Легочного ствола диапазонов модель давление перегрузки индуцированной гипертрофия правого желудочка и неудачи

Мы представляем хирургический метод побудить гипертрофия правого желудочка и неудачи в крыс.

Правого желудочка (RV) неудачи, вызванные постоянное давление перегрузки является крупный вклад в заболеваемость и смертность в нескольких кардиопульмональной расстройств. Надежных и воспроизводимых Животные модели разрушения RV поэтому оправданным с целью изучения механизмов болезни и последствия потенциальных терапевтических стратегий. Кольцевание легочного ствола является распространенным методом побудить изолированные RV гипертрофия, но в целом, ранее описанных моделей не добились успеха в создании стабильной модель RV гипертрофия и неудачи.

Мы представляем крысы модель давление перегрузки индуцированной RV гипертрофия вызванные легочного ствола диапазонов (ПТБ), который позволяет разные фенотипы RV гипертрофии с и без сбоя RV. Мы используем модифицированных ligating клип applier для сжатия титана зажим вокруг легочного ствола к заданному внутреннему диаметру. Мы используем различные клип диаметров побудить различные этапы прогрессирования заболевания мягкой гипертрофии RV неспособности декомпенсированного RV.

Гипертрофия RV развивается последовательно крыс подвергли процедуре ПТБ и в зависимости от диаметра прикладной диапазонов клип, мы можем точно воспроизвести различные болезни важностей от компенсируется гипертрофия до тяжелой декомпенсированного RV неудачи с экстра сердца проявлениях.

Представленная модель ПТБ является действительным и надежную модель давление перегрузки индуцированной RV гипертрофии и неудачи, которая имеет ряд преимуществ для других диапазонов моделей, включая высокую воспроизводимость и возможность заставить тяжелой и декомпенсированной RV недостаточности.

Правый желудочек (RV) могут адаптироваться к постоянно давление перегрузки. В время однако, приспособительных механизмов не для поддержания сердечного выброса, RV расширяет и в конечном итоге сбой RV. RV функция является основным прогностическим фактором нескольких кардиопульмональной расстройств, включая легочной артериальной гипертензии (ПАУ), тромбоэмболические легочной гипертензии (CTEPH) и различные формы пороки сердца с давлением (или объем) перегрузка из р.в. Несмотря на интенсивное лечение RV сбоя остается основной причиной смерти в этих условиях.

Вследствие уникального свойства^1,2 и эмбрионального развития³ р.в. знания, полученные от левой сердечной недостаточности нельзя просто экстраполировать на право сердечной недостаточности. Животные модели правой сердечной недостаточности поэтому необходимы для того, чтобы изучить механизмы отказа RV и потенциальных стратегий медикаментозное лечение.

Есть экспериментальные модели легочной гипертензии, индуцированных SU5416 в сочетании с гипоксией (SuHx)⁴ или monocrotaline (MCT)⁵, которые вызывают RV отказа вторичного заболевания в легких сосудистую. Эти модели используются для оценки терапевтические эффекты препаратов, предназначенных легочной сосудистую. Как SuHx, так и модель MCT являются модели-Исправлена afterload RV отказа. Следовательно это не возможно заключить Если улучшение функции RV после вмешательства вторичные afterload, снижение легочного сосудистого эффект, или если это вызвано прямые последствия для RV. Кроме того модель MCT имеет несколько экстра сердечных эффектов.

В экспериментальной легочного ствола диапазонов моделей afterload р.в. фиксируется благодаря механической сужением легочного ствола. Это позволяет для расследования случаев прямого сердечных эффектов вмешательства на RV независимо от любого легочные сосудистые эффекты^6,,78,9. Обычно диапазонов производится путем размещения иглу вдоль ствола легочной. Затем лигатура помещается вокруг иглы и легочного ствола и связан с узлом, и игла удаляется, оставляя швом вокруг ствола легочной. В зависимости от датчик иглы могут применяться различные степени сужения, но несмотря на этот подход широко используется, она имеет некоторые недостатки. Во-первых диаметр диапазонов это не совсем то же самое, как наружный диаметр иглы как лигатура связали вокруг иглы и легочного ствола. Во-вторых могут существовать значительные различия как плотно узел привязан, что делает его трудно воспроизвести в определенной степени диапазонов. Это приведет к вариации в диаметре диапазонов и тем самым больше дисперсии. Наконец узел может ослабнуть со временем.

Одно исследование применяется полузакрытыми тантал клип вокруг ствола легочной¹⁰. Они сжаты клип вокруг легочного ствола к внутренней области 1.10 мм² и сравнил его с крысы, подвергается диапазонов с швом с помощью иглы 18 G. В целом обандероливание клип был связан с менее Пери хирургических осложнений и дисперсия данных.

Исходя из принципов, описанных в Шу et al.¹¹, далее мы разработали и характеризуется легочного ствола, диапазонов (ПТБ) модель RV гипертрофия и неудачи. Здесь мы представляем наш опыт, с помощью этой модели, основанной на результатах предыдущих исследований^12,13. Для этой модели титана клип сжимается вокруг легочного ствола к точное пресет внутренний диаметр, которая может быть скорректирована с целью побудить собственный RV провал фенотипов.

Все крысы были обработаны согласно датские национальные руководящие принципы, описанные в датский Закон о экспериментов на животных и приказ на подопытных животных. Все эксперименты были утверждены Советом по рассмотрению институциональных этики и проводились в соответствии с датским законом для исследований на животных (номер авторизации 2012-15-2934-00384, Министерство юстиции Дании).

1. Регулировка Ligating Applier клип

Примечание: Кольцевание легочного ствола производится с изменение открытого ligating клип изменений с угловой челюсти. Объект применения изменений изменяется с механизмом регулируемый стоп остановить сжатие, когда челюсти достигают точное расстояние друг от друга. Когда маленький титана безлигатурные клип сжимается с измененный объект применения изменений, люмен, сохраняется между ног клип с конкретным диаметр согласно регулировки остановить механизм (рис. 1).

1. Выбрать диаметр желаемых диапазонов, например, 0,6 мм.
2. Отрегулируйте ligating клип изменений до тех пор, пока расстояние между челюстями — 1,0 мм, когда полностью сжаты. Это оставляет просвет 0,6 мм, как два клипа ноги имеют толщиной 0,2 мм.

Рисунок 1: процедура PTB. (A) хирургические инструменты, используемые для ПТБ процедуры, включая ligating клип изменений (синяя стрелка). (B) регулируемые остановки механизма безлигатурные клип объект применения изменений. Поворачивая зубчатая (синяя стрелка) будет отрегулировать положение PIN-код (желтая стрелка), который останавливается закрытия объект применения изменений, когда челюсти достигают определенного расстояния друг от друга. Расстояние соответствует два раза толщину ноги клип плюс внутренний диаметр ролика, когда клип сжимается и может быть откалиброван с помощью например иглы с известным наружный диаметр. (C) применения сжимает титана клип точный внутренний диаметр предварительно заданные корректировки изменений. (D) внутренний диаметр сжатые клип может быть скорректирована с целью побудить различных важностей RV гипертрофия и неудачи. Для данных, представленных внутренний диаметр 1,0 мм был использован чтобы побудить мягкой гипертрофии RV, внутренний диаметр 0,6 мм было побудить умеренный неспособность RV, а внутренний диаметр 0,5 мм использовалась побудить тяжелой недостаточности RV. (E) клип после применения вокруг легочного ствола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Подготовка крысы

Примечание: Могут быть применены другие схемы анальгетиков.

1. Использование отъемышам крыс Wistar весом примерно 100-120 г. Для того, чтобы поддерживать температуру тела во время операции, использование крытой грелку.
2. Для хирургии использование механического вентилятора tidal volume приблизительно 1,75 мл и частота дыхания 75 в минуту.
3. Обезболивают Крыса с севофлюран (7% смеси в 1,5 Л O₂) в камеру индукции на 5 минут. Интубировать крыс с помощью канюли IV 17 G, где дистальной 2 мм иглы были отрезаны в порядке для мягкого катетера для покрытия кончик. Извлеките иглу и подключить канюли для вентилятора.
4. Место крысы на его обратно на грелку. Убедитесь в правильности интубации, наблюдая за движениями грудной клетки. Они должны быть без стороне различия и в ногу с вентилятором.
   Примечание: Отсутствие движений грудной клетки, брюшной схватки и инфляции желудка в верхней левой части живота, признаки неправильно трубки. Удалить канюлю, помещают крыса обратно в камеру индукции и повторной интубации.
5. После правильной интубации, уменьшить севофлюран для поддержания концентрации (3,5% смеси в O_2, 1.5 Л/мин) и исправить лапы крысы грелку.
6. Подтвердите следователь анестезии путем проверки вывода рефлексы конечностей с помощью щипцов выжать лапы крысы.
7. Придать крыс с бупренорфин (0,1 мг/кг подкожно (с.к.)) и carprofene (5 мг/кг s.c.) для облегчения послеоперационной боли.
8. Брить грудь и лечить с хлоргексидином.

3. изоляция легочного ствола

1. С парой ножницы сделать 2 см разрез в коже вдоль средней части грудины. Выявление основных мышцей и сократить его грудины вложений. Определите, 2-^й, 3^rdи 4^й Коста ниже.
2. При необходимости захватите 2^nd Коста с фиксации щипцов, положить шовные (4-0, мультифиламент, рассасывающиеся) вокруг 2^nd Коста из межреберное пространство 1^st нижней медиальной части 2^nd межреберное пространство. Завязывайте узел фирмы чтобы перевязать передней грудной артерии.
   Примечание: Это может быть полезно, если кровотечение из передней грудной артерии периодические проблемы.
3. Вырезать 4^th, 3^rdи 2^nd Коста недалеко от грудины с ножницами и тщательно анализировать межреберные мышцы, пока не выполнена полная левая торакотомия. Если любое кровотечение от передней грудной артерии происходит, сжимать с ПИН и перевязать артерии.
4. Вставьте втягивающего устройства между грудиной и Косты и откройте его, чтобы получить хорошее поле работы. В верхней части поля является тимус, охватывающих легочного ствола и аорты. Осторожно поднимите тимуса, используя ПИН и переверните его вверх, чтобы разоблачить аорты и легочной ствол ниже.
5. Руководство кончик небольшой хирургической hooklet с 85° углом через поперечной перикарда синуса, расположенный за левую придаток предсердий. Вытащить его на полпути через синуса и руководство кончик уха крюк вверх до тех пор, пока он появляется между восходящей части аорты и легочной ствол.
   1. Удалите любые соединительной ткани, охватывающих кончик с диафрагмой ножниц для того чтобы отделить легочного ствола от восходящей части аорты.
   2. Повторите шаг с больших крючком (необязательно).
6. Руководство щипцы угловой мышцы вокруг ствола легочной через проход с hook(s). Захватить конце лигатура приблизительно 10 см (4-0, многожильного) и потяните половина лигатура обратно через проход. Теперь легочного ствола отделена от восходящей части аорты и может управляться лигатура вокруг него.

4. применение клипа

1. Загрузите скорректированного ligating изменений клип с зажимом. Тщательно руководство одним из пасти и одна нога клипа хотя проход вокруг легочного ствола. Используйте осторожно потяните легочного ствола вверх и на развилке клипа лигатура.
2. Когда легочного ствола находится на развилке клипа и два советы клип ноги свободны от любой соединительной ткани, сжимайте клип с применения применять диапазонов.
3. Наблюдать, как RV сразу расширяет в ответ на диапазонов и удалить лигатура.

5. Закрытие грудной клетки

1. Удаление ПИН из тимуса и перемещения тимуса его естественное положение. Удаление втягивающего устройства.
2. Закрыть грудной клетки в три слоя: межреберная слой, основной мышцей и кожи с швом (4-0, мультифиламент, рассасывающиеся). 2 мл физиологическим s.c. для замены жидкости, потерял во время операции вставки.
3. Выключить севофлюран и и держать крыс на Вентилятор (1,5 Л O2) пока она начинает дышать самостоятельно. Затем экстубаций крыса.
4. Лечить крыс с бупренорфином в питьевой воде для следующих трех дней¹⁴ или применить аналогичный протокол обезболивающее. После трех дней крысы выздоровели и без дискомфорта.
5. В течение следующих недель благополучия крыс и возможные негативные последствия должны оцениваться на ежедневной основе. Заживление раны от торакотомия особое внимание следует уделить в ходе первой недели с целью выявления каких-либо признаков инфекции или недостаточности рубцов. Если крысы признаки отказ процветать включая щетинистые меха, ограниченной способностью к передвижению, проблемы с дыханием и потеря веса, они должны внимательно контролироваться и умерщвлены если они теряют более чем на 20% веса их собственного тела или разработать молниеносный дыхания недостаточность.

6. Шам хирургии

1. Выполните операцию Шам, выполнив все шаги выше, за исключением применения клип (шаг 4).

С помощью описанной процедуры ПТБ в предыдущих исследованиях от нашей группы^12,13, мы индуцированных RV гипертрофия (ПТБ мягкая) диапазонов с зажимом 1,0 мм, умеренной степени RV отказ (ПТБ умеренный) диапазонов с 0.6 мм клип и тяжелой степени RV (ПТБ тяжелой) неспособность диапазонов с зажимом 0,5 мм. Крысы, подвергаются тяжелой диапазонов развитых экстра сердца проявлений RV недостаточности печеночная недостаточность и асцит (Рисунок 5E). Все крысы были оценены через семь недель после ПТБ и Шам крыс подвергся той же процедуре, только без применения клипа. Постоперационная смертность была меньше, чем 1 в 6. Семь недель выживаемость составила 80% для крыс, подвергаются серьезным диапазонов и близка к 100% крыс, подвергнут легкой или умеренной полосы или фиктивный хирургии.

Для оценки последствий ПТБ процедуры мы использовали эхокардиография вместе с магнитно-резонансная томография сердца (МРТ), чтобы оценить объемы RV и сердечного выброса. Трикуспидального плоскости кольцевой систолической экскурсии (TAPSE) был измеряется как расстояние плоскости кольцевой трехстворчатый с сужением RV в представлении апикальной 4 камерная. В среднем трех циклов вне дыхания был использован как представитель значение. RV конечного диастолического объема (EDV) и конец систолический объем (ESV) были оценены рисунок из эндокарда в серии коротких оси изображений через RV, полученные МРТ для каждого крыса и фракция изгнания RV (EF) рассчитывается как EF = (EDV-ESV) / Эдв. Сердечный выброс было измерено между легочного клапанов и клип, используя последовательность МРТ фазово контрастной. Цифровые записи RV давления были получены путем микро кончик катетера, установил в караване до эвтаназии. Дополнительные сведения об этих методах были описаны ранее¹². Гипертрофия RV оценивалась как отношение веса RV, разделены по весу левого желудочка (LV) плюс перегородки и как вес RV, деленное на длине голени исправить для размера крысы. Все методы были применены, как описано ранее¹².

В течение одной недели повышенных давлениях RV и RV дисфункции свидетельствует снижение сердечного выброса и TAPSE разработали в ПТБ крыс, по сравнению с липовые оперированных крыс. Соответственно вмешательства или фармакологических препаратов может начаться уже в этот момент времени если один стремится исследовать влияние на установленных RV неудачи. После дополнительных шести недель далее возросла RV давление. Различия фенотип провал умеренной против тяжелой RV были еще более заметна, проявленная поэтапное снижение сердечного выброса и TAPSE с повышенной тяжести диапазонов (рис. 2 и рис. 3). Наша группа формообразование¹⁵были опубликованы подробные гемодинамики различия между ПТБ мягкая крыс и ПТБ тяжелой крыс через 4 недели после операции.

ПТБ процедура также вызвано увеличением RV EDV и RV ESV в умеренных ПТБ крыс, по сравнению с липовые оперированных крыс и в тяжелых ПТБ крыс, по сравнению с умеренным ПТБ и Шам RV дилатации очевидным. Поэтапное сокращение в RV EF был также видели (рис. 4).

Развитие гипертрофии RV ассоциировалось величины давления перегрузки, применяемых клип. Отношение RV веса LV плюс перегородки шагам возросло от крыс с мягким диапазонов с зажимом 1,0 мм над крысами, объединились с умеренной 0,6 мм клип для крыс, объединились с зажимом тяжелой 0,5 мм. Аналогичные результаты были замечены для RV веса исправить для размера крысы, разделив с длиной голени. Гипертрофия также рассматривалось как увеличение cardiomyocyte поперечного сечения в ПТБ крыс, по сравнению с липовые оперированных крыс. Помимо гипертрофии кардиомиоцитов давление перегрузки также побудил другие морфологические изменения RV, связанные с недостаточностью RV, включая RV фиброз. У крыс, подвергается серьезным диапазонов был вызван декомпенсированного RV отказ. Этот фенотип характеризовалась признаки обратной отказа, включая печеночной заторов, рассматривается как потемнения печени. Печеночная заторы обычно сопровождается асцит (рис. 5).

Рисунок 2: эффекты ПТБ одну неделю и семь недель после процедуры. Сердечного выброса (A) право желудочков (RV) Систолическое давление (B) и (C) трикуспидального плоскости кольцевой систолического экскурсия (TAPSE) измеряется одну неделю после Шам или ПТБ операции с умеренной или тяжелой диапазонов соответственно. (D, E и F) То же самое мер через семь недель после процедуры и дальнейшее развитие RV провал¹². Данные, представленные как средний ± SEM. односторонним ANOVA с post hoc Бонферрони анализа. ** p < 0.01, *** p < 0,001, и *** p < 0,0001 ПТБ против Шам и ПТБ тяжелой против ПТБ умеренный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: последствия процедуры ПТБ, оценены эхокардиография. (A) A представитель четыре камеры мнение и (B) измерения скорости времени интеграл (VTI) в легочного ствола (Верхняя панель) и трикуспидального плоскости кольцевой систолической экскурсии (TAPSE) (Нижняя панель) в Шам действовали крыса. (C и D) похожих изображений для ПТБ крыса, подвергается средней полосы. Все изображения являются семь недель после операции Шам или диапазонов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: магнитно-резонансная томография крыс PTB. Сердца магнитно-резонансная томография (МРТ) ПТБ и Шам действовали крыс. (A) представитель четыре камеры изображения (Верхняя панель) и представления (Нижняя панель) короткие оси Шам крыс (слева) и ПТБ крыс с умеренной степенью разрушения RV (справа). В ПТБ крыса высоких давлений RV вызвало перегородки выпуклые (синей звездочкой). (B) ПТБ процедура индуцированной RV дилатации очевидным увеличение RV конец диастолический объем (EDV) и RV конец систолический объем (ESV). (C) RV фракция изгнания (EF) снизилась¹². Данные представлены как среднее ± SEM. односторонний дисперсионный анализ с должности специального анализа Бонферрони. * p < 0,05, ** p < 0.01, и *** p < 0,0001 ПТБ против Шам и ПТБ тяжелой против ПТБ умеренный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: анатомические данные и гистология. RV гипертрофия измеряется как (A) RV разделены по весу RV LV плюс перегородки и (B) разделены по длине голени от крыс с мягкой гипертрофии RV, умеренный неспособность RV и тяжелой недостаточности RV через семь недель после процедуры ПТБ. (C) представитель изображения гистологических срезах, окрашенных с hematoxyline eosine для измерения cardiomyocyte пересечь площадь поперечного сечения и (D) picrosirius красный анализируются под поляризованного света для фиброз от крыс Шам (слева) и ПТБ крысы с умеренной недостаточностью RV (справа). (E) A здоровая печень (слева) и бесцветные печени с перегрузкой (справа) от ПТБ крыс с тяжелой RV провал^12,13. Данные, представленные как средний ± SEM. односторонним ANOVA с post hoc Бонферрони анализа. ** p < 0.01 и *** p < 0,0001 ПТБ против Шам, ПТБ умеренной vs ПТБ мягкая и ПТБ тяжелой против ПТБ умеренный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Мы описываем метод доступным и высокую воспроизводимость легочного ствола диапазонов с использованием модифицированных ligating клип applier для сжатия титана зажим вокруг ствола легочной. Регулируя applier для сжатия клип для различных внутренних диаметров, собственный фенотипов RV гипертрофия и недостаточности может быть наведено включая тяжелой недостаточности RV с проявлением экстра сердечной декомпенсации.

Хотя простой, протокол содержит несколько важных шагов. Важно отметить, что крысы не может быть слишком большой, когда они проходят процедуру ПТБ. В нашем опыте отъемышам крыс Wistar, весом 100-120 g подходят для процедуры. В более крупных крыс приложений суровые диапазонов может привести к острой недостаточности RV и смерти. Другие исследования^{6,,78,9,10,16} использовали главным образом крупных крыс (160-260 g), но и больших диаметров их соответствующих ленты (1.27 – 1,65 мм).

Применение диапазонов меньше тяжести может также объяснить относительно скромные увеличения давления RV, представленные другими группами. Диапазонов с 18 G иглы (1,27 мм) приводит к RV систолическое давление в диапазоне 70 – 90 мм рт.ст^6,,78,9. В одном исследовании⁶это было не достаточно, чтобы вызвать RV фиброза или уменьшения сердечного выброса. Здесь мы приводим RV давления примерно 90 мм для средней полосы и 110 мм рт.ст, для тяжелой диапазонов. С тяжелой диапазонов, мы также были в состоянии создать фенотип декомпенсированного RV неудачи с экстра сердца проявлениях, включая печеночная заторов и асцит¹². Легочного ствола диапазонов, перевязка, с помощью иглы 20G (0.902 мм) вызвало фиброз печени, мускатный орех как печени заторов и асцит в крысах Sprague-Dawley¹⁶ несмотря на сравнительно мягкая сужения, по сравнению с нашего исследования. Это может быть объяснено различными крыса штаммов реагировать по-разному диапазонов. Существуют значительные различия между крыса штаммов метаболизма¹⁷, адренергические тон и сердечного ритма¹⁸ . Даже в пределах же штамм крыса различные характеристики, включая темпы роста могут варьироваться с различными поставщиками¹⁹. Это всегда должны приниматься во внимание. Для конкретных крыса напряжения используется поэтому критически важно выполнение продуманных экспериментальные исследования с целью определения диапазонов диаметр и последующей время, необходимое для желаемого RV провал фенотип развивать. Клип модель потенциально могут быть использованы в новорожденных крыс в отличие от ligating ранее методика²⁰, но у нас нет опыта с этим и те же соображения, как упоминалось выше применяется до начала исследования.

ПТБ модель имеет несколько ограничений. Во-первых очень проксимальной окклюзии, клип вокруг ствола легочной представляет условия Легочный стеноз или CTEPH больше чем дистальных сужение мелких легочных артерий, видели в Пау. Адаптация RV для увеличения afterload могут варьироваться в зависимости от расположения obstruction(s)²¹. Во-вторых применение клипа во время операции вызывает весьма резкое увеличение в RV afterload отличается от постепенного увеличения легочного сосудистого сопротивления в Пау. Однако, процедура выполняется в крыса отъемышам (100-120 g) порождает постепенно расширение RV afterload относительно веса тела с ростом животных. В течение семи недель после операции вес тела крыс возрастает примерно в четыре раза и поэтому относительная RV afterload увеличивается пропорционально вызывая прогрессирующее заболевание развития⁶.

С помощью модифицированных ligating применения клип и клип титана для диапазонов от легочного ствола, мы смогли побудить RV провал. Этот метод имеет ряд преимуществ, включая высокую воспроизводимость и возможность создания различных заболеваний важностей из мягкой гипертрофии RV неспособности декомпенсированного RV, регулируя диаметр диапазонов клипа. Изменение диаметра на 0,1 мм привели к собственный RV провал фенотипов, начиная от умеренного и компенсировать неспособность RV в тяжелой и декомпенсированной RV неудачи, демонстрируя точность этой легочного ствола диапазонов метод.

Авторы не имеют ничего сообщать

Эта работа была поддержана Датский Совет независимых исследований [11e108410], Датский фонд сердца [12e04-R90-A3852 и 12e04-R90-A3907], и Ново Нордиск фонд [NNF16OC0023244].