С помощью снайпера Cas9 для сведения к минимуму последствий пробить ТРИФОСФАТЫ Cas9 без потери на цель деятельности через направленной эволюции

Здесь мы представляем протокол для оптимизации ТРИФОСФАТЫ-Cas9 для достижения более высокой специфичности без потери на цель деятельности. Мы используем подход направленной эволюции называется Снайпер экран чтобы найти мутант Cas9 с желаемыми характеристиками. Снайпер-Cas9 совместим с усеченным сингл руководство РНК и доставки в формате рибонуклеопротеида известных стратегий для достижения выше особенностей.

Разработка кластерного регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ)-связанные белком 9 (Cas9) в терапевтических процедур требует избежания его потенциально вредное воздействие пробить. Несколько методов были разработаны для сокращения таких последствий. Здесь мы представляем Escherichia coli-на основе направленной эволюции метод называется Снайпер экран для получения Cas9 вариант с оптимизированной специфичность и сохранен на цели деятельности, называется Снайпер-Cas9. С помощью снайпера экрана, позитивные и негативные выбора могут выполняться одновременно. Экран также может быть повторен с других последовательностей РНК (sgRNA) одно руководство обогатить истинный положительный хитов. С помощью двойной промоутер ЦМВ-PltetO1 выразить Cas9 варианты, производительности пула библиотеки может быть быстро проверена в mammalian клетках. Описаны также методы для увеличения специфичности снайпер-Cas9. Во-первых использование усеченная sgRNAs ранее было показано для увеличения Cas9 специфичности. В отличие от других инженерных Cas9s снайпер-Cas9 сохраняет одичал тип (WT) уровня активности на цель при сочетании с усеченной sgRNAs. Во-вторых не влияя на цели деятельности, возможна доставка снайпер-Cas9 в формате рибонуклеопротеида (RNP) вместо формата плазмиды.

В этой статье мы стремимся улучшить специфику Cas9, объединяя различные стратегии. Были разработаны различные методы избежания последствий пробить ТРИФОСФАТЫ-Cas9. Например усеченной sgRNAs может использоваться для достижения более высокой специфичности¹. Кроме того метод доставки Cas9 можно изменить из формата плазмида RNP формат, чтобы получить выше специфика². Определенных аминокислотных остатков Streptococcus pyogenes Cas9 белка (SpCas9) были изменены согласно рациональной дизайн описанные ранее^3,4,5. Кроме того случайным образом были изменены аминокислотных остатков и Cas9 варианты с высокой точностью были определены с использованием дрожжей⁶ или^7, E. coli⁸ скрининг системы.

Однако многие группы сообщили, что Cas9 варианты инженерии с использованием дизайн для истощают неспецифического взаимодействия между Cas9 и субстрат экспонат низкого на цели деятельности^{7,8,9, 10 , 11 , 12}. Мы разработали E. coli-системы на базе направленной эволюции, Снайпер экран, экран случайно mutagenized Cas9 варианты. E. coli скрининг системы имеет преимущества над дрожжей системы из-за быстрее удвоение времени и выше преобразования эффективность E. coli.

Негативные и позитивные выбор, основанный на трех различных плазмидов и ген интереса (ГОИ) интегрированы в геном кишечной палочки используются в снайпер экране. Cas9 варианты выражаются в системе двойного промоутер ЦМВ-PltetO1 номер плазмида низким копия так что кандидатов, выявленных в E. coli может быть проверена в mammalian клетках без необходимости subcloning. ГОЙ вводится в геном кишечной палочки , с помощью системы transposon Tn7. Плазмида sgRNA, который содержит чувствительных к температуре происхождения репликации, выражает sgRNA ориентации ГОИ; Однако sgRNA и ГОИ последовательности не совпадают прекрасно. Идеально соответствует sgRNA целевой сайт существует на третьем плазмида, содержащие ccdB ген, который кодирует смертоносного продукта, который отравляет гиразы. В этой системе удаляются клетки, выражая Cas9 варианты с высокой-целевого мероприятия, поскольку двухнитевые разрывы (DSBs) вводятся в несоответствующие сайт, расположенный в геномной ДНК. С другой стороны клетки, выражая Cas9 варианты с низким на целевые мероприятия также удаляются из-за смертельной ccdB экспрессии генов. Уровень экспрессии Cas9 вариантов можно изменить путем изменения концентрации anhydrotetracycline (УВД), которая регулирует силу отбора.

Мы полагали, что поиск несоответствующих sgRNA целевой сайт в геномной ДНК, а не на плазмида повысит чувствительность системы. Преимуществом этого подхода является что существует только один геномной сайт, тогда как бы много плазмид, каждый из которых содержит целевого сайта, в одной ячейке E. coli .

Используя эту систему, мы определили Cas9 вариант, Снайпер-Cas9, который показывает WT-уровня на цели деятельности и сокращение-целевого мероприятия, по сравнению с WT Cas9. Снайпер-Cas9 можно добиться даже выше специфика соотношения с помощью усеченная sgRNAs или доставки на основе RNP вместо доставки на основе плазмид.

1. Интеграция человека ГОЙ в штамм E. coli BW25141

1. Клонирование ГОИ
   1. Полимеразной цепной реакции (ПЦР) усиливают длиной 500 bp человека ГОИ , содержащих различные сайты целевой кандидата через стандартные методы PCR с праймерами, содержащих Ноти и XhoI энзима ограничения сайтов.
      Примечание: В этом эксперименте, ГОИ был человеческого гена EMX1 .
   2. Дайджест продукт PCR и pgrg36¹³ вектор с энзимами ограничения Ноти и XhoI.
   3. Гель Очистить желаемого фрагменты (500 bp и 12 КБ).
   4. Перевязать фрагменты, вместе с помощью лигаза T4. Для этого смешайте 50 нг усваивается pgrg36 и 6 ng вставки PCR в реакции объем 20 мкл, содержащие 1 x лигаза буфер и 0,5 U лигаза фермента. Инкубируйте на ночь при комнатной температуре (RT).
   5. Превратите перевязаны плазмида DH5-α-компетентных клеток. Расти в результате трансформантов на плиты агара Лурия бульон (LB), содержащий ампициллина (100 мкг/мл) при температуре 32 ° C и инкубировать на ночь. Подобрать колонии и вырастить его в средствах массовой информации LB, содержащий ампициллина на ночь. Изолируйте плазмидной ДНК от кишечной палочки, использование коммерчески доступных алкалический Kit. Подтвердите вставки фрагмента ГОИ Сэнгером секвенирования плазмида, полученные от мини-плазмида подготовки (мини-prep)¹³.
2. Подготовка BW25141 -ГОИ
   1. Преобразуйте полученные pgrg36 -ГОИ плазмида в штамм E. coli BW25141. Важно использовать штамм BW25141 для того, чтобы свести к минимуму число ложных положительных колоний.
   2. Растут в трансформированных клеток в буфере фунтов на 32 ° C на ночь. ГОЙ вставляется в геномной ДНК штамма BW25141 (BW25141 -ГОИ). Удаление плазмидаГОЙ pgrg36 - из штамма BW25141 -ГОИ , используя стандартные pgrg36 протокол¹³. Кратко, разбавить колонии (приблизительно 10⁷-фолд) и вырастить его на плите фунтов при 42 ° C ночь. Полоска колоний на пластину LB и расти их при 42 ° C на ночь.
   3. Подтвердите правильность подсоединения ГОИ колонии PCR, используя праймеры, предложил в протоколе pgrg36: 5'-GATGCTGGTGGCGAAGCTGT-3 "и 5'-GATGACGGTTTGTCACATGGA-3». Грунтовка усиливает геномной ДНК вставки сайте, и размер конечного продукта PCR будет 904 bp плюс размер вставки (500 bp в данном случае).
   4. Подготовка electrocompetent BW25141 -ГОИ клетки (подробный протокол описан в 3.2.6–3.2.10 шаги).

2. Подготовка вариант библиотеки Cas9

1. Подготовка библиотеки
   1. Преобразование векторных Cas9⁷ в коммерческих E. coli мутатора штамм (Таблица материалов) и следуйте инструкциям производителя, чтобы получить вариант Библиотека (коммутатор).
   2. Выполните ошибкам ПЦР на всей последовательности WT Cas9 в Cas9 vector, используя набор ошибок ПЦР (Таблица материалов).
      Примечание: Низкий-погрешность протокол был принят в случае снайпер-Cas9 во избежание подрыва оригинальной функции белка.
   3. Дайджест Cas9 вектор с соответствующим энзимами ограничения. Гель очистить продукт PCR (из шага 2.1.2) и переваривается позвоночника.
      Примечание: Размер SpCas9 гена составляет около 4.3 КБ. XhoI и KpnI были выбраны переваривать вектор pBLC-SpCas9, который был использован в случае снайпер-Cas9.
   4. Соберите костяк фрагмента (из шага 2.1.3) и вставка, усиливаются с помощью ошибкам ПЦР (из шага 2.1.3) через изотермический в vitro рекомбинации.
      Примечание: более 500 нг позвоночника необходимо получить высокую концентрацию библиотеки (библиотека ошибкам PCR [EP]). Два различных ошибок наборы PCR были использованы для подготовки EP библиотек в случае снайпер-Cas9 (EP библиотека I и II).
   5. Очистить товары из Ассамблеи (от шага 2.1.4) с помощью ДНК очистка kit, который позволяет низким объемом элюции (Таблица материалов). Элюировать с 6 мкл нуклеиназы свободной воды (НЗФ) и измерения концентрации ДНК.
   6. Преобразование более чем 500 ng вектора Cas9 библиотеки (для каждого из трех библиотек) в 50 мкл клеток E. coli electrocompetent (Таблица материалов). Смотреть протокол электропорации в 3.2.1-3.2.4 шаги. Для подготовки этой библиотеки используйте 1 мл SOC среды вместо 250 мкл 50 мкл компетентных клеток.
   7. Сделать масштаба 1: 100, 1:1, 000 и мэм разведения смеси, содержащей восстановленные клетки с SOC среднего. Пластина разреженных клетки на 100 мм LB плиты агара дополнена Хлорамфеникол (12,5 мкг/мл). Пластина оставшиеся ячейки на плите² 245 мм. Инкубируйте при 37 ° C на ночь.
2. Расчет библиотека сложности
   1. Фотография пластины разрежения через систему документации гель или обычный цифровой фотоаппарат. Запуск программного обеспечения OpenCFU¹⁴ и загрузить фотографии разбавления пластин. Установите подсчета область внутри тарелку и удалить ложные колоний.
   2. Вручную умножьте количество колоний на коэффициент разбавления, чтобы получить оригинальный номер трансформантов. Преобразуйте эти цифры в логарифмической форме (основание 10). Вычисление среднего значения для определения сложности библиотеки.
   3. Когда значение требуемой сложности получается, собрать всех колоний на пластину площадь 245 мм (от шага 2.1.7) с использованием разбрасывателя и 20 мл фунтов с хлорамфениколом. Не растут собрались колоний и очищения плазмиды библиотеки с использованием коммерческих midiprep комплекта.
      Примечание: Чем выше сложность Библиотека, тем лучше. Когда был определен снайпер-Cas9, разнообразие 3 х 10⁶ было достигнуто для каждой библиотеки.

3. положительные и отрицательные скрининга для эволюции Cas9

1. Выбор цели и плазмиды строительство
   1. Выберите целевой sgRNA прокладку последовательность в ГОИ. Замените один или два остатков в случайных нуклеотидов производить несоответствие последовательности.
      Примечание: Человека EMX1 целевого сайта 3 (GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA с Пэм GGG) был использован в случае снайпер-Cas9. Объяснения являются несовпадающими последовательности, используемые: GAGTCCGAGCAGAAagAGAA, GAacCCGAGCAGAAGAAGAA, GAGTCCGAGCAGAgGAAGAA и GAGcCCGAGCAGAAGAAGAA.
   2. Вставьте несоответствие последовательности (см. шаг 3.1.1) в sgRNA плазмиду с использованием стандартных олигонуклеотида (oligo) клонирования процедуры⁷.
   3. Вставьте несоответствие последовательность с PAM в конце 3' p11-Лейси wtx1 (Таблица материалов) для построения с помощью стандартных oligo клонирования процедуры¹⁵плазмида ccdB .
2. Подготовка компетентных клеток снайпер скрининг E. coli
   1. Потепление BW25141 -ГОЙ electrocompetent клеток на льду.
   2. Добавить 1 нг плазмида ccdB и sgRNA плазмиду с двойной несоответствия в 50 мкл талой BW25141 -ГОИ клеток. Аккуратно перемешать клетки, закупорить и переместить их в кювет электропорации prechilled 0,1 см.
   3. Преобразуйте E. coli с двумя плазмид через электропорации. Добавьте 250 мкл SOC среды сразу же после электропорации. Аккуратно Пипетка решение сочетание клетки и среды. Передача смеси пробки microcentrifuge 1,5 мл.
      Примечание: Для достижения максимальной эффективности, установите напряжение на 1,80 кв и среда выполнения должна быть между 4.8 МС и 5.0 мс.
   4. Восстановление трансформированных клеток и инкубировать их в 32 ° C в течение 1 ч с нежным встряхивания.
   5. Пластина 125 мкл восстановленные клеток на ампициллин (50 мкг/мл) / канамицин (25 мкг/мл) LB агар пластины (культура условие). Пластина остальные клетки на ампициллин/канамицин/арабинозы (1,5 мг/мл) плита агара фунтов (ccdB-выражая условие). Инкубируйте на 32 ° C на ночь.
   6. Проверка на отсутствие Выжившие колонии на ccdB-выражая условие пластины. Соберите колоний от культуры состояния пластины с помощью спредера и культуры их в 250 мл среды супер оптимального бульон (SOB), дополнены 50 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицин на 32 ° C, с нежной встряхивания.
   7. Когда оптической плотности на 600 Нм (₆₀₀OD) достигает 0.4, холод колбу на льду. Подготовка prechilled деионизированную воду и раствор prechilled 10% глицерина (стерилизовать перед использованием).
   8. Центрифуга (на 4000 x g 5 минут при температуре 4 ° C) клетки и удалить супернатант. Добавьте 200 мл prechilled деионизованной воды. Ресуспензируйте клетки с помощью Пипетки серологические 10 мл. Повторите этот шаг 3 x.
   9. Вымойте клетки с 50 мл раствора prechilled 10% глицерина. Центрифуга для них как раньше (на 4000 x g 5 минут при температуре 4 ° C).
   10. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 300 мкл 10% раствором глицерина. Сделать 50 мкл аликвоты и заморозить их в жидком азоте. Хранить клетки (снайпер скрининг)-80 ° c.
3. Снайпер скрининг
   1. Трансформировать клетки снайпер скрининг (от шага 3.2.10) с 100 нг вариант плазмид Cas9 от каждой библиотеки (с шагом 2.2.3.See шаги 2.1.1 и 2.1.4). Следуйте указаниям электропорация, описанные в шагах 3.2.1–3.2.3.
   2. Передать 250 мкл клетки пробки microcentrifuge свежие 1,5 мл. Добавление УВД сделать окончательный концентрацию 10 нг/мл, 250 стр. Восстановите как ATC-содержащих и ATC-свободной клетки (см. шаг 3.2.4 для этапа восстановления).
   3. Тарелка 25 мкл восстановленные ATC-свободных клеток на плите агар хлорамфеникол/канамицин фунтов (неселективных условие). Добавление УВД восстановленные ATC-содержащих клеток, чтобы сделать окончательный концентрации 100 нг/мл на плиту LB 245 мм. Сразу же пластины клетки на хлорамфеникол/канамицин/арабинозы плиту LB агар (селективный условие). Инкубируйте на ночь на 32 ° C.
      Примечание: Размер и количество фунтов плиты определяется размером разнообразия крышек скрининга. В случае 100 мм Петри с 20 мл LB добавьте 2 мкг УВД.
   4. Фотография пластины. Подсчитать количество жизнеспособных колоний, с использованием программного обеспечения OpenCFU¹⁴. (См. шаг 2.2.1) Убедитесь, что количество колоний на пластину неселективных по крайней мере 10 x больше разнообразия в библиотеку, чтобы охватить все варианты.
   5. Рассчитайте частоту выживания следующим образом.
      Выживание частота = количество колоний на выборочной плита / (количество колоний на неселективных плите x 10)
   6. Бильярд колоний, которые сохранились на избирательное пластины из всех трех библиотек. Инкубируйте Выжившие колонии в 250 мл LB среды дополняется 12,5 мкг/мл хлорамфеникол при 42 ° C на ночь. Изолируйте экранированной Cas9 библиотеки ДНК с помощью комплекта midiprep.
      Примечание: Этот шаг очищает sgRNA плазмиды.
   7. Повторите процесс отбора от 3.3.1–3.3.6 шаги до тех пор, пока частота выживания достигает плато. Использование 10 нг выбранного плазмида Cas9 для преобразования и 10 нг/мл УВД во время восстановления. Поддерживать концентрацию УВД на 100 нг/мл для селективного состояния.
4. Тасование и второй скрининг
   1. Перемешивание выбранного пула варианты, используя следующий протокол Перетасовка ДНК. PCR усиливает Cas9 вставить в Cas9 плазмиду с помощью фланкируя грунтовки, 150 нуклеотидов от границ, вставка. Дайджест 2 мкг усиливается ПЦР продукта с DNase I 1 мин при 37 ° C.
   2. Очищайте фрагменты 70 – 200 bp в длину, с использованием 2% геля агарозы. PCR усиливает очищенный фрагментов. Использование продукта как шаблон для ПЦР усиливают Cas9 вставка с соответствующей грунтовки, фланкируя Cas9. Используйте конечный продукт PCR построить библиотеку Cas9, как описано в шаге 2.1.4.
   3. Подготовить новые снайпер скрининг клетки (см. раздел 3.2) с другой несоответствие sgRNA плазмиды (см. шаг 3.1.1). Повторить процесс отбора (разделы 3.2-3.3) до выживания ставка достигает плато. Использование 10 нг выбранного плазмида Cas9 для преобразования и 10 нг/мл УВД во время восстановления. Поддерживать концентрацию УВД на 10 нг/мл для селективного состояния.
5. Выбор развивались Cas9 мутант плазмиды
   1. После последнего шага скрининга случайным образом выбрать сто колоний от селективного пластины и культура их в хлорамфеникол содержащих LB среде при 42 ° C на ночь.
   2. Изолируйте с помощью процедуры алкалический и Сэнгер последовательности вставки с помощью последовательности грунтовки в течение Cas9 плазмид.
   3. Выберите Топ три наиболее частых вариантов для их проверки в линий клеток человека.

4. Доставка Cas9 как RNP с усеченной sgRNA

1. Выбор цели гена с помощью Cas-OFFinder
   1. Выбор целевых сайтов с Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Выберите подходящие для конкретного типа Cas9 и геном целевой тип PAM (человека, мышь, данио рерио, и т.д.). Заполните в закладке последовательности запроса , выбрать несоответствие номери нажмите кнопку Отправить .
   2. После того, как несколько секунд, на цели (с '0', количество и несоответствия) и мимо сайты будут отображаться. В общем выбор мимо сайтов с одного до трех несоответствия.
2. Подготовка шаблона sgRNA
   1. Заказать crRNA и tracrRNA oligos с следующие шаблон последовательности, а именно crRNA последовательность: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAA-3'; tracrRNA последовательность: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'. Заполните crRNA последовательности с последовательности целевых объектов, полученный на шаге 4.1.2 N20. Для разработки усеченная sgRNAs, удалите баз из 5' конца для получения последовательности sgRNA N19, N18 или N17.
   2. Подготовьте смесь ПЦР для усиления последовательности кодирования sgRNA следующим образом: объединить 10 мкл 5 x буфер, 0.5 мкл crRNA oligo (100 пмоль/мкл), 0.5 мкл tracrRNA oligo (100 пмоль/мкл), 2,5 мкл дНТФ (по 10 мм), 0.5 мкл ДНК полимеразы и 36 мкл НЗФ (таблица материалов).
   3. Усилить шаблон с помощью следующих условий, а именно, для первоначального денатурации: 1 мин на 98 ° C; для денатурации, отжиг и расширение: 10 s на 98 ° C, 15 s на 54 ° C, 20 s при 72 ° C, для 25 циклов; для окончательного расширения: 5 мин при 72 ° C.
   4. Анализ 2 мкл усиливается шаблона ДНК (от шага 4.2.3) на 2% гель агарозы. Очищайте шаблон, используя комплект для очистки ПЦР.
      Примечание: Размер шаблона ДНК-125 bp.
3. Синтез sgRNA
   1. Подготовьте смесь реакции синтеза sgRNA следующим: объединить 8.5 мкл шаблона ДНК (от шага 4.2.3), 1 мкл UTP (25 мм), 1 мкл CTP (25 мм), 1 мкл GTP (25 мм), 1 мкл АТФ (25 мм), 4.2 мкл MgCl₂ (100 мм) , 4.5 мкл T7 РНК-полимеразы (50 U/мкл), 3 мкл 10 буфера x T7 РНК-полимеразы, 1.2 мкл пирофосфатаза (0,5 U/мкл), 0,75 мкл АБС битор РНКазы (40 U/мкл) и 4.2 мкл НЗФ.
   2. Инкубировать реакционной смеси при 37 ° C ночь (по крайней мере за 10 h). Добавить 0,5 мкл DNase (2 U/мкл) в реакционной смеси и инкубировать при 37 ° C на 15 – 30 мин очистить sgRNA, используя комплект для очистки РНК.
   3. Чтобы уменьшить токсичность, вызванные врожденной иммунной реакции, вызванные 5'-трифосфата на sgRNA¹⁶, удалите 5'-трифосфата из руководства РНК с икры кишечной щелочной фосфатазы (CIP) следующим образом: лечить 10 мкг в vitro- транскрипции РНК с 250 U CIP 3 часа при 37 ° C в присутствии 100 U РНКазы ингибитора. Очистки CIP-лечение sgRNA, используя комплект для очистки РНК.

5. выражение протеина WT - и снайпер-Cas9 и очистки

1. Выражение протеина в E. coli
   1. Трансформировать животных плазмид¹⁸ кодирования его меткой WT - и снайпер-Cas9 в BL21 штамм E. coli (DE3).
   2. Прививать 50 мл LB среде, содержащей 50 мкг/мл канамицин с свежий колонии, укрывательство ПЭТ Cas9 выражение плазмиды и встряхните его на ночь (200 об/мин) при 37 ° C (preculture).
   3. Передача 10 мл на ночь культуры до 500 мл свежего LB среды, содержащей 50 мкг/мл канамицин. Инкубируйте культуры встряхивании (200 об/мин) при 37 ° C на 2 ч.
   4. Контролировать ОД₆₀₀ , до тех пор, пока культура достигает середины журнала фазе роста (OD ≈₆₀₀ 0,6-0,7).
   5. Побудить выражения протеина WT - или снайпер-Cas9 с изопропиловым β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ, в конечной концентрации 0.25 Нм). Инкубируйте культуры при 18 ° C на ночь.
2. Очистка белков
   1. Урожай клетки центрифугированием в 5000 x g 10 мин при 4 ° C.
   2. Ресуспензируйте гранулы литического буфера (50 мм NaH₂PO₄, 300 мм NaCl, имидазола 10 мм, 4 мм Дитиотреитол [DTT], benzamidine 5 мм, 100 мм phenylmethylsulfonyl фторид [PMSF], рН 8) в 20 мл на грамм живого веса.
   3. Добавить PMSF, DTT и лизоцима в конечной концентрации 1 мг/мл и инкубировать смесь на льду за 30 мин.
   4. Sonicate клетки на льду. Пульс неоднократно для 10 s на 200 – 300 W с 10 s, охлаждение период между каждого импульса, общее время 20 мин.
   5. Центрифуга lysate на 6000 x г за 30 мин при 4 ° C.
   6. Удалите супернатант в свежий трубку. Добавить 1 мл раствора смолы агарозы его-Bind до 5 мл очищены lysate и поколебать мягко в течение 1 ч при 4 ° C.
   7. Загрузите смесь смолы агарозы lysate/его-Bind на столбец с розеткой ограничен снизу.
   8. Снимите нижнюю крышку и собирать проточный столбца.
   9. Промойте колонку 2 x с мыть буфера (50 мм NaH₂PO₄, 300 мм NaCl, 20 мм имидазола, рН 8); Соберите мыть дроби для анализа натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE).
   10. Элюировать белков 10 x с 1 мл раствора Элюирующий буфер (50 мм NaH₂PO₄, 300 мм NaCl, 250 мм имидазола, рН 8), сбор образцов для SDS-PAGE.
   11. Концентрат белка eluted WT - или снайпер-Cas9, с помощью фильтра столбца 100 кДа. Хранение образцов в растворе трис-HCl, 150 мм NaCl и 50% глицерина 10 мм-80 ° c.

6. RNP доставки

1. Трансфекция и подготовка клеток для доставки RNP
   1. Сохранить HEK293T клетки в Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% антибиотиков при 37 ° C с 5% CO₂.
   2. Смешать WT - или снайпер-Cas9 белка (2 мкг) с sgRNA (2 мкг) и проинкубируйте втечение 10 мин на RT сделать RNP комплексов.
   3. Trypsinize и подсчитать количество ячеек. Готовить 2 х 10⁴ ячеек на одну реакцию. Вымойте клетки с фосфат амортизированное saline (PBS) и центрифуги. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте лепешка с электропорации буфера.
   4. Electroporate RNP комплексов в клетки, используя следующие параметры, а именно: 1300 V, 30 мс и один пульс. Плита клетки на тарелку, 48-а заполнены с 500 мкл DMEM, дополненная FBS и антибиотики (как описано в шаге 6.1.1) сразу после электропорации. Инкубируйте при 37 ° C с 5% CO₂.
   5. Изолируйте геномной ДНК с комплектом подготовки геномная ДНК, 48 ч после transfection.

7. transfection плазмид кодирования снайпер-Cas9 и sgRNA

1. Строительство sgRNA плазмиды
   1. Заказать вперед и обратить вспять oligos с следующий шаблон последовательности, а именно вперед: 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'; обратный: 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'. Замените N20 последовательности целевых объектов, полученный на шаге 4.1.2. Укоротите последовательности длиной N19, N18 или N17 синтезировать усеченная sgRNA.
   2. Отжиг оба oligos в 1 x T4 ДНК лигаза буфера.
   3. Дайджест pRG2 вектор с BsaI энзима ограничения.
   4. Гель Очистить переваривается вектор (3300 bp) с использованием геля агарозы 0,8%.
   5. Перевязать отожженная oligo и очищенный фрагмент с помощью лигаза T4 в 37 ° C: микс 50 ng усваивается pRG2 и 1 нг отожженная oligo реакции объемом 20 мкл. Инкубируйте на RT на 15 мин.
   6. Преобразовать перешнуровки смесь в альфа-штамм DH5 и расти трансформантов на плиты агара LB, содержащий ампициллина (100 мкг/мл) при 37 ° C. Подтвердите включение oligo в векторе, стандартной виртуализации.
2. Трансфекция плазмид кодирования снайпер-Cas9 и sgRNA
   1. Сохранить HEK293T клетки в DMEM дополнена 10% FBS и 1% антибиотиков при 37 ° C с 5% CO₂. За день до трансфекции, trypsinize и подсчитать количество ячеек. При работе в масштабе 48-Ну, пластина 1 x 10⁵ клеток на скважину в 250 мкл полный рост средних. Клетки должна быть 50%-80% притока в день transfection.
   2. В 48-ну масштабе, подготовить 250 нг p3s-Cas9 плазмиды и 250 нг sgRNA плазмиду для transfection, используя реагент на основе липидов transfection. Смешайте плазмид в 25 мкл сыворотка бесплатно MEM.
   3. Разбавьте 1 мкл Реагента трансфекции с 25 мкл сыворотка бесплатно MEM. Инкубировать смеси на RT на 5 мин объединить две смеси и инкубировать и полученный раствор в РТ за 20 мин до формы плазмида lipofectamine комплексов.
   4. После 20 минут инкубации, добавьте 50 мкл раствора, содержащего плазмида трансфекции реагент комплексы непосредственно каждому хорошо содержащие клетки и смешайте нежно покачиваясь пластину взад и вперед. Инкубируйте клетки при 37 ° C в CO₂ инкубатора для 48-72 ч пост трансфекции перед опробование для выражения трансген.

8. Расчет indel частот для определения мероприятий на цель и мимо

1. Целевые глубокую последовательности для анализа на цель и потенциальных-цели сайты
   1. Изолируйте геномной ДНК из шага 6.1.5 или 7.2.4 с комплектом подготовки геномная ДНК. Создания глубокой последовательность библиотек по амплификации PCR геномная ДНК с праймерами, ориентации на целевые и пробить.
   2. Используйте индекс Праймеры для обозначения каждого образца. Подвергать пуле библиотек в паре конец последовательности с помощью машины секвенирование нового поколения.
2. Глубокая последовательности анализа с помощью Cas-анализатор
   1. Анализ данных глубокую виртуализации с помощью Cas-анализатор инструмент оценки¹⁷.
   2. Выберите файлы Fastq под вкладки Читать 1 и 2 чтение (чтение 1 = XX_SXX_L001_R1_001.fastq, читать 2 = XX_SXX_L001_R2_001.fastq).
   3. Заполните на вкладке Основная информация и закладке Параметры анализа нажмите кнопку Отправить .

После того, как выполняется снайпер экран, процент выживания колонии может быть рассчитана путем деления количества колоний на пластину LB, содержащие хлорамфеникол, канамицин, арабинозы и ATC (CKAA) на количество колоний в содержащих LB пластины Хлорамфеникол и канамицин только (CK). Этот процент был обычно очень низкий, когда снайпер экрана была выполнена с библиотеками SpCas9. True позитивных хитов можно обогатить, повторяя на экран с сохранившихся бассейн. В этот представитель снайпер экран например, 100% выживаемости был получен после третьего экрана (рис. 1). Transfections с помощью RNPs или плазмиды кодировке снайпер-Cas9 может быть сделано для различных целей и полученный на целевой и пробить деятельности измеряется целевых ампликон последовательности (рис. 2). В большинстве задач, Снайпер-Cas9 показывает тот же уровень на цель деятельности и выше специфика соотношения, по сравнению с не менее усеченный sgRNAs также может использоваться для дальнейшего повышения специфичности (рис. 3). Однако их использование ограничивается лишь несколько целей потому, что они приводят к низкой на цели деятельности по сравнению с полнометражные sgRNAs, в большинстве случаев. Поэтому sgRNAs с различной длины (от 17 - до 20-РВК) должен быть испытан и на цель и пробить деятельности должна быть измерена оптимизировать специфичности.

Рисунок 1: представитель снайпер экраны выполняются с различными библиотеками случайных вариантов Cas9. Мутатор Библиотека, EP я и EP библиотека II указывают библиотек с использованием различных коммерческих комплектов. Первый, второй и заключительный указывают количество раз на экране обогащение было выполнено⁷. Эта цифра была изменена от Lee et al.⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: на цель и пробить деятельности WT-Cas9 или снайпер-Cas9 в паре с 20-mer руководство последовательности через плазмиды или RNP. Специфика соотношения были определены путем деления на цели действия пробить. Планки погрешностей указывают SEM (n = 3)⁷. Эта цифра была изменена от Lee et al.⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: на цель и деятельность снайпер-Cas9 по сравнению с WT-Cas9, полученных с помощью sgRNAs с переменной длиной, ориентация на FANCF01 и AAVS сайты-целевого. Специфика соотношения были определены путем деления на соответствующих участках пробить indel частоты на целевые сайты. указаны sgRNAs с соответствием гуанина в отеле terminus 5' (GX18 или GX19) и те, с несоответствием гуанин (gX17, gX18, gX19 или gX20). Специфика соотношения не были рассчитаны при нормализованные целевые мероприятия были < 70%⁷. Эта цифра была изменена от Lee et al.⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Для тех, кто хочет избежать громоздких скрининг процедуры для получения снайпер-Cas9 снайпер-Cas9 белка и кодирования плазмида доступны. Используя эти материалы, оптимальная длина sgRNA, что высокий коэффициент специфичности, должны быть определены. Кроме того доставка снайпер-Cas9 и sgRNA в формате RNP рекомендуется, потому что это обычно приводит к более высоким соотношением специфика чем доставки в формате плазмиды. В отличие от снайпер-Cas9 другие инженерии Cas9 варианты не совместимы с усеченной sgRNAs^6,7 или доставки в RNP формы⁸ (за исключением HiFi-Cas9).

Для снайпера экрана выбор несоответствующих последовательности является наиболее важным шагом. Следует избегать выбор несоответствующих sgRNA, который связан с низким декольте активности к последовательности ГОИ . Если нет, то Cas9 варианты с уровнем WT специфики будет не прилепится геномной ДНК кишечной палочки с несовпадающими целевого сайта. Этот эффект приведет к большое количество колоний фон, ставя под угрозу весь досмотра.

Потому что E. coli имеет быстрый удвоение время и высокое преобразование эффективности по сравнению с дрожжей, Снайпер экран является выгодным по сравнению с методов отбора на основе дрожжей. Кроме того, Снайпер экран должен быть более чувствительны, чем другие E. coli-систем, в которых осуществляется несоответствие сайт на основе плазмида: существует одна копия геномной ДНК и, таким образом, только один копию несоответствие сайта в нашей системе, но большое количество плазмид в одной ячейке E. coli .

Особенности других эндонуклеазами ДНК, которые индуцируют DSBs, например SaCas9 или Cpf1s, также может быть улучшено с помощью снайпера экрана. К сожалению снайпер экран не может использоваться для увеличения специфичности базового редакторов напрямую, потому что базовый редакторы не вызвать DSBs в геномной ДНК кишечнойпалочки. Как базовый редакторы используют nickase или мертвых версии Cas9 в ядро их системы, особенности базового редакторов можно увеличить с помощью ответы, полученные от снайпер экрана.

ToolGen подал заявку на патент (PCT/KR2017/006212) охватывающих снайпер экран (статус: ожидание, изобретатель: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Юнг и Euihwan Jeong являются компании ToolGen, Inc.

Это исследование было поддержано грантов от министерства науки и ИКТ Кореи (2017M3A9B4061406) и национального исследования фонд из Кореи (NRF) финансируется корейским правительством (MSIT) (Грант номера 2017M3A9B4061404 и 2018M3A9H3020844) для Jungjoon K. Ли. Плазмиды, кодирование pGRG36 был подарок от Нэнси Крейг (Addgene плазмиды #16666) и p11-Лейси wtx1 был подарок от Хуэйминь Чжао.