEER по сравнению с коммерчески доступными измерительными системами.

1. Сборка базового вольт-ампереметра для измерения TEER

1. Подготовьте стандартное зарядное устройство USB в виде 5 V D.C. питания, usb удлинитель, микроконтроллер, который будет использоваться в качестве программируемого генератора квадратной волны, два стандартных многометровых, которые способны измерять переменный ток и напряжение в качестве корня среднего квадрата ( True-RMS), четыре кабеля с банановыми пробками, телефонный удлинитель с женским разъемом RJ14, включая шесть булавок с внутренними четырьмя проводными (6P4C), два коротких кабеля, люстровый терминал, пре-резистор 120 кЗ, прысовые проводные феррулеи и паяльники. Необходимые инструменты являются изоляционная стриптизерша, обжимающий инструмент, и паяльник.
2. Во-первых, подключите расширение USB к доске микроконтроллера.
3. Произвластая конечная изоляция двух коротких кабелей. Приспойс одна сторона на кабель либо непосредственно к контактным 0 и 2 микроконтроллера или пайки люки, которые, в свою очередь, обрезаются на соответствующих контактов. Crimp других концов к концу провода ferrules и подключить их к люстру терминала, как показано на рисунке 1.
4. Свяжите банановые вилки с многометровой. Стрип и обжимать другой конец каждого из четырех кабелей.
5. Разрежьте телефонный удлинитель на две части и разобрали и обжигируе проводников стороны, содержащей женский разъем. Проверьте непрерывность проводников и булавок.
6. Первый мультиметр будет использоваться для измерения тока в КЗ (обратите внимание, что режим переменного тока должен быть установлен явно). Соедините его в серии с 120 кЗ пре-резистор агитатора, чтобы закрепить пять и шесть разъема RJ14, соответствующий внешней электродной паре электрода палочки.
7. Наконец, связать второй мультиметр, который будет использоваться для измерения трансэпителиального напряжения падение в МВ, через люстра терминала булавки три и четыре разъема RJ14, соответствующие внутренней пары электродной палочки электрода.
8. При желании установите установку в шасси.

2. Программирование микроконтроллера

1. Изменение предоставленного исходного кода (дополнительный файл кодирования 1) по мере необходимости. В данной форме, контакты 0 и 2 будут чередоваться между землей и No 5 V с 40 мс половину времени колебаний. Таким образом, будет генерироваться сигнал квадратной волны с амплитудой 5 В и частотой около 12,5 Гц. Реальные значения могут отличаться из-за неточности времени микроконтроллера.
2. Подключите микроконтроллер к настольному компьютеру через порт USB и загрузите исходный код с соответствующим программным обеспечением^25.

3. Запись осцилломагов напряжения (по желанию)

1. Объездные булавки пять и шесть разъема RJ14 с 1 кЗ тест резистора и подключиться к осциллоскоп.
2. Проверьте частоту, пиковое напряжение и форму волны. Оцифровка и экспорт данных.
3. При желании записывай осцилломамы с эталонного устройства (EVOM) и самособранный вольттамметр для сравнения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае данные были записаны с помощью цифровой области хранения HM 208. Будучи очень простой цифровой осциллоскоп, изображение может быть внутренне оцифрованы (замороженные), но должны быть построены с помощью аналога PM 8143 X-Y рекордер. Изображение было впоследствии отсканировано.

4. Культивирование клеток и измерение TEER

1. Семена человека хороидное сплетение папилломы (HIBCPP) клетки на клеточной культуры фильтра вставки с поры размером 3 мкм в DMEM / F12 (см. Таблица материалов), содержащий 10% плода теленка сыворотки⁹. Выращивайте клетки при 37 градусах По Цельсия в насыщенной водой атмосфере, содержащей 5% CO_2, как описано В Dinner et al.⁹.
2. Когда фильтры достигают импеданса от 70 и см², измените на безсыворотку DMEM/F12 и определите тайм-пойнт как День 0.
3. Подключите электрод к порту RJ14 самособранного вольтаметры и подключите блок питания USB. Установите многометровый режим напряжения (mV) и режим тока переменного тока (ЗА), соответственно.
   1. Кроме того, подключите электрод к коммерчески доступному справочному устройству и включите его в соответствии с инструкциями производителя.
4. Стерилизовать электрод в 80% этанола в течение 10 мин и уравновесить в соответствующей среде еще 10 мин.
5. Поместите электрод в обоих отсеках системы вставок фильтра клеточной культуры (более длинная часть электрода в нижнем отсеке и более короткая часть в верхнем отсеке), содержащую слой клетки HIBCPP до тех пор, пока значения измерения не останутся неизменными.
6. Для эталонного устройства обратите внимание на импедацию непосредственно или вычислите импедацию в соответствии с законом Ома (R q U/I) для самособранного вольтаметры. Имейте в виду, что угол электрода влияет на измерения.
7. Повторите измерение TEER (шаги 3'6) от дня 0 до дня 4.

Для сравнения работы самособранного вольтаметры с его коммерчески доступным аналогом была записана осциллома напряжения обоих устройств.

Как показано на рисунке 2А,эталонный инструмент генерировал сигнал квадратной волны с амплитудой 80 мВ и временем колебаний 80 мс, что соответствует частоте 12,5 Гц, при работе при нагрузке с резистором теста 1 кЗ.

В отличие от этого, микроконтроллер самособранного устройства переключил напряжение питания на сигнал квадратной волны с амплитудой 5 В(рисунок 2В),если не было установлено предварительное сопротивление. Стало очевидно, что полученный ток разрушает любую функцию барьера и не применим для экспериментов с клеточной культурой (данные не показаны). Еще одна проблема заключается в том, что в этой установке 1 кЗ тест резистор вызвалпереть перегрузку в результате снижения напряжения (Рисунок 2B). Кроме того, эффективное время колебаний микроконтроллера составило 60 мс (частота - 16,7 Гц) и тем самым отличалось от запрограммированного времени задержки из-за неточности излучателя времени. Если был установлен пререзитор 120 кЗ, амплитуда уменьшилась до значения 40 мВ, что было подходит для клеточной культуры(рисунок 2C). Как видно из осциллома, соотношение сигнала к шуму было значительно нарушено(рисунок 2C),но не повлияло на измерения заметно.

Оба устройства были использованы для определения импеданса искусственного кровеносного спинномозгового жидкостного барьера (упрощенная схема, показанная на рисунке 2D). Клетки HIBCPP культивировались на вставках фильтра клеточной культуры, а TEER измерялся в течение 6 дней: начиная с одного дня до того, как клетки перемещались в условия без сыворотки (День -1) и до 4 дней после изменения среды (День 4). Все измерения проводились в четвероногих с использованием четырех фильтров HIBCPP, подготовленных таким же образом. Аналогичные значения были получены для эталонного инструмента и самособранного вольтаметры(рисунок 3). Измерения были воспроизводимыми, а стандартные отклонения находились в пределах одного и того же диапазона. Значения TEER варьировались от 20-550 и см². Используя фильтры 0,33 см^2, это приравнивается к абсолютному беспретечному от83–1660.

Рисунок 1: Диаграмма укладки базового вольт-ампереметра для измерения TEER. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Осциллограммы и настройка измерения. (A) Коммерчески доступные EVOM. (B) Самосборный voltammeter без предварительного резистора. (C) Самосборный вольттамметр с 120 кЗ предварительнорезителем. (D) Схема цепи установки измерения. Обратите внимание, что_{электрод} C появляется только в электрических схемах, когда используются биполярные системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: измерения TEER слоев клеток HIBCPP на вставках фильтра культуры клетки перед переключением к среде культуры сыворотки свободной (День -1), на день переключения (День 0), и up to 4 дня после (Дни 1'4). Бары ошибок указывают на стандартное отклонение четырех фильтров HIBCPP, которые были подготовлены таким же образом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительный файл кодирования 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Дополнительный файл кодирования 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Дополнительный файл кодирования 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Прежде чем самодельный вольттамметр может быть использован в повседневной жизни, важно проверить устройство для правильной функции. В нашем случае было запрограммировано несколько колебаний 40 мс (12,5 Гц), но эффективное время колебаний оказалось 60 мс (16,7 Гц). Эта неточность времени излучателя микроконтроллера не оказала заметного влияния на измерения TEER. Возможно, лучше всего определить фактическую частоту с помощью частоты одного из мультиметров. При обнаружении какого-либо отклонения исходный код может быть соответствующим образом скорректирован. Кроме того, настоятельно рекомендуется проверить, дает ли резистор теста или другие определенные установки правильным и воспроизводимым результатам. При работе с искусственными клеточными барьерными системами, было бы лучше всегда соотнести поток молекул с измерением impedance.

В этом случае прикладной ток был ограничен с помощью пререзитора 120 кЗ. Если предположить, что типичные значения TEER варьируются от 100 х 2,000 евро, падение напряжения по всему клеточному слою может быть рассчитано на 4-83 мВ. TEER 1 кЗ был смоделирован испытательным резистором, и в результате потенциальное падение было подтверждено на 40 мВ(рисунок 2C).

Коммерчески доступные устройства часто обеспечивают переключатель диапазона измерений для переключения предварительного резистора и таким образом ограничивают выходной ток различными значениями. В этом случае можно установить различные пререзиторы или даже заменить резистор на потентиометр.

Показанная установка представляет собой экономически эффективную альтернативу коммерчески доступным инструментам для измерения TEER. Значения, измеренные с помощью самособранного вольтаметра, были сопоставимы с эталонным устройством в широком диапазоне. То же самое относится и к стандартным отклонениям. Шум в сигнале квадратной волны не повлиял на измерения заметно. Протокол может поддержать ученых, которые ограничены ограниченными финансовыми ресурсами или которые хотят проводить предварительные эксперименты при низких затратах.

Кроме того, микроконтроллер может быть легко запрограммирован на различные частоты вывода. Это может быть полезным, так как очевидное impedance состоит из R_среды, R_TEER, а также емкость_{C-клеточного слоя}²⁶ (рисунок 2D). Кроме того,_{электрод} С появляется при использовании биполярных систем, в то время как влияние импеданции электрода уменьшается в тетраполярных системах. Это означает, что измеренный импедацией будет доминировать R_TEER на низких частотах и, в биполярных системах, мощностью электродов, в то время как на высоких частотах общая импеданция сходится к сопротивлению среды^{26, 27}. В период, impedance находится под влиянием_{c-клеточного слоя}, который, следовательно, доступен с помощью электрической спектроскопии импеданса²⁸.

Мы предоставляем два (непроверенных) примера, чтобы дать представление о том, как устройство может быть оптимизировано или перепрограммировано для различных приложений. Во-первых, очень простой спектроскопии импедеданса может быть реализована путем чередования частоты вывода в 20 секундах между 12,5, 500 и 5000 Гц (дополнительный кодовый файл 2). В этом случае может быть использован тетраполярный^20,28 или биполярный²⁷ электрод. Прикладная частота может быть показана многометровым элементом сборки (или любым дисплеем или светодиодом, подключенным к микроконтроллеру). Во-вторых, устройство может быть использовано для измерения проводимости буферов и носителей. Обычно это делается с использованием тетраполярных электродов с высокими частотами в диапазоне 1-110 кГц. Код в дополнительном кодирующем файле 3 не содержит времени задержки и (с нашим устройством) генерируетчастоту около 70 кГц.

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.

Авторы хотели бы поблагодарить Германа Лиггесмайера и Марвина Бенде за их экспертные советы в области электротехники и информатики.