Количественное измерение γ-Secretase опосредованной амилоида прекурсоров протеина и вырез декольте в платформах Assay репортера Cell-based Люцифераза

Мы были успешно созданы две зависящие от субстрата γ-secretase анализов. Обе ячейки на основе анализов, представленные здесь предназначены для количественного определения γ-secretase ферментативную деятельность через выход Светлячок Люцифераза репортеров.

Мы разработали пару на основе ячеек Репортер ген анализов количественно измерить γ-secretase расщепление различных субстратов. Эта рукопись описывает процедуры, которые могут быть использованы для мониторинга γ-secretase опосредованной расщепления APP-C99 либо насекают, используя систему репортер Люцифераза Gal4 промоутер driven Светлячок. Эти анализы были созданы стабильно совместно transfecting HEK293 клеток с Gal4 приводом Люцифераза Репортер ген и фрагмента Gal4/VP16-тегами C-терминал приложения (APP-C99; CG клетки), или Gal4/VP16-тегами Notch-ΔE (NΔE; НГ клетки). С помощью этих анализов репортер параллельно, мы показали, что ингибитор ErbB2, CL-387,785, преференциально может подавить γ-secretase расщепление APP-C99 в CG клеток, но не NΔE в клетках нг. Дифференциальный ответы, выставлены CG и нг клетками, когда лечение с CL-387,785, представляют предпочтительным характерные для γ-secretase модуляторы, и эти ответы находятся в явном противоречии с Пан-ингибированием γ-secretase, индуцированных DAPT. Наши исследования обеспечивают прямые доказательства того, что в сотовой связи может быть продифференцированным γ-secretase деятельность, направленную на различных подложках. Поэтому эти новые анализы могут быть полезными инструментами в лекарственных препаратов для повышения АД терапии.

Олигомерные формы амилоид β (значения) считается основной причиной нейродегенеративные в мозгах пациентов, страдающих от болезни Альцгеймера (AD)¹. Пептиды значения производятся поэтапно расщепления белка амилоида прекурсоров (APP), сначала β-secretase, а затем γ-secretase². В последнее десятилетие терапевтические подходы к лечению AD были сосредоточены на предотвращении производства значения³. Большинство исследований были сосредоточены на увеличение активности α-secretase, который может препятствовать γ-secretase расщепление APP и тем самым уменьшение производства значения, или ингибирование β-и/или γ-secretase деятельности⁴. К сожалению неселективной ингибирование β - и γ-secretases результатов в неизбежные побочные эффекты, которые из-за вмешательства в функционирование других физиологических субстратов β - и γ-secretase^5,6. Что касается γ-secretase ингибиторы недавние исследования сообщили открытие целого ряда химических и генетические модуляторы, которые можно регулировать производство значения пока оказывает незначительное влияние на основные γ-secretase опосредованной обработки паз^{7 ,8,9,10,11,12}, однако, успешной терапии еще не разработана. Таким образом систематическое экраны являются дальнейшие обнаружить роман генетических и химические модификаторы, которые избирательно могут модулировать γ-secretase опосредованной обработки приложения.

Γ-Secretase известно расщеплять более чем 90 различных якорь мембранных белков. Среди этих субстратов-паз, чья деятельность имеет решающее значение для определения судьбы клетки и дифференциация во время развития¹³. Выборочно модулирует γ-secretase катализированное приложение обработки в отсутствие затрагивающих Notch обработки будет иметь существенно важное значение для минимизации связанных с Notch побочные эффекты ингибиторов γ-secretase, и считается, что эта избирательность является основным фактором, который будет диктовать биологической эффективности потенциальных γ-secretase Модуляторы для хронического лечения AD. Там был ряд arylsulfonamide производные, такие как GSI-953 (begacestat) и BMS-708163 (avagacestat), которые были найдены на выставку мощным и селективного торможения γ-secretase^14,15. Предыдущие исследования показали, что дифференциального ингибирование γ-secretase расщепление APP и паз можно наблюдать с помощью количественной основе ELISA пробирного в сочетании с проверкой в естественных условиях с помощью данио рерио¹⁶. Кроме того были созданы на основе ячеек пробирного парадигмы для решения потенциальных субстрата избирательность γ-secretase к APP и Notch^17,18. С помощью протоколов похож на описанных здесь, мы недавно обнаружили новый класс (D)-leucinamides, который мощно модулировать γ-secretase расщепление APP с Notch щадящие избирательности¹⁹. Вместе Эта коллекция исследований обеспечивает доказательства в концепция поддерживает понятие, что субстрат избирательности/доступность γ-secretase может быть предметом химических модуляции и экспериментальной проверки. Однако эти платформы пробирного часто полагаются на относительно низкой пропускной способности отсчетов и трудоемких подходов, которые могут не соответствовать промышленных стандартов для программ обнаружения наркотиков.

Мы недавно созданных на основе ячеек Люцифераза Репортер ген анализов, которые могут количественно определить каталитической активности γ-secretase сторону двух различных субстратов, 99-амино кислоты C-терминал фрагмент приложения (APP-C99) и внеклеточного удалить домен Notch пептида (NΔE). APP-C99 и NΔE широко использовался как прямой субстратов γ-secretase в различных анализов. Для создания однородной и последовательной Люцифераза Репортер ген анализов для расщепления γ-secretase APP-C99 или NΔE, мы получили одну ГЭС производные стабильной клеточная линия (CG), конститутивно выражает Gal4 промоутер driven Светлячок Люцифераза репортер ( Gal4-Luc) и Gal4/VP16-тегами APP-C99 синтез белка (C99-GV). Кроме того мы создали еще один ГЭС производные стабильной клеточная линия (НГ), конститутивно выражает Gal4-люк и Gal4/VP16-меткой NΔE (NΔE-GV). С помощью этих анализов Роман субстрата конкретных γ-secretase, мы теперь предоставляют метод для количественного определения и отличать каталитической активности γ-secretase к различных субстратов (APP-C99 в клетках CG), или NΔE в клетках нг. Кроме того анализы конкретного субстрата γ-secretase были разработаны для способствовать высоким содержанием скрининг платформ. Эти вновь созданные γ-secretase анализов может проложить путь для открытия модуляторы Роман γ-secretase, которые могли бы улучшить когнитивные функции, подавляя значения производства без вызывая нежелательных ингибирование паз для обработки следующего поколения объявления.

1. Измерение сигналов Люцифераза репортер, который соответствует γ-Secretase расщепление APP-C99 или NΔE

Примечание: Обратитесь к предыдущей публикации для подробного описания поколения CG и нг клетки^20,21.

1. Семя нг или CG клетки (20, 000 клеток/хорошо) на 96-луночных планшетов на окончательный объем 200 мкл/скважины в среднего роста, которая состоит из Дульбекко изменение средних орла (DMEM) плюс 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 5 мкг/мл blasticidin, 250 мкг/мл антибиотик (например zeocin) и 200 мкг/мл hygromycin б.
   1. Подсчет количества ячеек с Горяева.
   2. Передать увлажненные CO₂ инкубатора планшет и инкубировать и при 37 ° C на ночь.
2. Удалите из каждой скважины 100 мкл среднего роста.
3. Добавить 100 мкл/хорошо роста средних, содержащий 2 мкг/мл тетрациклина с либо 0,2% диметилсульфоксида (ДМСО), 2 мкм CL-387,785, 2 мкм N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) или других связанных с ErbB1/ErbB2 ингибиторов.
4. Инкубируйте обработанной CG или нг клетки в планшет при 37 ° C в течение 24 ч.
5. Удаление 150 мкл/хорошо роста среднего из планшетов.
6. Добавьте 50 мкл/хорошо Люцифераза пробирного реагента (см. Таблицу материалы).
7. Передать планшет Считыватель микропланшетов люминесценции.
   1. Поддерживать планшет при комнатной температуре на 5 мин с нежным агитации.
8. Определить Firefly Люцифераза (FL)-излучаемый люминесценции, используя предварительно определенные программы, хранящиеся в Считыватель микропланшетов люминесценции.
   1. Открыть инструмент контроля программного обеспечения (см. Таблицу материалов для деталей инструмент).
   2. Выберите из меню «Tool», «Luminometry».
      1. Под «параметры» выберите «Нет фильтра» для фильтра выбросов, галочку «Normal» для выбросов диафрагмы, введите '1' для подсчета времени и нажмите кнопку «OK» чтобы настроить чтение люминесценции.
   3. На вкладке «Управления» прокрутите список активных протоколов и выберите предварительно протокол для чтения люминесценции.
   4. На вкладке «Live дисплей» определить масштаб в раскрывающемся списке и выберите «Логарифм» или «Linear» для типа.
   5. На вкладке «Температура» выберите «Off» для плиты обогрева.
   6. Нажмите кнопку «Пуск» выполнять чтение люминесценции.
   7. При необходимости, экспортируйте результаты в формате таблицы, с использованием «Проводник», встроенные в программное обеспечение управления.

2. Количественная оценка активности γ-Secretase

1. Определите люминесценции сигнал, излучаемый CG или нг клетки лечат 0,1% ДМСО в среднего роста, содержащие 1 мкг/мл тетрациклин только как 100% относительной γ-secretase деятельности.
   1. Оценка фон свечения от CG или нг клеток, рассматривая клетки с среднего роста, который не содержит тетрациклина.
2. Нормализовать Люцифераза сигналы от CG или нг клеток, которые культивировали с среднего роста, содержащие 1 мкг/мл тетрациклин и либо 1 мкм CL-387,785 или 1 мкм DAPT с Люцифераза сигнал излучаемый ДМСО лечение CG или нг клетки (100% относительной γ-secretase деятельности, как определены в 2.1).

Ингибирование ErbB2, CL-387,785 дифференциально может способствовать обработки APP-C99 Γ -secretase не затрагивая вырез декольте
Создать на основе ячеек assay который можно количественно измерить протеолитического расщепления субстрата конкретной γ-secretase, мы порожденных линии клеток HEK293-производные CG стабильного сотрудничества transfection по тетрациклин индуцибельной C-смертельно Gal4/VP16-тегами APP-C99 и Gal4 промоутер driven Светлячок Люцифераза Репортер ген. Параллельные линии клеток NG был также создан для анализа для γ-secretase расщепление NΔE. В клетках нг тетрациклин индуцибельной NΔE Gal4/VP16-тегами C-терминала и Gal4 промоутер driven Люцифераза Репортер ген были стабильно совместно transfected в HEK293 клетки. Γ-secretase расщепление APP-C99 в клетках CG и γ-secretase расщепление NΔE в клетках нг впервые были подтверждены лечении CG и нг клетки с различных концентраций DAPT, ингибитор γ-secretase Пан, который блокирует расщепление всех субстратах (γ-secretase Рисунок 1). Данные также продемонстрировал что γ-secretase в CG andNG клетки выставлены сопоставимые уровни катализа.

Для проверки эффективности работы на основе ячеек анализов субстрат специфичные для γ-secretase расколы, мы изучили свечения сигналов в CG и нг cellstreated с двойной ингибитор ErbB1/2 CL-387,785, который был проявлен к дифференциально модулировать Γ-secretase расщепление APP-C99 и NΔE²¹. Ранее мы определили CL-387,785 как модулятор селективного γ-secretase из-за его вмешательства с учетом взаимодействия протеин протеина между Пресенилин-1 (PS1) и C99 и отсутствием вмешательства с взаимодействием между PS1 и NΔE²¹. Здесь данные показывают, что лечение с CL-387,785 эффективно блокирует обработку APP-C99 в CG клетки, тогда как протеолиза NΔE в клетках нг не влияет (рис. 2). Эти результаты демонстрируют эффективность CG и нг клеток в различия между C99 и NΔE декольте, в формате, который благоприятен для высокопроизводительного скрининга платформ.

Рисунок 1: APP-C99-конкретных клеточных γ-secretase assay (CG клеток). CG клетки были посеяны на 96-луночных планшетов (20 000 клеток/хорошо) ночи и обработанных с 1 мкм CL-387,785 или DAPT в присутствии тетрациклинов 1 мкг/мл при 37 ° C в течение 24 ч. После добавления реагента assay 100 мкл/хорошо Люцифераза был количественно люминесценции, производный от γ-secretase опосредованной протеолиза C99-GV. Люцифераза сигнал, излучаемый клетках, обработанных с транспортного средства только (0,1% ДМСО) был установлен как 100% относительной люминесценции. Данные отображаются как среднее ± SD от трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: паз конкретных клеточных γ-secretase assay (нг клеток). НГ клетки были посеяны на 96-луночных планшетов (20 000 клеток/хорошо) ночи и обработанных с 1 мкм CL-387,785 или DAPT в присутствии тетрациклинов 1 мкг/мл при 37 ° C в течение 24 ч. После добавления реагента assay 100 мкл/хорошо Люцифераза был количественно люминесценции, производный от γ-secretase опосредованной протеолиза NΔE-GV. Люцифераза сигнал, излучаемый клетках, обработанных с транспортного средства только (0,1% ДМСО) был установлен как 100% относительной люминесценции. Данные отображаются как среднее ± SD от трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Многообещающие результаты пробу этап 1b иммунотерапии aducanumab для AD твердо установили решающую роль Aβ в патогенезе AD²² и предположить, что анти Aβ подходы по-прежнему жизнеспособной стратегии развития анти ад наркотиков. Здесь мы описываем анализов на основе ячеек для количественной оценки γ-secretase катализированное протеолиза APP-C99 и NΔE с помощью Светлячок Люцифераза репортер систем. APP-C99 и NΔE являются двумя наиболее изученной γ-secretase субстратов и вместе представляют патогенных и физиологической деятельности γ-secretase¹³. Наши выводы, что Даунрегуляция ErbB2, CL-387,785 преференциально может снизить уровень установившегося APP-C99 и секретируемые значения, в свою очередь, подтверждаются на субстрат конкретных клеточных анализов γ-secretase, описанные в настоящем исследовании. Таким образом, текущий протокол обеспечивает эффективный подход для открытия модуляторы Роман γ-secretase.

По существу эта парадигма конкретного субстрата пробирного γ-secretase являются многогранными. Например эти анализы конкретного субстрата γ-secretase могут быть использованы в Предварительный сетчатый исключает потенциальных ингибиторов неизбирательной γ-secretase от дальнейшего развития и дать количественную оценку, которая имеет отношение к минимуму потенциальные побочные эффекты. Биологическая эффективность активных соединений, выявленных из этого метода может затем проверяться далее в нейрональных клеток и Животные модели AD, как показано в недавно²¹. Кроме того имеет решающее значение для воспроизводимости результатов нашей экспериментальной однородности CG и нг стабильных клеточных линий. Важно отметить, что тетрациклин индуцибельной выражение C99-GV или NΔE-GV эффективно предотвращает насыщенность Люцифераза репортер выражение, которое рассматривается в других системах, где конститутивно выражается C99 или NΔE. Тетрациклин индуцибельной выражение приводит к весьма надежной и последовательной Люцифераза сигнал, который напрямую коррелирует с γ-secretase активностью, позволяя сравнения γ-secretase расщепление деятельности между двумя разных субстратах (APP-C99 по сравнению с NΔE) или от эксперимента к эксперимент в высшей степени эффективно. Чтобы получить наилучшие результаты, деятельность раствор тетрациклина должны контролироваться периодически (желательно раз в месяц) для обеспечения эффективности оптимальное всасывание. Как дополнительное преимущество однородность этих платформ устраняет необходимость нормализации Люцифераза Светлячок с учредительного Renilla Люцифераза выражением. Наконец рассматривая CG и нг клетки с 1 мкм avagacestat, известный Notch щадящие γ-secretase ингибитор, может служить положительный контроль для assay.

Один из возможных предостережение с использованием платформы настоящего анализа является, что гиперэкспрессия γ-secretase субстратов и последующего насыщение transcriptional репортер в нашем анализов имеет некоторый потенциал маска ингибиторная активность и вносить противоречивые ингибирующее потенции среди различных анализов²³. Этот потенциал осложнение подчеркивает необходимость вторичных пробирного платформ для проверки эффективности ингибиторов Notch щадящие γ-secretase, как показано в недавно²¹. Другим потенциальным ограничением этого подхода является, что учитывая более чем 90 различных мембранных белков были определены как γ-secretase субстратов, настоящий пробирного платформ не предоставляют полный профиль γ-secretase субстрата селективности. Вдоль этих линий щадящие ингибирование вырез декольте не может быть лучшая индикация с которого требуется вычислить гамма-secretase ингибиторов. Следует проявлять осторожность в связи с тем что avagacestat, ингибитор γ-secretase паз щадящие, сумеет улучшить познания²⁴и это, вероятно, что ингибирование паз не может быть единственной основой для токсичности, связанные с Пан γ-secretase ингибиторов ²⁵. истинный утилита хитов, выявленных на этот новый подход может зависеть, если вновь выявленных Notch щадящие γ-secretase ингибиторы обладают Роман химических образований, которые не присутствуют в avagacestat, и эффективность этих ингибиторов может быть проверку с использованием моделей в vivo AD.

В заключение мы считаем, что представленный подход может значительно ускорить развитие γ-secretase APP C99-специфичные ингибиторы/Модуляторы для клинического использования. Существует без отказ что γ-secretase ингибиторы, являются ли они Notch щадящие или нет, потенциально могут возбуждать токсичность в AD пациентов, которые привели бы к нежелательным переносимость и результаты как ранее предложил²⁶. Однако, с введением новых химических средств и улучшение проверки схемы²¹, γ-secretase следует продолжать быть привлекательной мишенью наркотиков вследствие биохимических сложности, требующих более доклинических и клинических исследований для изучения его терапевтические актуальность в AD.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Авторы благодарят основной фонд Институт клеточной и организмический биологии, Синика, за технической поддержкой. Это исследование было поддержано Министерством науки и технологии, Тайвань (наиболее 103-2320-B-001-016-MY3 к ю.-ф. L.), программа для трансляционного инноваций биофармацевтических развития – технология поддержки платформы оси схеме (NP7 к ю.-ф.л.) и Синика (на ю.-ф.л.).