نهج بسيط لاجراء قياسات TEER باستخدام الذاتي الصنع فولت-Amperemeter مع التردد القابل للبرمجة الناتج

هنا ، ونحن نظهر كيفيه اعداد غير مكلفه فولت-amperemeter مع تردد الإنتاج القابلة للبرمجة التي يمكن استخدامها مع الأقطاب الكهربائية عود المتاحة تجاريا لقياسات المقاومة الكهربية/البطانيات.

وقد استخدمت المقاومة الكهربائية الغشائية/البطانية (TEER) منذ الثمانينات لتحديد كونفلوينسي ونفاذيه أنظمه نموذج الحاجز الأنبوبي. في معظم الحالات ، تستخدم أقطاب تشوستيك لتحديد المقاومة الكهربائية بين المقصورة العلوية والسفلية لنظام ادراج فلتر الخلية الذي يحتوي علي الطبقات الخلوية الاحاديه. يسمح غشاء الفلتر للخلايا بالتصاق والاستقطاب والتفاعل من خلال بناء تقاطعات ضيقه. وقد وصفت هذه التقنية مع مجموعه متنوعة من خطوط الخلايا المختلفة (علي سبيل المثال ، خلايا حاجز الدم في الدماغ ، حاجز الدم النخاعي السائل ، أو الجهاز الهضمي والمسالك الرئوية). يمكن الحصول علي أجهزه قياس TEER بسهوله من موردي المعدات المختبرية المختلفة. ومع ذلك ، هناك حلول أكثر فعاليه من حيث التكلفة وقابله للتخصيص يمكن تخيلها إذا كانت فولتاممتر المناسبة ذاتية التجميع. الهدف العام لهذا المنشور هو إنشاء جهاز موثوق به مع تردد الإخراج القابل للبرمجة والذي يمكن استخدامه مع أقطاب عود المتاحة تجاريا لقياس teer.

تعمل الخلايا الظهاريه والبطانية كحدود خلوية ، تفصل بين الجانبين الابيكي والجانبي للجسم. إذا كانت متصلة من خلال تقاطعات ضيقه ، يتم تقييد انتشار المواد السلبية من خلال المساحات باراخليه¹، مما ادي إلى تشكيل حاجز نفاذيه انتقائية. تم تطوير العديد من أنظمه الحاجز الاصطناعي² باستخدام خلايا بطانية الاوعيه الدموية المجهرية (hbmec ، حاجز الدم في الدماغ^{3،4،5،6،7}) ، الضفيرة المشيميه الخلايا الظهاريه (هيبكب/pcpec, الدم-السائل النخاعي الحاجز^{8,9,10,11,12,13,14}), القولون والمستقيم الخلايا السرطانية (caco-2 ، والنماذج المعدية المعوية¹⁵) ، أو خطوط المسالك الهوائية/السنخيه (النماذج الرئوية^16،17). وتتكون هذه النظم عاده من خلايا تزرع في طبقه أحاديه علي اغشيه قابله للاختراق (اي نظم ادراج الفلاتر) للسماح بالوصول إلى الجانبين الجانبي والرمزي. ومن المهم ان تتطابق سلامه النظام النموذجي مع الظروف المجرية. التالي ، تم تطوير العديد من التقنيات لتحليل وظيفة الحاجز عن طريق قياس الانتشار الخلوي لمركبات التتبع عبر طبقه الخلية. وتشمل هذه المواد السكروز شعاعي, صبغ المسمي الزلال, fitc المسمي انولين, أو صبغ المسمي الدكستران². ومع ذلك ، الاصباغ الكيميائية يمكن ان تجعل الخلايا غير قابله للاستخدام لمزيد من التجارب. لمراقبه أنظمه الحاجز الارحال ، يمكن استخدام قياس المقاومة الكهربائية الخلوية/الغشائية عبر الطبقة الاحاديه الخلية^2،18،19. ونظرا لان أنظمه القطب الثنائي القطب تتاثر بمقاومه الاستقطاب الكهربائي في الواجهة الكهربائية بالكهرباء ، تستخدم القياسات التيترابولاره عموما للتغلب علي هذا القيد²⁰. تقنيه التشكلات هو الاستشعار أربعه محطه (4t) التي تم وصفها لأول مره في 1861 من قبل وليام طومسون (لورد كلفن)²¹. باختصار ، يتم حقن التيار من قبل زوج من الأقطاب الكهربائية الحالية في حين يتم استخدام زوج ثان من أقطاب استشعار الجهد لقياس انخفاض الجهد²⁰. في الأيام الحاضرة ، ما يسمي أقطاب تشوستيك تتكون من زوج من أقطاب مزدوجة ، تحتوي كل منها علي بيليه الفضة/الفضة كلوريد لقياس الجهد والكهربائي الفضة لتمرير الحالي². وتقاس المقاومة الكهربائية بين الحجيره والحجرة الاوليه مع طبقه الخلية بين (الشكل 1). ويتم تطبيق اشاره الموجه المربعة بتردد 12.5 هرتز عاده في الأقطاب الكهربية الخارجية ويتم قياس التيار المتناوب الناتج (AC). بالاضافه إلى ذلك ، يتم قياس الإسقاط المحتمل عبر طبقه الخلية بواسطة زوج القطب الكهربي الثاني (الداخلي). ثم يتم احتساب معاوقه الكهربائية وفقا لقانون أوم. يتم تطبيع قيم TEER عن طريق ضرب المقاومة ومنطقه سطح طبقه الخلية وعاده ما يتم التعبير عنها باسم Ω- سم².

هناك أنظمه التي يتم ترتيب الخلايا والأقطاب الكهربائية بطريقه أكثر تطورا ، ولكن تستند أيضا علي مبدا قياس 4T ويمكن استخدامها مع نفس أجهزه القياس. أنظمه endohm ، علي سبيل المثال ، التي يتم ادراج عامل التصفية ، تحتوي علي غرفه وقبعة مع زوج من الأقطاب الكهربائية المتمركزة مع نفس بنيه القطب الكهربائي عود. شكل الأقطاب يسمح لتدفق الكثافة الحالية أكثر موحده عبر الغشاء ، التالي الحد من الاختلاف بين القراءات. حتى أكثر تعقيدا (ولكن أيضا أكثر دقه) هو غرفه Ussing ، حيث تفصل طبقه الخلية غرفتين مليئه بحل الرنين²². الغرفة نفسها يمكن ان تكون بالغاز مع الأكسجين ، CO₂، أو N₂، ويحركها أو تستكمل مع المواد التجريبية. كما يحدث النقل الأيوني عبر طبقه الخلية ، ويمكن قياس الفرق المحتملة من قبل اثنين من أقطاب الاستشعار عن بعد الجهد بالقرب من الانسجه. يتم إلغاء هذا الجهد من قبل اثنين من أقطاب تحمل الحالي وضعت بجانب طبقه الخلية. سيعطي ال يقاس تيار بعد ذلك الصافية أيون نقل والمقاومة [ترنسبيتليكل], اي يعكس حاجز نزاهة, يستطيع كنت حددت²². يمكن أيضا تطبيق قياس teer علي أنظمه الجسم علي رقاقه التي تمثل نماذج النسيج الحاجز^23,24. هذه النظم تحاكي في ظروف الجسم العام للخلايا وغالبا ما تتكون من عده أنواع من الخلايا ، مكدسه فوق بعضها البعض في طبقات.

يشرح البروتوكول التالي كيفيه اعداد فولتاممتر فعاله من حيث التكلفة وموثوق بها مع تردد المخرجات القابلة للبرمجة التي لا تنتج اي فروق ذات دلاله احصائيه في TEER مقارنه بانظمه القياس المتاحة تجاريا.

1. الجمعية الاساسيه فولت--amperemeter لقياس TEER

1. اعداد شاحن USB القياسية كما 5 فولت العاصمة إمدادات الطاقة ، والحبل تمديد USB ، متحكم التي سيتم استخدامها كمولد موجه مربعه للبرمجة ، واثنين من المقاييس القياسية التي هي قادره علي قياس التيار المتناوب والجهد والجذر يعني مربع ( صحيح-RMS) ، وأربعه كابلات مع المقابس الموز ، وسلك تمديد الهاتف مع موصل الإناث RJ14 بما في ذلك سته دبابيس مع السلكية الاربعه الداخلية (6P4C) ، واثنين من الكابلات القصيرة ، محطه لمعان ، 120 kΩ قبل المقاوم ، أسلاك نهاية اللحامات ، والعروات حام. الاداات المطلوبة هي متجرد العزل ، أداه العقص ، وحام الحديد.
2. أولا ، قم بتوصيل ملحق USB إلى لوحه متحكم.
3. تجريد نهاية العزل من اثنين من الكابلات القصيرة. جندي جانب واحد لكل كابل اما مباشره إلى دبابيس 0 و 2 من متحكم أو لحام lugs ، والذي بدوره يتم قص علي دبابيس منها. تجعيد الطرفين الآخرين إلى نهاية سلك القواعد وربطها إلى محطه بريق كما هو مبين في الشكل 1.
4. اربط مقابس الموز بالأمتار المتعددة. قطاع وتجعيد الطرف الآخر من كل من الكابلات الاربعه.
5. قطع سلك تمديد الهاتف في قطعتين وتفكيك وتجعيد الموصلات من الجانب الذي يحتوي علي موصل الإناث. تحقق من استمرارية الموصلات والدبابيس.
6. سيتم استخدام المتعدد الأول لقياس الحالية في μA (لاحظ ان وضع AC يجب ان يتم تعيين بوضوح). توصيله في سلسله مع 120 kω قبل المقاوم لدبابيس خمسه وسته من موصل RJ14 ، المقابلة لزوج القطب الخارجي من القطب عود.
7. وأخيرا ، ربط المتعدد الثاني ، والتي سيتم استخدامها لقياس انخفاض الجهد transepithelial في mV ، عن طريق محطه لمعان دبابيس ثلاثه وأربعه من موصل RJ14 ، المقابلة لزوج القطب الداخلي من القطب الكهربائي عود.
8. إذا رغبت في ذلك ، قم بتركيب التثبيت في هيكل.

2. برمجه متحكم

1. تعديل التعليمات البرمجية المصدر المتوفرة (ملف الترميز الإضافي 1) حسب الحاجة. في الشكل المعطي ، سيتم تبديل الدبابيس 0 و 2 بين الأرض و + 5 V مع 40 مللي ثانيه من التذبذب. وهكذا ، سيتم إنشاء اشاره موجه مربعه مع سعة 5 فولت وتردد حوالي 12.5 هرتز. قد تختلف القيم الحقيقية بسبب عدم دقه باعث الوقت متحكم.
2. قم بتوصيل وحده التحكم الصغيرة بكمبيوتر سطح المكتب عبر منفذ USB وارفع الشفرة المصدرية باستخدام البرامج المتطابقة²⁵.

3. تسجيل الذبذبات الجهد (اختياري)

1. تجاوز دبابيس خمسه وسته من موصل RJ14 مع 1 kΩ اختبار المقاوم والاتصال إلى الذبذبات.
2. تحقق من التردد ، والجهد الذروة ، والموجي. ترقيم وتصدير البيانات.
3. إذا رغبت في ذلك ، سجل الذبذبات من جهاز مرجعي (EVOM) والذاتي تجميعها voltammeter للمقارنة.
   ملاحظه: في هذه الحالة ، تم تسجيل البيانات مع نطاق التخزين الرقمي HM 208. كونه الذبذبات الرقمية الاساسيه جدا ، يمكن ان تكون الصورة رقميا (المجمدة) ولكن كان لا بد من رسمها باستخدام التناظرية PM 8143 مسجل X-Y. تم مسح الصورة بعد ذلك.

4. زراعه الخلايا وقياس TEER

1. البذور الإنسان المشيميه الضفيرة الخلايا الخيطية (هيبب) علي ادراج مرشح الثقافة الخلية مع حجم المسام من 3 ميكرومتر في DMEM/F12 (انظر جدول المواد) التي تحتوي علي 10 ٪ الجنين الساق المصل⁹. تنمو الخلايا عند 37 درجه مئوية في جو مشبع بالماء يحتوي علي 5% CO₂ كما هو موصوف من قبل العشاء وآخرون⁹.
2. عندما تصل الفلاتر إلى مقاومه من 70 Ω-سم²، تغيير إلى dmem/F12 خاليه من المصل وتحديد الوقت كيوم 0.
3. قم بتوصيل القطب الكهربي بمنفذ RJ14 لجهاز القياس الذاتي التجميع والتوصيل بمصدر طاقة USB. تعيين العدادات المتعددة لوضع التيار المتردد (mV) والوضع الحالي AC (μA) ، علي التوالي.
   1. وبدلا من ذلك ، قم بتوصيل القطب الكهربي بجهاز مرجعي متاح تجاريا وقم بتشغيله وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
4. تعقيم القطب الكهربائي في 80 ٪ الايثانول لمده 10 دقيقه وتتوازن في الوسط المناسب لمده 10 دقيقه أخرى.
5. ضع القطب الكهربي في كلا الجزءين الخاصين بنظام الفلتر الخاص بالخلايا التي تحتوي علي المرشحات (وهي الأجزاء الأطول من القطب في المقصورة السفلي والجزء الأقصر في المقصورة العلوية) الذي يحتوي علي طبقه خلايا الهيب حتى تظل قيم القياس ثابته.
6. لجهاز مرجعي ، لاحظ معاوقه مباشره أو حساب معاوقه وفقا لقانون أوم (R = U/I) ل voltammeter الذاتي تجميعها. انتبه إلى ان زاوية القطب الكهربي تؤثر علي القياسات.
7. كرر قياس TEER (الخطوات من 3 − 6) من اليوم 0 حتى اليوم الرابع.

ولمقارنه عمليه القياس الذاتي التجميع مع نظيره المتاح تجاريا ، سجلت الذبذبات الكهربية لكلا الجهازين.

وكما هو مبين في الشكل 2(ا) ، فان الاداه المرجعية ولدت اشاره موجية مربعه بسعة 80 mV وزمن تذبذب 80 مللي ثانيه ، وهو ما يقابل تردد 12.5 هرتز ، عند التشغيل علي الحمولة مع المقاوم للاختبار 1 kω.

في المقابل ، المتحكم في الجهاز الذاتي تجميعها تحول الجهد العرض إلى اشاره موجه مربعه مع سعة 5 فولت (الشكل 2ب) إذا لم يتم تعيين ما قبل المقاوم في. وأصبح من الواضح ان الناتج الحالي يدمر اي وظيفة حاجز ولا ينطبق علي تجارب ثقافة الخلية (البيانات غير معروضه). وهناك مساله أخرى هي ان, في هذا الاعداد 1 kΩ اختبار المقاوم تسبب الزائد مع انخفاض الناتجة من الجهد (الشكل 2ب). بالاضافه إلى ذلك ، كان وقت التذبذب الفعال لوحده التحكم الصغيرة 60 مللي ثانيه (تردد = 16.7 هرتز) التالي اختلفت عن وقت التاخير المبرمج بسبب عدم دقه باعث الوقت. إذا تم تثبيت 120 kΩ التجريبي ، فان السعه انخفضت إلى قيمه 40 mV ، والتي كانت مناسبه للثقافة الخلية (الشكل 2ج). وكما يتبين من الذبذبات ، فان نسبه الاشاره إلى الضوضاء كانت ضعيفه إلى حد كبير (الشكل 2 ج) ولكنها لم تؤثر علي القياسات بشكل ملحوظ.

وقد استخدم كلا الجهازين لتحديد معاوقه حاجز السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (مخطط الدائرة المبسطة المبين في الشكل 2د). زرعت خلايا هيفتب علي ادراج فلتر الخلايا الخلوية وتم قياس TEER علي مدي 6 أيام: بدءا من يوم واحد قبل نقل الخلايا إلى الظروف الخالية من المصل (يوم-1) وحتى 4 أيام بعد تغيير المتوسط (اليوم 4). وقد أجريت جميع القياسات في كوادروبليكاتيس باستخدام أربعه مرشحات من العوامل التي أعدت بنفس الطريقة. وتم الحصول علي قيم مماثله للصك المرجعي والمقياس الذاتي التجميع (الشكل 3). وكانت القياسات قابله للتكرار ، وكانت الانحرافات المعيارية داخل نفس النطاق. تراوحت قيم TEER بين 20 − 550 Ω- سم². باستخدام 0.33 سم² مرشحات ، وهذا يعادل مقاومه مطلقه من 83 − 1660 Ω.

الشكل 1: مخطط الرسم التخطيطي لمقياس الجهد الكهربي الأساسي لقياس TEER. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الذبذبات واعداد القياس. (ا) evom المتاحة تجاريا. (B) الذاتي تجميعها voltammeter دون قبل المقاوم. (C) الذاتي تجميعها فولتاممتر مع 120 kω قبل المقاوم. (د) مخطط الدائرة لاعداد القياس. لاحظ ان_القطب الكهربي C يظهر فقط في الدوائر الكهربائية عند استخدام الانظمه ثنائيه القطب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: قياسات TEER لطبقات خلايا الهيب في ادراج فلتر ثقافة الخلية قبل التحول إلى وسط الثقافة الخالية من المصل (اليوم-1) ، في يوم التحول (اليوم 0) ، وحتى 4 أيام بعد (الأيام 1 − 4). تشير أشرطه الخطا إلى الانحراف المعياري لعوامل التصفية الاربعه التي تم اعدادها بنفس الطريقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

ملف الترميز التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. 

ملف الترميز التكميلي 2. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. 

ملف الترميز التكميلي 3. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. 

قبل الذاتي--صنع فولتاممتر يمكن استخدامها في روتين يومي ، فمن الضروري للتحقق من الجهاز لوظيفة سليمه. في حالتنا ، تم برمجه نصف الوقت من التذبذب من 40 مللي ثانيه (12.5 هرتز) ، ولكن الوقت التذبذب الفعال تبين ان 60 مللي ثانيه (16.7 هرتز). لم يكن لهذا الدقة من باعث الوقت المتحكم الدقيق اي تاثير يمكن اكتشافه علي قياسات TEER. قد يكون من الأفضل تحديد التردد الفعلي باستخدام اعداد التردد لأحد العدادات المتعددة. إذا تم العثور علي اي انحراف ، يمكن تعديل التعليمات البرمجية المصدر وفقا لذلك. علاوة علي ذلك ، ينصح بشده للتحقق ما إذا كان اختبار المقاوم أو غيرها من الاجهزه المحددة تعطي نتائج صحيحه وقابله للتكرار. إذا كان العمل مع أنظمه الحاجز الخلوي الاصطناعي ، قد يكون من الأفضل دائما ربط تدفق الجزيئات مع قياس المقاومة.

في هذه الحالة ، كان التيار المطبق محدودا باستخدام 120 kΩ قبل المقاوم. علي افتراض ان القيم TEER النموذجية تتراوح من 100 Ω − 2000 Ω ، يمكن حساب انخفاض الجهد عبر طبقه الخلية لتكون 4 − 83 mV. تم محاكاة TEER من 1 kΩ من قبل المقاوم اختبار وأكد انخفاض المحتملة الناتجة لتكون 40 mV (الشكل 2ج).

الاجهزه المتاحة تجاريا غالبا ما توفر التبديل نطاق القياس للتبديل ما قبل المقاوم ، التالي الحد من الإنتاج الحالي إلى قيم مختلفه. في هذه الحالة ، فمن الممكن لتثبيت مختلفه قبل المقاومات أو حتى استبدال المقاوم مع الجهد.

يمثل الاعداد المعروض بديلا فعالا من حيث التكلفة للأدوات المتاحة تجاريا لقياس TEER. كانت القيم التي تم قياسها مع فولتاممتر ذاتية التجميع مماثله للجهاز المرجعي علي نطاق واسع. وينطبق نفس الشيء علي الانحرافات المعيارية. ولم تؤثر الضوضاء في اشاره الموجه المربعة علي القياسات علي وجه الخصوص. ويمكن للبروتوكول ان يدعم العلماء المقيدين بموارد مالية محدوده أو الذين يرغبون في اجراء تجارب أوليه بتكاليف منخفضه.

وعلاوة علي ذلك ، يمكن برمجه متحكم بسهوله إلى ترددات إخراج مختلفه. قد يكون هذا مفيدا ، حيث ان المقاومة الظاهرة تتكون من R_{المتوسطة}، r_teer، فضلا عن القدرة C_{خليه طبقه}²⁶ (الشكل 2د). بالاضافه إلى ذلك ، يظهر C_{الالكترود} إذا تم استخدام الانظمه ثنائيه القطب ، في حين يتم تقليل التاثير من مقاومه استقطاب القطب الكهربي في أنظمه تيترابولار. وهذا يعني ان المقاومة المقاسه ستهيمن عليها R_Teer عند ترددات منخفضه ، وفي النظم الثنائية القطب ، بقدره الأقطاب الكهربائية ، في حين ان الترددات العالية تقارب المقاومة الاجماليه للمقاومة المتوسطة^{26، 27}- وفي ما بينها ، تتاثر المقاومة_{بطبقه الخلية}C ، ولذلك يمكن الوصول اليها باستخدام الطيف الطيفي لمعاوقه الكهربائية²⁸.

ونحن نقدم اثنين (لم تختبر) رموز المثال لإعطاء فكره عن كيفيه الجهاز يمكن ان يكون الأمثل أو أعاده برمجتها للتطبيقات المختلفة. أولا ، يمكن تحقيق الطيف الطيفي معاوقه الاساسيه جدا بالتناوب علي تردد الإنتاج في فترات 20 ثانيه بين 12.5 ، 500 و 5000 هرتز (ملف الترميز التكميلي 2). في هذه الحالة ، يمكن استخدام تيترابولار^20،28 أو ثنائي القطب²⁷ قطب. يمكن ان يظهر تردد التطبيقية من قبل البناء في المتعدد (أو اي عرض أو الصمام متصلة متحكم). ثانيا ، يمكن استخدام الجهاز لقياس الموصليه المخازن المؤقتة والوسائط. ويتم ذلك عاده باستخدام أقطاب تيترابولار مع ترددات عاليه في مجموعه من 1-110kHz. التعليمات البرمجية في ملف الترميز التكميلي 3 يحتوي علي اي وقت تاخير و (مع جهازنا) ولدت تردد ما يقرب من 70kHz.

وليس لدي أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة أو اي تضارب في المصالح.

ويود المؤلفان ان يشكرا هيرمان ليغيماير ومارفن بن علي مشورتهما الفنية في التقنيات الكهربائية والمعلوماتية.