Γ-Secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 Luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정

우리는 성공적으로 두 기판 전용 γ-secretase 분석 생성 된 있다. 여기에 제시 된 두 세포 기반 분석은 계량 반딧불 luciferase 기자 들의 출력을 통해 γ-secretase 효소 활동 설계 되었습니다.

우리는 양적 측정 별개 기판의 γ-secretase 분열 하 셀 기반 리포터 유전자 분석 실험의 한 쌍을 개발 했습니다. 이 원고는 애플 리 케이 션-C99 또는 Gal4 발기인 구동 반딧불 luciferase 기자 시스템을 사용 하 여 노치의 γ-secretase 중재 분열을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 절차를 설명 합니다. 이 분석 실험 안정적으로 공동 Gal4 구동 luciferase 취재 원 유전자와 응용 프로그램 (애플 리 케이 션-C99;의 C-터미널 Gal4/VP16 태그 조각 HEK293 세포 transfecting에 의해 설립 되었다 Cg로 셀), 또는 Gal4/VP16 태그 노치-ΔE (NΔE; NG 셀)입니다. 동시에 이러한 기자 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 증명 하고있다 ErbB2 억제제, CL-387,785, 우선적으로 CG 셀에 애플 리 케이 션-C99 하지만 NG 셀에 NΔE 하지의 γ-secretase 분열을 억제 하실 수 있습니다. CL-387,785로 치료 하면 CG과 세포에 의해 전시 하는 차동 응답 γ-secretase 변조기에 대 한 선호 특성 나타내고 이러한 응답 γ-secretase DAPT에 의해 유도 된 팬 억제에 강한 대조에 있다. 우리의 연구는 다른 기판으로 γ-secretase 활동 세포 맥락에서 분화 될 수 있다 직접적인 증거를 제공 합니다. 이러한 새로운 분석 따라서 향상 된 광고 치료를 위한 약물 발견에 유용한 도구를 수 있습니다.

아 밀 로이드 β (Aβ)의 oligomeric 모양은 neurodegeneration Alzheimer의 질병 (광고)¹에서 고통 받는 환자의 두뇌에서의 주요 원인이 될 것으로 추정 된다. Aβ 펩 티 드 그리고 γ-secretase²β-secretase에 의해 처음으로 녹말 체 선구자 단백질 (APP)의 stepwise 분열에 의해 생산 됩니다. 지난 10 년간에서 광고의 치료로 치료 접근 Aβ 생산³의 예방에 집중 했다. 연구의 대부분은 애플 리 케이 션의 γ-secretase 분열을 배제 하 고 그로 인하여 Aβ의 생산 또는 β-및/또는 γ-secretase 활동⁴의 금지를 감소 수 있는 α-secretase 활동의 확대에 집중 했다. 불행히도, 피할 수 없는 부작용에 β 또는 γ secretases 결과의 비 선택적인 억제는 β와 γ-secretase^5,6의 다른 생리 적인 기판의 기능 방해 예정 이다. Γ-secretase 억제제에 관한 최근 연구 화학 및 유전 변조기 노치^{7의 필수적인 γ-secretase 중재 처리에 사소한 영향을 발휘 하는 동안 Aβ 생산을 통제할 수 있는 수의 발견 보고 그러나 ,,89,10,11,12},, 성공적인 치료 아직 개발 하지 않은. 따라서, 더 체계적인 스크린은 보증 소설 유전과 화학 한정자 선택적으로 γ-secretase 중재 애플 리 케이 션 처리를 조절 수 있습니다 발견.

Γ-Secretase 이상의 90 다른 막 정박 단백질을 쪼개로 알려져 있다. 이러한 기판 중 그 활동은 세포 운명 결정과 분화 개발¹³과정에 대 한 중요 한 단계가입니다. 선택적으로 변조 γ-secretase 촉매 응용 프로그램 부재에 처리에 영향을 미치는 노치의 처리 부작용에 대 한 최소화 노치 관련 γ-secretase 억제제의 필수적인 되며이 선택도 기본 요소가 될 것으로 생각 됩니다. 광고의 만성 치료에 대 한 잠재적인 γ-secretase 변조기의 생물학적 효능을 지정 합니다. 다양 한 arylsulfonamide 유도체, GSI-953 (begacestat) 등 BMS-708163 (avagacestat), γ-secretase^14,15의 강력 하 고 선택적인 억제를 전시 발견 되었습니다 되었습니다. 이전 연구는 APP와 노치의 γ-secretase 분열의 차동 저해 조합 vivo에서 유효성 검사 zebrafish¹⁶를 사용 하 여 양이 많은 ELISA 기반 분석 결과 사용 하 여 관찰 될 수 있다 설명 했다. 또한, 세포 기반 분석 결과 패러다임 γ-secretase 애플 리 케이 션 및 노치^17,18대의 잠재적인 기판 선택도 해결 하기 위해 설립 되었습니다. 여기 설명한 비슷한 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 최근에 발견 (D)의 소설 클래스-potently 노치를 살려주는 선택도¹⁹APP의 γ-secretase 분열을 조절 하는 leucinamides. 함께,이 연구의 제공의 증거-개념 γ-secretase의 기판 선택/가용성 화학 변조 및 실험 검증 대상이 될 수 있는 개념을 지 원하는 됩니다. 그러나, 이러한 분석 결과 플랫폼 종종 상대적으로 낮은 처리량 판독 및 약물 발견 프로그램에 대 한 산업 표준에 맞지 수 있습니다 노동 집약적인 접근에 의존 합니다.

우리는 최근 셀 기반 luciferase 취재 원 유전자 분석 실험 양적 γ-secretase 두 가지 기판, APP (응용 프로그램-C99)의 99 아미노 산 성 C 터미널 단편과는 세포 외의 촉매 활동을 확인할 수 있는 생성 된 도메인 삭제 노치 펩 티 드 (NΔE)입니다. 애플 리 케이 션-C99 및 NΔE γ-secretase 다양 한 분석 실험에서의 직접 기판으로 널리 사용 되었습니다 있다. 균일 하 고 일관 된 luciferase 리포터 유전자 분석 애플 리 케이 션-C99 또는 NΔE의 γ-secretase 분열에 대 한 생성, 우리 생성 한 HEK 파생 안정적인 셀 라인 (CG) constitutively Gal4 발기인 구동 반딧불 luciferase 기자 (표현 하 Gal4-Luc)와 Gal4/VP16 태그 애플 리 케이 션-C99 융합 단백질 (C99-GV). 또한, constitutively Gal4 루크와 Gal4/VP16 태그 NΔE (NΔE-GV)를 표현 하는 또 다른 HEK 파생 안정적인 셀 라인 (NG)를 생성 했습니다. 이러한 새로운 기판 전용 γ-secretase 분석 실험을 사용 하 여, 우리 이제 계량 하 고 γ-secretase 별개 기판 (애플 리 케이 션-C99 CG 세포에서) 또는 NG 셀에 NΔE로의 촉매 활동을 구별 하는 방법을 제공 합니다. 또한, 기판 전용 γ-secretase 분석 실험이 콘텐츠 심사 플랫폼에 도움이 되도록 설계 되었습니다. 이 새로 생성 된 γ-secretase 분석 도출 다음-세대 치료에 대 한 바람직하지 않은 노치 저해 하지 않고 Aβ 생산을 억제 하 여 인지 기능을 향상 시킬 수 있습니다. 있는 소설 γ-secretase 변조기의 발견에 대 한 길을 닦은 수 있습니다. 광고.

1. 해당 애플 리 케이 션-C99 또는 NΔE의 γ-Secretase 분열 하는 Luciferase 기자 신호 측정

참고: CG과 셀^20,21의 세대에 대 한 자세한 설명에 대 한 이전 게시를 참조 하십시오.

1. NG 또는 CG 셀 씨앗 (20, 000 셀/잘) 200 μ/잘 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 플러스 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 5 μ g/mL blasticidin, 250 μ g/mL 항생제 (예: 구성 된 성장 매체에서의 마지막 볼륨에 96-잘 microplates에 zeocin), 그리고 200 μ g/mL hygromycin B.
   1. hemocytometer 셀을 계산 합니다.
   2. 습도 CO₂ 배양 기에는 microplates를 전송 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
2. 각 우물에서 성장 매체의 100 μ를 제거 합니다.
3. 성장의 100 μ/잘 추가 중 0.2% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 2 μ M와 2 μ g/mL 항생물질을 포함 하 고 중간 CL-387,785, 2 μ M N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT), 또는 기타 관련 ErbB1/ErbB2 억제제.
4. 치료 CG 나 니 셀 24 h에 대 한 37 ° C에서 microplates에 품 어.
5. Microplates에서 150 μ/잘 성장 매체를 제거 합니다.
6. 추가 50 μ/잘 luciferase 분석 시 약 ( 테이블의 자료를 참조 하시기 바랍니다).
7. 발광 microplate 리더에는 microplates를 전송.
   1. 부드러운 동요와 5 분 동안 실 온에서 microplates을 유지 관리 합니다.
8. 반딧불 luciferase (FL) 결정-발광 발광 microplate 리더에 저장 된 미리 정의 된 프로그램을 사용 하 여 방출.
   1. 인스트루먼트 컨트롤 소프트웨어를 열고 (악기 자세한 재료의 표 참조).
   2. '도구' 메뉴에서 'Luminometry'를 선택 합니다.
      1. '매개 변수' 설정에서 세 시간에 대 한 방출 필터, 방출 조리개에 대 한 진드기 '정상' 입력 '1' '필터'를 선택 하 고 발광 읽기를 설정 하려면 '확인'을 클릭 합니다.
   3. '악기 제어' 탭에서 활성 프로토콜 목록 하 고 발광을 읽기 위한 사전 저장된 프로토콜을 선택 합니다.
   4. '라이브 디스플레이' 탭 아래 풀 다운 목록에서 확장을 정의 하 고 형식에 대 한 '로그' 또는 '선'을 선택 합니다.
   5. '온도' 탭에서 접시 난방에 대 한 '끄기' 선택 합니다.
   6. 읽고 발광을 수행 하려면 '시작' 버튼을 클릭 합니다.
   7. 필요에 따라, 제어 소프트웨어 내에 포함 된 '탐색기'를 사용 하 여 스프레드시트 형식으로 결과 내보냅니다.

2입니다. γ-Secretase 활동의 정량화

1. CG에 의해 방출 하는 발광 신호 또는 NG 셀 100% 상대 γ-secretase 활동으로 혼자 1 μ g/mL 항생물질을 포함 하는 성장 매체에 0.1 %DMSO 치료를 정의 합니다.
   1. 성장 매체 항생물질을 포함 하지 않는 세포를 치료 하 여 cg로 또는 NG 셀에서 배경 발광을 견적 한다.
2. Luciferase 신호 1 μ g/mL 항생물질을 포함 하는 성장 매체와 교양 하는 CG 나 NG 셀에서 정상화 하 고 셀 DMSO 치료 CG 또는 NG에 의해 방출 된 luciferase 신호 DAPT의 어느 1 μ M CL-387,785 또는 1 μ M (100% 상대 γ-secretase 활동으로 2.1에서 정의).

CL 387,785에 의해 ErbB2 저해에 의해 애플 리 케이 션-C99의 처리 홍보 차동 수 있습니다. Γ -secretase 노치 분열에 영향을 주지 않고
양적 특정 γ-secretase 기판의 분해 분열을 측정할 수 있는 세포 기반 분석 결과 설정 하는 항생물질을 유도할 수 있는 C 말기 Gal4/VP16 태그의 안정적인 공동 transfection에 의해 HEK293 파생 CG 셀 라인 생성 응용 프로그램-C99 고 Gal4 발기인 구동 반딧불 luciferase 취재 원 유전자. 병렬 NG 셀 라인 NΔE의 γ-secretase 분열에 대 한 분석 결과를 또한 설립 되었다. NG 셀, 항생물질을 유도할 수 있는 C 터미널 Gal4/VP16 태그 NΔE와 Gal4 발기인 구동 luciferase 취재 원 유전자 안정적으로 공동 transfected HEK293 세포로 했다. 응용 프로그램-C99 CG 셀에서의 γ-secretase 절단, NG 셀에 NΔE의 γ-secretase 분열 처음 DAPT, 모든 γ-secretase 기판 (분열을 차단 하는 팬 γ-secretase 억제제의 다양 한 농도와 CG과 세포 치료에 의해 확인 되었다 그림 1)입니다. 데이터는 또한 그의 γ-secretase CG andNG 전시 세포 촉매의 유사한 수준에 설명 했다.

Γ-secretase 분열에 대 한 기판 관련 세포 기반 분석 실험의 효율성을 확인 하기 위해 우리는 ErbB1/2 듀얼 억제제 CL-387,785, 차동 변조 표시 되었습니다와 CG과 cellstreated에 발광 신호 검사 응용 프로그램-C99, NΔE²¹의 γ-secretase 분열. 우리는 이전 presenilin 1 (PS1)와 C99 방해 PS1 및 NΔE²¹사이 상호 작용의 부족 간의 단백질-단백질 상호 작용의 간섭으로 인해 선택적 γ-secretase 변조기로 CL-387,785를 확인. 여기, NG 셀에 NΔE의 베이스 아니었다 반면 CL 387,785 치료 효과적으로 애플 리 케이 션-C99 CG 셀에서의 처리를 차단 하는 데이터 보기에는 (그림 2) 영향을. 이러한 결과 높은 처리량 검열 플랫폼에 도움이 되는 형태로 C99 및 NΔE 분열 사이 구별에서 CG과 셀의 효과 보여 줍니다.

그림 1: 응용 프로그램-C99-특정 세포 γ-secretase 분석 결과 (CG 셀). CG 셀 시드 했다 96 잘 microplates (20000 셀/잘) 밤새 고 24 h에 대 한 37 ° C에서 1 μ g/mL 항생물질의 CL-387,785 또는 DAPT 1 μ M와 치료에. C99-GV의 γ-secretase 중재 베이스에서 파생 된 발광 100 μ/잘 luciferase 분석 실험 시 약의 추가 후 정량 했다. 차량 혼자 (0.1 %DMSO)로 치료 하는 세포에 의해 방출 luciferase 신호는 100% 상대 발광으로 설정 했다. 데이터는 3 개의 독립적인 실험에서 평균 ± SD로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 노치 특정 세포 γ-secretase 분석 결과 (기 셀). NG 셀 시드 했다 96 잘 microplates (20000 셀/잘) 밤새 고 24 h에 대 한 37 ° C에서 1 μ g/mL 항생물질의 CL-387,785 또는 DAPT 1 μ M와 치료에. NΔE-GV의 γ-secretase 중재 베이스에서 파생 된 발광 100 μ/잘 luciferase 분석 실험 시 약의 추가 후 정량 했다. 차량 혼자 (0.1 %DMSO)로 치료 하는 세포에 의해 방출 luciferase 신호는 100% 상대 발광으로 설정 했다. 데이터는 3 개의 독립적인 실험에서 평균 ± SD로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

광고에 대 한 aducanumab immunotherapy의 단계 1b 재판에서 유망한 결과 단단히 광고²² 의 병 인에 Aβ의 중요 한 역할을 설립 하 고 안티-Aβ 접근은 여전히 안티 광고 약물의 개발에 대 한 실행 가능한 전략을 제안. 여기, 우리는 애플 리 케이 션-C99 및 반딧불 luciferase 기자 시스템을 사용 하 여 NΔE의 γ-secretase 촉매 베이스 측정을 위한 세포 기반 분석 설명 합니다. 응용 프로그램-C99 및 NΔE는 두 개의 가장 잘 공부 γ-secretase 기판 함께 γ-secretase¹³의 병원 성 및 생리 활동을 나타냅니다. CL 387,785에 의해 ErbB2 downregulation 우선적으로 애플 리 케이 션-C99의 정상 수준을 줄일 수 있습니다 및 분 비 Aβ은 현재 연구에서 설명 하는 γ-secretase의 기판 관련 세포 분석 실험에 의해 입증 추가 우리의 발견 현재 프로토콜은 따라서 소설 γ-secretase 변조기의 발견에 대 한 효율적인 접근을 제공합니다.

이 γ-secretase 기판 관련 분석 결과 패러다임의 장점을 다각적인 있습니다. 예를 들어 이러한 기판 전용 γ-secretase 분석 실험에서 더 개발, 잠재적인 비 선택적 γ-secretase 억제제를 배제 하 고 최소화와 관련 된 양적 평가 제공 하는 예비 화면에 활용 될 수 있습니다. 잠재적인 부작용입니다. 이 방법에서 확인 된 활성 화합물의 생물 학적 효능 수 있습니다 다음 추가 확인 신경 세포 및 동물 모델 광고의 최근²¹에서 같이. 또한, CG과 안정적인 셀 라인의 동질성은 실험 결과의 재현성에 중요 합니다. 중요 한 것은, C99 GV 또는 NΔE GV의 항생물질을 유도할 수 있는 표정 어디 C99 또는 NΔE constitutively 표현 하는 다른 시스템에서 본 luciferase 기자 식의 채도 효과적으로 방지할 수 있습니다. Γ-secretase 활동, γ-secretase의 비교 두 개의 서로 다른 기판 (애플 리 케이 션-C99 사이 분열 활동 수와 직접 상관 관계가 매우 안정적이 고 일관 된 luciferase 신호 결과이 항생물질을 유도할 수 있는 식 NΔE), 대 또는 실험 실험에서 매우 효율적인 방식으로. 최상의 결과 얻으려면, 항생물질 솔루션의 활동 모니터링 해야 주기적으로 (선호 달 당 한 번) 최적의 유도 효율을 보장 하기. 추가 장점으로 이러한 플랫폼의 동질성 제정 Renilla luciferase 식 반딧불 luciferase 정상화에 대 한 필요가 없습니다. 마지막으로, 1 µ M avagacestat와 CG과 세포 치료, 노치 살려주는 알려진된 γ-secretase 억제제 분석 결과 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다.

현재 시험 플랫폼을 사용 하 여 하나의 가능한 경고는 γ-secretase 기판의 overexpression 및 우리의 분석에 transcriptional 기자의 후속 채도 마스크 억제 활동에 기여 하 고 어긋나기에 몇 가지 가능성이 있다 다른 분석 실험²³중의 억제 힘 이 잠재적인 합병증 같이 최근²¹노치를 살려주는 γ-secretase 억제제의 효능을 확인 하기 위해 2 차 분석 결과 플랫폼의 필요성을 밑줄. 이 방법의 또 다른 잠재적인 한계는 주어진 이상의 90 다른 막 단백질 γ-secretase 기판 확인 되었습니다, 현재 분석 결과 플랫폼을 제공 하지 않습니다 γ-secretase 기판 선택도의 완전 한 단면도 이다. 이 라인을 따라 노치 분열의 저해를 살려주는 γ-secretase 억제제를 평가 하는 최고의 판독 되지 않을 수 있습니다. 주의 취해야 한다는 사실 때문에 그 avagacestat, 노치 살려주는 γ-secretase 억제제, 실패 인지²⁴, 그리고 그것을 개선 하는 노치 저해 팬 γ-secretase 억제제 ^{와 관련 된 독성에 대 한 유일한 근거를 되지 않을 수도 있습니다. 25}. 새로 확인된 된 노치를 살려주는 γ-secretase 억제제 avagacestat에 존재 하지 않은 새로운 화학 엔터티를 보유 하 고 이들이 억제제의 효능 수 경우이 새로운 접근 방식에 의해 식별 안타의 진정한 유틸리티에 경첩 수 vivo에서 광고의 모델을 사용 하 여 유효성 검사.

결론적으로, 우리 제시 접근 크게 임상 사용을 위한 애플 리 케이 션-C99-특정 γ-secretase 억제제/변조기 개발을 신속히 처리할 수 있습니다 믿습니다. 있다 아무 거부는 γ-secretase 억제제 노치를 살려주는 여부, 잠재적으로 바람직하지 않은 내성 이어질 것 이라고 광고 환자에서 독성을 시작할 수 및 결과 이전²⁶제안. 그러나, 새로운 화학 도구와 향상 된 유효성 검사 체계²¹의 도입, γ-secretase 해야 계속 해 서 탐험 더 많은 전 임상 및 임상 연구를 필요로 그것의 생 화 확 적인 복잡성 때문에 매력적인 마약 대상의 광고에서 치료 관련성입니다.

저자는 공개 없다.

저자는 기술 지원에 대 한 연구소의 휴대 및 Organismic 생물학, 학계 Sinica의 핵심 시설을 감사합니다. 이 연구는 과학과 기술, 대만 (Y. f 가장 103-2320-B-001-016-MY3에 의해 지원 되었다 L.), 의약품 개발-기술 플랫폼 축 지원의 변환 혁신 프로그램 (Y. 플로리다에 NP7) 체계, 그리고 학계 Sinica (하 영-플로리다).