肺動脈バンディング圧負荷のモデルによる右室肥大と失敗

右室肥大とラットにおける失敗を誘導する手術方法を提案します。

持続的な圧負荷による右室 (RV) 障害は罹患率といくつかの心肺疾患の死亡率への主要コントリビューターです。RV の障害の動物モデルを信頼性が高く、再現性のあるため、疾患のメカニズムや潜在的な治療戦略の効果を調査するために保証されています。孤立した右室肥大を誘導するための一般的な方法は、肺動脈のバンディングが、一般的には、前述のモデルは、右心室肥大と失敗の安定したモデルを作成するのに成功していません。

圧負荷による右室肥大のモデルラットを提案する RV の障害の有無にかかわらず右心室肥大の異なった表現型により肺動脈のバンディング (PTB) によって引き起こされます。事前に設定の内径に肺トランク周りのチタン クリップを圧縮するのに修正ライゲーティング クリッププライヤを使用します。代償の RV の障害に軽度の右室肥大から病気の進行の異なった段階を誘導するために異なるクリップ径を使用します。

右心室肥大を PTB プロシージャに、応用のバンド クリップの直径に応じて受けるラットで一貫して開発し、代償肥大から重度の代償 RV に至るまで異なった病気の重大度を正確に再現することができます我々余分な心臓の症状と障害。

PTB の示されたモデルは、圧負荷の有効かつ堅牢なモデルによる右室肥大と高い再現性と厳しいと代償 RV の障害を誘発する可能性を含む他のバンド モデルにいくつかの利点は、障害です。

右心室 (RV) は、永続的な圧負荷に対応できます。時間、しかし、適応のメカニズムが、RV を拡張させる心拍出量を維持するために失敗した、RV が最終的に失敗しました。RV の機能は肺動脈高血圧症 (PAH)、血栓塞栓性肺高血圧症 (塞栓)、圧力 (またはボリューム) のオーバー ロードを持つ先天性心疾患の様々 な形態を含むいくつかの心肺疾患の主要な予後因子咲かせた。強烈な治療にもかかわらず RV の障害のままこれらの条件で死の主な原因です。

特徴^1、2胎生発育³ RV の結果として左心不全から派生した知識は右心不全に単に推定できません。右心不全の動物モデルが RV の障害と潜在的な薬理学的治療戦略のメカニズムを調査するために必要とします。

実験がある SU5416 による肺高血圧症のモデルは (MCT)⁵、低酸素血症 (SuHx)⁴またはモノクロと組み合わせる, 肺の血管系の病気に二次 RV の障害を誘導します。これらのモデルは、肺の血管を対象薬の治療効果を評価する使用されます。SuHx と MCT モデルの両方は、RV の障害の後負荷の非固定モデルです。その結果、介入後に右心室機能の改善が肺血管への影響を減らすことの後負荷に二次的か、右心室への直接影響によって引き起こされる場合を締結することはまた、MCT モデルはいくつかの余分な心臓効果です。

実験的肺動脈バンディング モデルで右心室の後負荷は肺動脈の機械的圧迫感により固定されています。これにより、RV の介入の直接心臓の効果の調査のための肺血管への影響^6,7,8,9から独立しました。通常、バンディングが肺動脈幹に沿って針を配置することによって実行されます。合字は針と肺動脈幹の周囲に配置し、結び目を結んで、針は、肺動脈幹周り縫合を残して削除されます。針のゲージによって狭窄の程度が異なるを適用することができます、しかし、この方法は広く利用されている、にもかかわらず、それはいくつかの欠点を持っています。まず、バンディングの直径は正確には針の外径と同じ、合字は針と肺動脈幹の周りに縛ら。第二に、方法をしっかりと結び目は縞模様のある程度を再現する困難に関連付けられてに有意な変化があるかもしれません。これはより大きい分散バンド径により変化に します。最後に、結び目は、時間の経過とともに緩んで来るかもしれない。

1 つの調査は肺動脈幹¹⁰前後半分閉じているタンタル クリップを適用されます。彼らは 1.10 mm²の内部領域に肺トランク周りクリップを圧縮し、18 G の針を使用して縫合糸でバンディングを受けるラットと比較しています。全体的に、クリップとバンド少ない手術周術期の合併症とデータ分散に関連付けられていた。

Schou で説明する原則に基づくら¹¹、さらに開発し、肺動脈のバンディング (PTB) モデル右心室肥大と障害を特徴とします。以前研究^12,13からの結果に基づいてこのモデルを使用して我々 の経験を紹介します。このモデルの正確なプリセット内径、明確な RV の障害の表現型を引き起こすために調整することを肺動脈幹周りチタン クリップは圧縮されます。

すべてのラットは動物実験と動物実験に関する省令にデンマークの法律に記載されているデンマークの国民の指針によると扱われました。すべての実験は、機関の倫理審査委員会によって承認され、動物研究 (承認番号 2012-15-2934-00384 法務省デンマーク) デンマークの法律に従って実施します。

1. ライゲーティング クリッププライヤの調整

注:肺動脈のバンディングと四角アゴと適用元変更オープン ライゲーティング クリップされます。Applier は、顎が互いから正確な距離に達したら圧縮を停止する調整可能な停止機構が変更されます。小さなチタン クリップを縛ることは、変更適用元で圧縮され、ストップ機構 (図 1) の調整によると特定の直径とクリップの足の間、内腔が解決しません。

1. 例えば必要なバンディングの直径を選択, 0.6 mm。
2. 顎間距離が 1.0 mm 完全に圧縮されたときまでライゲーティング クリッププライヤを調整します。これは、2 つのクリップの足が 0.2 mm の厚さ 0.6 mm の内腔を残します。

図 1:、PTB プロシージャ。(A) 手術器械ライゲーティング クリッププライヤ (青い矢印) を含む PTB プロシージャ使用します。(B) 調整機構、縛ることの適用元をクリップします。(青い矢印) 運命の歯車を回すと、顎が互いから一定の距離に達したら applier の閉鎖を停止 (黄色の矢印)、ピンの位置が調整されます。距離は、クリップが圧縮されていると知られている外径などの針を使用して校正することができますクリップの足に加えて、クリップの内径の太さの 2 倍に対応します。(C) applier は、applier の調整であらかじめ指定された正確な内径にチタン クリップを圧縮します。圧縮クリップの (D) の内側の直径は、右心室肥大と失敗の重要度が異なるを誘導するために調整できます。データを書き込む、1.0 mm の内径は、軽度の右室肥大を誘導するために使用された、内径 0.6 mm の適度な RV の障害を誘導するために使用された、内径 0.5 mm の深刻な RV の障害を誘導するために使用されました。(E) 肺動脈幹周りアプリケーション後クリップ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

2. ラットの準備

注: 他の鎮痛薬のレジメンを適用可能性があります。

1. Wistar ラット weanlings 重量約 100-120 g を使用します。手術中に体の温度を維持するために覆われた加熱パッドを使用します。
2. 手術、人工呼吸器のおよそ 1.75 mL の tidal volume と 75 分あたりの呼吸速度に設定を使用します。
3. セボフルラン (1.5 l O₂のミックス 7%) の部屋に誘導ラットを 5 分間 anaesthetize します。柔らかいカテーテル先端をカバーするためにチケットをカットされている針の遠位の 2 mm 17 G IV のカニューレを用いたラットを挿管します。針を除去し、カニューレを人工呼吸器に接続します。
4. 加熱パッドで背中にネズミを配置します。胸郭の動きを観察することによって、挿管を考えるが正しいことを確認します。これらは側面の違いなしとする必要がありますペースのベンチレーター。
   注:胸部、腹部の収縮と左上腹部の胃の膨張の動きの不在は、見当違いチューブの兆候です。カニューレを削除、誘導室に戻ってネズミを入れて、再挿管します。
5. 正しい挿管後メンテナンス濃度、セボフルランを減らす (3.5% ミックス O_2、 1.5 L/分)、加熱パッドをラットの足を修正します。
6. プローバ anesthetization 撤退、ラットの足を圧迫する、鉗子を使用して下肢の反射を確認します。
7. ブプレノルフィンとラットの挿入 (0.1 mg/kg 皮下 (サウスカロライナ)) と carprofene (5 mg/kg 皮下) 術後の痛みを和らげるために。
8. 胸を剃る、クロルヘキシジンで消毒してください。

3. 肺動脈幹の分離

1. はさみのペア、胸骨の中央部に沿って皮膚に 2 cm の切開を行います。大胸筋を識別し、その胸骨添付ファイルをカットします。2^nd、3^rdと 4^thコスタ以下を識別します。
2. 必要に応じて、固定鉗子、1^st肋間スペースから 2^nd肋の下の内側部分に 2^ndコスタ周辺縫合糸 (マルチ フィラメント、吸収性、4-0) を置くと 2^ndコスタをつかみます。前胸部の動脈を結紮するためにしっかりした結び目を作る。
   注:これは前胸部の動脈からの出血は、問題が再発する場合に便利にすることができます。
3. はさみのペアで 4^回、3^rdと胸骨に近い 2^ndコスタをカットそして完全な左開胸が実行されるまで慎重に肋間筋を解剖します。前胸部の動脈からの出血が発生した場合、ピーンと圧縮し、動脈を結紮します。
4. 胸骨と、基部のリトラクターを挿入し、良い営業フィールドを得るためにそれを開きます。フィールドの上部に大動脈と肺動脈を覆う胸腺です。胸腺、ピーンを使用して慎重に持ち上げ、大動脈と肺動脈の下を公開するために上向きに反転させます。
5. 左心耳の背後にある横の心嚢静脈洞を介して 85 ° の角度で小手術ツメの先端をガイドします。副鼻腔を通って中途半端に引くし、上行大動脈と肺動脈の間表示されるまで上方耳フックの先端をガイドします。
   1. 上行大動脈から肺動脈幹を分けるためにアイリスはさみで先端をカバーする任意の結合組織を削除します。
   2. 大きなフック (省略可能) 手順を繰り返します。
6. Hook(s) で作られた通路を通って肺トランク周りの斜め筋鉗子をガイドします。終わりを取得する通路を通って戻る合字の半分の約 10 cm 合字 (4-0、マルチ フィラメント) およびプル。今肺動脈は上行大動脈から分離されており、その周りに合字によって制御することができます。

4. クリップのアプリケーション

1. クリップで調整ライゲーティング クリッププライヤをロードします。慎重にガイド クリップの 1 つの脚と顎の一つが肺動脈幹周り通路。上向きにして、クリップのフォークに肺トランクを引いてに合字を使用します。
2. 肺動脈幹は、クリップのフォークと、クリップの足の 2 つのヒントは、結合組織の無料は、バンディングを適用する適用元のクリップを圧縮します。
3. RV をすぐにバンディングに対して拡張させる方法を観察し、合字を削除します。

5. 胸部の閉会

1. 胸腺から、ピーンを削除し、胸腺を自然な位置に移動します。巻取り器を削除します。
2. 3 つの層で胸部を閉じる: 肋間の層、大胸筋と皮膚縫合糸 (マルチ フィラメント 4-0、吸収) で。手術中に失われた液を交換する生理食塩水の皮下の 2 mL を注入します。
3. セボフルランをオフにして、それまで人工呼吸器 (O2 の 1.5 L) のラットは、自発的に呼吸を開始してください。その後、extubate、ラット。
4. 次の 3 日間¹⁴の飲料水のブプレノルフィンとラットを扱うまたは同様の鎮痛プロトコルを適用します。3 日後、ラットは回復しているが、違和感なく。
5. 次の週のラットと副作用の可能性の幸福を日常的に評価する必要があります。開から傷の治癒、最初の週の間に感染の兆候や、星の機能不全を検出するために特別な注意が表示されます。密接に監視し、安楽死の場合彼らは自分の体重の 20% 以上を失うまたは劇症を開発する必要がある場合、ラットは、剛毛の毛、運動障害、呼吸器系の問題、体重減少など成長障害の兆しを見せ、呼吸器不全。

6. 偽手術

1. (手順 4) クリップのアプリケーションを除く上記の手順のすべてに従うことによって、偽手術を実行します。

当社グループ^12,13から前の研究で記述の PTB プロシージャを使用して、我々 による右室肥大 (PTB 軽度) 1.0 mm クリップ、適度な RV の障害 (PTB 中程度) 0.6 mm クリップ付きバンディングによって重症度とバンディング0.5 mm クリップ付きバンディングによって RV 障害 (重度 PTB)。ラット肝不全 (図 5E) 腹水など RV の障害の重度のバンディング開発余分な心臓症状に受けます。すべてのラットは PTB 後 7 週間目に行ったし、せ物のラットに同じ手術クリップのアプリケーションなしのみ。周術期死亡率はより小さい 1 の 6 だった7 週間生存率深刻なバンディングに、軽度または中等度のバンディングや偽手術を受けるラットでは 100% に近い受けるラット 80% であった。

PTB の手順の効果を評価、心臓磁気共鳴画像 (MRI) RV ボリュームを評価するために、心拍出量とともに心エコーを使用しました。三尖弁の環状平面シストリック遠足 (TAPSE) は、頂の 4 腔像で右心室収縮と三尖弁の環状平面までの距離として測定しました。外呼吸の 3 つのサイクルの平均は代表値として使用されました。RV 末期容積 (EDV) と収縮末期容積 (ESV) を描画することによって評価された各ラットのための MRI で得られた RV および右室駆出率 (EF) EF として計算を短軸画像一連の心内膜 = (EDV ESV)/EDV。心拍出量を肺弁と位相コントラスト MRI のシーケンスを使用してクリップの間測定しました。右心室の圧力のデジタル録音は、安楽死の前に RV に取り付けられている微細探針とカテーテルで得られました。メソッドの詳細についてはされている¹²で説明しました。右室肥大はネズミほどの大きさを補正するための RV の脛骨の長さで割った値の重量と左心室 (LV) と中隔の重量で割った値 RV 重量の比率として評価しました。すべてのメソッドは、¹²を前述のように適用されました。

1 週間で高架の右心室圧と右心室機能不全の心拍出量と TAPSE の減少によって明らか偽手術群に比べて PTB ラットで開発していた。したがって、介入や薬理学的治療開始できますすでにこの時点で 1 つは確立された RV の障害に及ぼす影響を調査することを目的とする場合。追加 6 週間後右心室の圧力はさらに増加していた。適度な対厳しい RV 失敗表現型の相違点 (図 2および図 3)、縞模様の増加の重症度と心拍出量と TAPSE の両方の段階的な減少によって示されている顕著であったさら。詳細 PTB 穏やかなラットと PTB 重症ラットの血行力学的違い、手術後 4 週間は、私たちのグループの previousely の¹⁵によって公開されています。

PTB の手順もによる右心室拡張明らか偽手術群と比較して中程度の PTB ラットと適度な PTB と偽の両方と比較して重度の PTB ラット RV EDV と RV ESV の両方で増加。RV EF の段階的な減少も見られる (図 4) だった。

右室肥大の開発クリップによって適用される圧力の過負荷の大きさに関連していた。重度の 0.5 mm クリップ バンドのラットに適度な 0.6 mm クリップ バンド ラット 1.0 mm のクリップと穏やかなバンディング ラットから段階的に増加 LV プラス鼻中隔の体重を超える RV の比率。脛骨の長さで割ってネズミほどの大きさの修正 RV 重量のため同様の結果が見られました。肥大心筋細胞偽手術群に比べて PTB ラットの断面積の増加も見られました。心筋細胞の肥大は別圧負荷はまた RV の線維症を含む RV の障害に関連付けられている RV の他の形態学的変化を誘導します。ラットでは、深刻なバンディングを受ける、非代償性の RV の障害が誘起されました。この表現型は肝臓の濃い変色として見られる肝うっ血の検討を含む下位の障害の兆候によって特徴付けられました。肝うっ血の検討は通常腹水 (図 5) に伴われました。

図 2: PTB 一週間、術後後 7 週間の効果。(A) 右心室 (RV) 収縮期血圧 (B) 心拍出量と (C) 環状平面の三尖弁収縮期遠足 (TAPSE) を偽または中程度または重度バンディングをそれぞれ PTB 操作後 1 週間を測定します。(D、EおよびF)同じはプロシージャと RV の障害¹²のそれ以上の開発の後の 7 週間を測定します。ボンフェローニの事後分析と ± SEM. 一方向の分散分析の意味を提示されたデータ。* * p < 0.01 * * * p < 0.001 と * * * p < 0.0001 PTB vs シャムと PTB 厳しい対 PTB 適度。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 心エコー法による評価 PTB プロシージャの効果。(A) A 代表四腔像と肺動脈幹 (上部パネル) と偽運営ラット環状平面の三尖弁収縮期遠足 (TAPSE) (下段) の速度時間積分 (VTI) の (B) 測定。(CとD) 適度なバンディングを受ける PTB ラットの類似画像。すべての画像は、偽操作またはバンディング後 7 週間です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: PTB ラットの磁気共鳴イメージング。PTB と偽の心臓の磁気共鳴画像 (MRI) は、ラットを運営しています。(A) 代表的な 4 室イメージ (上部パネル) とせ物のラット (左) と RV の障害 (右) の中程度で PTB ラットの短い軸ビュー (下段)。PTB ラット高右心室圧はセプタム膨らんだ (青いアスタリスク) を引き起こした。(B)、PTB によるプロシージャ RV 拡張 RV 終わり拡張ボリューム (EDV) と RV 終わりシストリック容積 (ESV) の増加によって明白であります。(C) 右室駆出率 (EF) は、¹²を減少しました。データは、平均 ± として SEM. 一方通行 ANOVA ボンフェローニ分析をアドホックの記事をします。* p < 0.05 * * p < 0.01 と * * * p < 0.0001 PTB vs シャムと PTB 厳しい対 PTB 適度。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 解剖学的データと組織学.PTB 手順 7 週間後軽度の右室肥大、適度な RV の障害、および重症右心室不全ラット脛骨の長さで割った値 (A) RV LV に加えて、中隔と (B) の RV 重量で割った値として測定される右心室肥大。(C) 代表的な心筋細胞の測定のための hematoxyline エオシンで染色組織切片像クロス断面積および (D) picrosirius 赤せ物のラット (左) から PTB ラット線維化の偏光光の下で分析適度な RV の障害 (右)。(E) の健康な肝臓 (左) と深刻な RV の障害^12,13PTB ラットから (右) の混雑に変色した肝臓。ボンフェローニの事後分析と ± SEM. 一方向の分散分析の意味を提示されたデータ。* * p < 0.01 と * * * p < 0.0001 PTB vs 偽、PTB 適度な対 PTB 軽度と PTB 厳しい対 PTB 中程度。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

我々 は肺動脈バンディング肺トランク周りのチタン クリップを圧縮する修正ライゲーティング クリッププライヤを使用してアクセスし、再現性の高い方法をについて説明します。適用元が異なる内径にクリップを圧縮を調整すると、代償不全の余分な心臓の症状と重症の右心室不全を含む右心室肥大と失敗の異なる表現型を誘起することができます。

単純ですが、プロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれています。重要なは、PTB プロシージャを受けるとき、ラットが大きすぎることはできませんあります。私たちの経験では 100-120 g の重量を量る Wistar ラット weanlings が手順に適しています。大きいラット深刻なバンディングのアプリケーションは急性の RV の障害や死につながる可能性があります。他研究^{6,7,8,9,10,16}は大きいラット (160-260 g) だけでなく、彼らのそれぞれの縞 (1.27-1.65 mm) のより大きな直径の主に使いました。

以下の重大度のバンディングのアプリケーションもささやかな相対は他のグループによって報告される右心室圧の増加を説明するかもしれない。18 g バンディング針 (1.27 mm) は 70-90 mmHg^6,7,8,9の範囲で右心室収縮期圧に します。1 つの研究⁶で、これは RV の線維症を引き起こすまたは心拍出量を削減するのに十分でした。ここで、RV 約適度なバンディングの 90 mmHg と深刻なバンディング 110 mmHg の圧力を報告します。深刻なバンディングとは、肝の混雑や腹水の¹²を含む余分な心臓の症状と非代償性の RV の障害の表現型を作成することもできました。肺動脈バンディング (0.902 mm) 20 G 針を用いて結紮スプレイグ ドーリー ラット¹⁶にもかかわらず、私たちの調査と比べて比較的軽度の狭窄で腹水やナツメグのような鬱血肝線維症を引き起こした。これは、異なるラット系統、バンディングに異なる応答によって説明されるかもしれない。代謝¹⁷、アドレナリンのトーンと心拍数¹⁸に関してラット系統差があります。同じラット系統内でも異なるベンダー¹⁹成長率など諸特性が異なる場合があります。これは、アカウントに常に撮影する必要があります。使用される特定のラット系統、バンド径とを開発する所望の RV の障害の表現型に必要なフォロー アップの時間を決定するために適切に設計されたパイロット研究が実行されることが重要です。クリップ モデルことができますラット新生児摘出法以前²⁰とは対照的にされる可能性がありますが我々 はこの経験がないし、前述と同様の考慮事項を上記の研究を開始する前に適用されます。

PTB モデルには、いくつかの制限があります。まず、肺動脈幹周りクリップで非常に近位部の閉塞は、PAH に見られる小さい肺動脈の遠位部狭窄よりも肺動脈狭窄や塞栓の条件を表します。増加の後負荷に RV の適応は、obstruction(s)²¹の場所によって異なります。第二に、手術中にクリップのアプリケーションは PAH 肺血管抵抗の RV ずく緩やかな増加とは異なる非常に急激な増加を引き起こします。手順は、ただし、ラット weanlings (100-120 g) 動物の成長と体重を基準にして徐々 に増加右心室の後負荷を生じで実行します。手術後 7 週間期間中にラットの体重増加約 4 倍、それ故に相対的な右心室の後負荷増加比例して進行性疾患開発⁶を誘導します。

変更されたライゲーティング クリッププライヤとチタン クリップを使用すると、肺動脈のバンディング、RV の障害を誘発することができました。メソッドには、再現性の高い、バンドのクリップの直径を調整することによって代償 RV の障害に軽度の右室肥大から別の病気の重大度を作成する可能性を含むいくつかの利点があります。0.1 mm 直径を変更する穏健派に至る明確な RV の障害表現型で起因し、この肺動脈のバンディング法の精度を示す重度と代償の RV 失敗する RV の障害を補償しました。

著者がある何も開示するには

この作業は、独立した研究 [11e108410]、[12e04 R90 A3852 と 12e04 R90 A3907] デンマークの心臓財団、ノボ ノルディスク財団 [NNF16OC0023244] にデンマーク議会によって支えられました。