Quantitative Messung der γ-Sekretase-vermittelten Amyloid-Precursor-Protein und Notch Spaltung in zellbasierten Luciferase Reporter Assay Plattformen

Wir haben erfolgreich zwei Substrat-spezifische γ-Sekretase Assays generiert. Beiden zellbasierte Assays, die hier vorgestellten sollen γ-Sekretase enzymatischen Aktivitäten über den Ausgang des Firefly Luciferase Reporter zu quantifizieren.

Wir haben ein paar zellbasierte Reporter-gen Assays zur Messung quantitativ γ-Sekretase Spaltung von unterschiedlichen Substraten entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt Verfahren, die verwendet werden, um die γ-Sekretase-vermittelte Spaltung des APP-C99 oder Kerbe, mit einem Gal4 Projektträger-gesteuerte Firefly Luciferase Reporter System zu überwachen. Diese Tests wurden festgelegten stabil Co transfecting HEK293 Zellen mit Gal4-driven Luciferase Reporter-gen und entweder das Gal4/VP16-Tags C-terminale Fragment App (APP-C99; CG-Zellen), oder die Gal4/VP16-Tags Kerbe-ΔE (NΔE; NG-Zellen). Parallele Nutzung dieser Reporter-Assays, wir haben gezeigt, dass ein ErbB2-Inhibitor, CL-387.785, bevorzugt γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 in CG Zellen, aber nicht NΔE in NG Zellen unterdrücken können. Die differenzierten Antworten, ausgestellt durch die CG und NG Zellen, wenn Sie mit CL-387.785, behandelt eine bevorzugte charakteristisch für γ-Sekretase Modulatoren, dar, die diese Antworten stehen in krassem Gegensatz zu der Pan-Hemmung der γ-Sekretase induziert durch DAPT. Unsere Studien bieten direkte Beweise dass γ-Sekretase Tätigkeiten auf verschiedenen Substraten in einem zellulären Kontext unterschieden werden können. Diese neue Assays kann daher nützliche Werkzeuge in der Drogeentdeckung für verbesserte AD-Therapien.

Oligomere Formen von Amyloid-β (Aβ) sind vermutlich die Hauptursache für Neurodegeneration in den Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD)¹. Aβ-Peptide werden durch die schrittweise Spaltung des Amyloid-Precursor-Protein (APP), zuerst durch β-Sekretase und dann durch γ-Sekretase²produziert. In den letzten zehn Jahren haben therapeutische Ansätze zur Behandlung der AD zur Verhinderung der Aβ Produktion³konzentriert. Die meisten Studien konzentrierten sich auf entweder die Vermehrung der α-Sekretase Aktivität, die γ-Sekretase Spaltung des APP schließt und dadurch verringern die Produktion von Aβ oder die Hemmung der β-und/oder γ-Sekretase Aktivitäten⁴. Leider sind nichtselektiven Hemmung β oder γ-Secretases führt zu unvermeidbaren Nebenwirkungen, die durch Störung der Tätigkeit der anderen physiologischen Substraten von β und γ-Sekretase^5,6. Neuere Studien haben im Hinblick auf γ-Sekretase-Inhibitoren die Entdeckung einer Reihe von chemischen und genetischen Modulatoren berichtet, die Aβ-Produktion beim ausüben vernachlässigbarer Auswirkungen auf die wesentlichen γ-Sekretase-vermittelten Verarbeitung von Notch^{7 regulieren können ,8,9,10,11,12}, jedoch erfolgreiche Therapie noch nicht entwickelt worden. So sind weitere systematische Bildschirme gerechtfertigt, um neuartige chemische und genetische Modifikatoren zu entdecken, die selektiv γ-Sekretase-vermittelten APP Verarbeitung modulieren kann.

Γ-Sekretase ist bekannt, mehr als 90 verschiedene Membran verankerte Proteine zu Spalten. Unter diesen Substraten ist Kerbe, deren Tätigkeit für Zelle Schicksal Entschlossenheit und Differenzierung während der Entwicklung¹³entscheidend. Selektiv modulierende γ-Sekretase-katalysierte APP Verarbeitung ohne wird Kerbe zu beeinträchtigen Verarbeitung wesentlich zur Minimierung Kerbe-bezogene Nebenwirkungen von γ-Sekretase-Inhibitoren, und diese Selektivität wird angenommen, dass ein primärer Faktor ist, dass die biologische Wirksamkeit von potenziellen γ-Sekretase Modulatoren für die chronische Behandlung von AD zu diktieren. Es wurden eine Reihe von Arylsulfonamide-Derivaten, wie GSI-953 (Begacestat) und BMS-708163 (Avagacestat), die gefunden wurden, potent und selektive Hemmung der γ-Sekretase^14,15auszustellen. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die differenzielle Hemmung der γ-Sekretase Spaltung der APP und Kerbe mit einer quantitativen ELISA-basierten Test in Kombination mit in Vivo Validierung mithilfe von Zebrafisch¹⁶beobachtet werden kann. Darüber hinaus wurden zellbasierte Assays Paradigmen eingerichtet, an die potentielle Substrat Selektivität der γ-Sekretase in Richtung APP und Kerbe^17,18. Unter Verwendung von Protokollen zu den beschriebenen ähnlich hierin, wir haben vor kurzem entdeckt eine neuartige Klasse von (D)-Leucinamides, die γ-Sekretase Spaltung des APP mit Notch-schonende Selektivität¹⁹potent modulieren. Diese Sammlung von Studien bilden zusammen ein Proof-of-Concept unterstützt die Vorstellung, die die Substrat Selektivität/Verfügbarkeit der γ-Sekretase chemische Modulation und experimentelle Verifikation unterworfen werden können. Dieser Assay-Plattformen setzen jedoch häufig auf relativ niedrigen Durchsatz auslesen und arbeitsintensive Ansätze, die industriellen Standards für Drug Discovery-Programme nicht erfüllen könnte.

Wir haben vor kurzem zellbasierte Luciferase Reporter-gen Assays generiert, die quantitativ, die katalytische Aktivität der γ-Sekretase gegenüber zwei unterschiedliche Substrate, die 99-amino Acid C-terminale Fragment der APP (APP-C99) und der extrazellulären bestimmen Domain gelöscht Kerbe Peptid (NΔE). APP-C99 und NΔE haben weithin als direkte Substrate der γ-Sekretase in verschiedenen Tests eingesetzt. Homogen und konsistent Luciferase Reporter-gen Assays für die γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 oder NΔE generieren, erzielten wir ein HEK abgeleitet stabile Zelllinie (CG), die konstitutiv eine Gal4 Projektträger-gesteuerte Firefly Luciferase Reporter (ausdrückt Gal4-Luc) und Gal4/VP16-Tags APP-C99 Schmelzverfahren Protein (C99-GV). Darüber hinaus erzielten wir ein weiteres HEK abgeleitet stabile Zelllinie (NG), die konstitutiv Gal4-Luc und Gal4/VP16-markierten NΔE (NΔE-GV) ausdrückt. Mit dieser neuartigen Substrat-spezifische γ-Sekretase-Assays, bieten wir jetzt eine Methode zu quantifizieren und die katalytische Aktivität der γ-Sekretase auf unterschiedlichen Substraten (APP-C99 in CG-Zellen) oder NΔE in NG Zellen zu unterscheiden. Darüber hinaus wurden die Substrat-spezifische γ-Sekretase-Assays entwickelt, um High-Content-Screening Plattformen förderlich sein. Diese neu erzeugten γ-Sekretase-Assays könnte den Weg für die Entdeckung des neuartigen γ-Sekretase Modulatoren ebnen, die kognitive Funktion zu verbessern könnte, durch die Unterdrückung von Aβ-Produktion ohne unerwünschte Kerbe Hemmung für die Behandlung der nächsten Generation zu entlocken der AD.

1. Messung der Luciferase Reporter Signale, die γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 oder NΔE entsprechen

Hinweis: Lesen Sie bitte den vorherigen Veröffentlichungen für detaillierte Beschreibungen der Generation von CG und NG Zellen^20,21.

1. Seed NG oder CG Zellen (20, 000 Zellen/Brunnen) auf 96-Well-Mikrotiterplatten zu einem Endvolumen von 200 μl/Well im Wachstumsmedium, der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) zuzüglich 10 % fötalen Rinderserum (FBS), 5 μg/mL Blasticidin 250 μg/mL Antibiotikum (z.B. zusammensetzt, Zeocin), und 200 μg/mL Hygromycin B.
   1. Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer.
   2. Die Mikrotiterplatten auf eine befeuchtete CO₂ Inkubator übertragen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
2. Jedes gut entnehmen Sie 100 μL des Kulturmediums.
3. Hinzufügen von 100 μl/Well des Wachstums mittlere mit 2 μg/mL Tetracyclin mit entweder 0,2 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 2 μM CL-387.785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-Butylester (DAPT), oder eine andere relevante ErbB1/ErbB2-Inhibitoren.
4. Inkubieren Sie behandelte CG oder NG Zellen in Mikrotiterplatten bei 37 ° C für 24 h.
5. Entfernen Sie 150 μl/Well Wachstumsmedium von Mikrotiterplatten.
6. Fügen Sie 50 μL/Well Luciferase Assay Reagenz (siehe Tabelle der Materialien).
7. Die Mikrotiterplatten Lumineszenz Mikrotestplatte Leser zu übertragen.
   1. Pflegen Sie die Mikrotiterplatten bei Raumtemperatur für 5 min mit sanften Agitation.
8. Bestimmen der Firefly Luciferase (FL)-emittierten Lumineszenz mit einem vordefinierten Programm im Lumineszenz Mikrotestplatte Leser gespeichert.
   1. Öffnen Sie die Instrument-Steuerungs-Software (siehe Tabelle der Materialien für Instrument Details).
   2. Wählen Sie aus dem Menü "Werkzeug" "Luminometry".
      1. Wählen Sie unter "Einstellungen" "Ohne Filter" für Emission Filter, Tick 'Normal' für Emission Blende, geben Sie '1' für zählen Zeit und klicken Sie auf "OK" zum Einrichten der Lumineszenz-Lesung.
   3. Auf der Registerkarte "Gerätesteuerung" führen Sie einen Bildlauf durch die Liste der aktiven Protokolle, und wählen Sie das zuvor gespeicherte Protokoll für das Lesen von Lumineszenz.
   4. Auf der Registerkarte "Live-Anzeige" definieren Sie die Waage aus dem Pull-Down-Liste, und wählen Sie "Logarithmus" oder "Linear" für den Typ.
   5. Wählen Sie auf der Registerkarte "Temperatur" 'Off' für Platte Heizung.
   6. Klicken Sie auf "Start", um die Lumineszenz lesen durchzuführen.
   7. Bei Bedarf exportieren Sie Ergebnisse in einem Spreadsheet-Format mit dem "Explorer" in die Software eingebettet.

2. Quantifizierung der γ-Sekretase Aktivität

1. Definieren Sie ein CG emittierten Lumineszenz-Signal oder NG Zellen mit 0,1 % DMSO im Wachstumsmedium mit 1 μg/mL Tetracyclin als 100 % relative γ-Sekretase Aktivität allein behandelt.
   1. Schätzen Sie Hintergrund Lumineszenz von CG oder NG Zellen durch die Behandlung der Zellen mit Wachstumsmedium, die keine Tetracyclin enthält.
2. Normalisieren Luciferase Signale von CG oder NG Zellen, die mit 1 μg/mL Tetracyclin-haltigem Wachstumsmedium kultiviert werden und entweder 1 μM CL-387.785 oder 1 μM von DAPT mit dem Luciferase-Signal ausgesendet von DMSO behandelt CG oder NG Zellen (100 % relative γ-Sekretase Tätigkeit als 2.1 definiert).

Hemmung der ErbB2 von CL-387.785 kann die Verarbeitung von APP-C99 von differentiell fördern Γ -Sekretase ohne Kerbe Spaltung
Um eine zellbasierte Assays zu etablieren, die die proteolytische Spaltung eines bestimmten γ-Sekretase-Substrats quantitativ messen kann, erzielten wir die HEK293 abgeleitet CG-Zell-Linie durch stabile Co Transfektion von einem Tetracyclin-induzierbaren C unheilbar Gal4/VP16-Tags APP-C99 und eine Gal4 Projektträger-gesteuerte Firefly Luciferase Reporter-gen. Eine parallele NG-Zelllinie wurde auch gegründet, um für die γ-Sekretase Spaltung von NΔE assay. In NG Zellen waren ein Tetracyclin-induzierbaren C-terminale Gal4/VP16-Tags NΔE und eine Gal4 Projektträger-gesteuerte Luciferase Reporter-gen stabil Co transfizierten in HEK293 Zellen. Die γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 in CG Zellen und der γ-Sekretase Spaltung der NΔE in NG Zellen wurden zuerst durch Behandlung von CG und NG Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von DAPT, eine Pfanne γ-Sekretase-Hemmer, die die Spaltung von alle γ-Sekretase Substrate (Blöcke bestätigt ( Abbildung 1). Die Daten zeigten auch, dass γ-Sekretase in CG AndNG Zellen ausgestellt vergleichbaren Niveau der Katalyse.

Um die Effizienz von der Substrat-spezifische zellbasierte Assays für γ-Sekretase Spaltungen zu validieren, untersuchten wir die Lumineszenz-Signale in CG und NG Cellstreated mit ErbB1/2 duale Inhibitor CL-387.785, das gezeigt worden ist, zu modulieren, differentiell Γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 und NΔE²¹. Zuvor haben wir als eine selektive γ-Sekretase-Modulator durch Interferenzen mit den Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen Presenilin-1 (PS1) und C99 und Mangel an Interferenzen mit dem Zusammenspiel der PS1 und NΔE²¹CL-387.785 identifiziert. Hier Daten zeigen, dass die Behandlung mit CL-387.785 die Verarbeitung von APP-C99 in CG Zellen blockiert während der Proteolyse der NΔE NG Zellen nicht war betroffen (Abbildung 2). Diese Ergebnisse belegen die Wirksamkeit von CG und NG Zellen bei der Unterscheidung zwischen C99 und NΔE Spaltung in ein Format, die Hochdurchsatz-Screening Plattformen förderlich ist.

Abbildung 1: die APP-C99-spezifische zelluläre γ-Sekretase Assay (CG-Zellen). CG-Zellen wurden ausgesät auf 96-Well Mikroplatten (20.000 Zellen/Na) über Nacht und mit 1 μM CL-387.785 oder DAPT im Beisein von 1 μg/mL Tetracyclin bei 37 ° C für 24 h behandelt. Die Lumineszenz von γ-Sekretase-vermittelten Proteolyse der C99-GV abgeleitet wurde nach Zugabe von 100 μl/Well Luciferase Assay Reagenz quantifiziert. Das Luciferase-Signal ausgesendet durch Zellen mit Fahrzeug allein (0,1 % DMSO) behandelt wurde als 100 % relative Lumineszenz festgelegt. Daten sind als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen Experimenten gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: die Kerbe-spezifische zelluläre γ-Sekretase Assay (NG-Zellen). NG-Zellen wurden ausgesät auf 96-Well Mikroplatten (20.000 Zellen/Na) über Nacht und mit 1 μM CL-387.785 oder DAPT im Beisein von 1 μg/mL Tetracyclin bei 37 ° C für 24 h behandelt. Die Lumineszenz von γ-Sekretase-vermittelten Proteolyse der NΔE-GV abgeleitet wurde nach Zugabe von 100 μl/Well Luciferase Assay Reagenz quantifiziert. Das Luciferase-Signal ausgesendet durch Zellen mit Fahrzeug allein (0,1 % DMSO) behandelt wurde als 100 % relative Lumineszenz festgelegt. Daten sind als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen Experimenten gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die vielversprechenden Ergebnisse aus Phase 1 b-Studie von Aducanumab Immuntherapie für AD haben die kritische Rolle von Aβ in der Pathogenese der AD²² fest etabliert und legen nahe, dass Anti-Aβ Ansätze noch eine tragfähige Strategie für die Entwicklung von Anti-AD Drogen sind. Hier beschreiben wir zellbasierte Assays für die Quantifizierung der γ-Sekretase-katalysierte Proteolyse von APP-C99 und NΔE mit Firefly Luciferase Reporter Systemen. APP-C99 und NΔE sind die zwei am meisten gut untersuchte γ-Sekretase Substrate und zusammen repräsentieren die pathogenen und physiologischen Aktivitäten der γ-Sekretase¹³. Unsere Ergebnisse, dass Downregulation des ErbB2 von CL-387.785 bevorzugt die Steady-State APP-C99 reduzieren kann und sekretierten Aβ sind weiter durch die Substrat-spezifische zelluläre Assays der γ-Sekretase beschrieben in der vorliegenden Studie belegt. Das aktuelle Protokoll sieht somit einen effizienten Ansatz für die Entdeckung des neuartigen γ-Sekretase Modulatoren.

Die Vorzüge dieses γ-Sekretase-Substrat-spezifischen Assay-Paradigmas sind vielfältig. Beispielsweise könnte diese Substrat-spezifische γ-Sekretase-Assays eingesetzt werden, in einem vorläufigen Bildschirm auszuschließen mögliche nicht-selektiven γ-Sekretase-Inhibitoren durch Weiterentwicklung und bieten eine quantitative Bewertung, die relevant für die Minimierung ist mögliche Nebenwirkungen. Die biologische Wirksamkeit von Wirkstoffen, die von dieser Methode identifiziert kann dann weiter in neuronalen Zellen und Tiermodellen der AD, überprüft werden, wie in letzter Zeit²¹gezeigt. Darüber hinaus ist die Homogenität der CG und NG stabiler Zelllinien für die Reproduzierbarkeit der experimentellen Ergebnisse von entscheidender Bedeutung. Vor allem verhindert der Tetracyclin-induzierbaren Ausdruck der C99-GV oder NΔE-GV wirksam die Sättigung der Luciferase Reporter Ausdruck, der in anderen Systemen gesehen wo C99 oder NΔE konstitutiv zum Ausdruck kommt. Diese Tetracyclin-induzierbaren Ausdruck ergibt sich ein höchst zuverlässige und konsistente Luciferase-Signal, das direkt mit der Aktivität der γ-Sekretase korreliert, ermöglicht den Vergleich der γ-Sekretase Spaltung Aktivitäten zwischen zwei verschiedenen Substraten (APP-C99 im Vergleich zu NΔE) oder von Experiment zu Experiment auf höchst effiziente Weise. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollte die Aktivität der Tetracyclin-Lösung in regelmäßigen Abständen überwacht werden (vorzugsweise einmal im Monat) um optimale Induktion Effizienz zu gewährleisten. Als ein zusätzlicher Vorteil entfällt die Homogenität dieser Plattformen für die Normalisierung der Firefly Luciferase mit konstitutiven Renilla -Luciferase-Ausdruck. Schließlich, Behandlung von CG und NG Zellen mit 1 µM Avagacestat, ein bekannter Kerbe-schonende γ-Sekretase-Hemmer, dienen als Positivkontrolle für den Assay.

Eine mögliche Einschränkung der Nutzung der vorliegenden Assay-Plattform ist, dass die Überexpression des γ-Sekretase Substrate und anschließende Sättigung des transkriptionellen Reporters in unseren Tests hat einige potenzielle hemmende Aktivität zu verschleiern und zu diskrepanten beitragen hemmende Potenz unter den verschiedenen Assays²³. Diese mögliche Komplikation unterstreicht die Notwendigkeit der sekundären Assay-Plattformen, die Wirksamkeit von Notch-schonende γ-Sekretase-Inhibitoren, zu validieren, wie vor kurzem²¹gezeigt. Eine weitere mögliche Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass da mehr als 90 verschiedene Membran Proteine als γ-Sekretase Substrate wurden identifiziert, die vorliegenden Test-Plattformen kein vollständiges Profil der γ-Sekretase Substrat Selektivität zur Verfügung stellen. In diesem Sinne möglicherweise erspart die Hemmung der Kerbe Spaltung nicht die besten Auslesen mit dem γ-Sekretase-Inhibitoren auszuwerten. Achtung aufgrund der Tatsache, dass Avagacestat, eine Kerbe-schonende γ-Sekretase-Inhibitor ergriffen werden sollten, nicht aufleuchtet, Verbesserung der Kognition²⁴, und es ist wahrscheinlich, dass Notch Hemmung möglicherweise nicht die einzige Grundlage für Toxizität im Zusammenhang mit Pan-γ-Sekretase-Inhibitoren ²⁵. der wahre Nutzen der Treffer durch diesen neuen Ansatz identifiziert auf Scharnier könnte, wenn die neu identifizierten Kerbe-schonende γ-Sekretase-Inhibitoren neuartige chemische Einheiten besitzen, die nicht in Avagacestat vorhanden sind und die Wirksamkeit dieser Inhibitoren werden kann mit in-Vivo -Modelle von AD validiert.

Zusammenfassend glauben wir, dass der vorgestellte Ansatz die Entwicklung der APP-C99-spezifische γ-Sekretase-Inhibitoren/Modulatoren für die klinische Anwendung erheblich beschleunigen kann. Gibt es keine Leugnung, dass γ-Sekretase-Inhibitoren, seien es Notch-schonende oder nicht, könnte potenziell Toxizität bei Alzheimer-Patienten, die zu unerwünschten Verträglichkeit führen würde initiieren und Ergebnisse wie zuvor²⁶vorgeschlagen. Jedoch mit der Einführung neuer chemischer Hilfsmittel und verbesserte Validierung Schemas²¹, γ-Sekretase sollte weiterhin ein ansprechendes Medikament Ziel aufgrund seiner biochemischen Komplexität erfordern weitere präklinischen und klinischen Studien zu erkunden ihre therapeutische Relevanz in AD.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Autoren danken den Core Facility der Institute der zellulären und Organismische Biologie, Academia Sinica, für technischen Support. Diese Studie wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (die meisten 103-2320-B-001-016-MY3, Y.-F. L.), das Programm für Translationale Innovation der biopharmazeutischen Entwicklung – Technologie unterstützt Plattform Achse Schema (NP7, Y. v.l.), und Academia Sinica (, Y.-v.l.).