Иммуно люминесцентные маркировки микротрубочек и Centrosomal белков в Ex Vivo кишечных тканей и 3D в Vitro кишечных Organoids

Мы представляем протоколы для изоляции кишечных 3D конструкций из ткани в естественных условиях и в пробирке подвале матрица встроенного organoids и подробно различные фиксации и пятная протоколы, оптимизированный для иммуно маркировки микротрубочек, centrosomal и соединительной белки также как ячейки маркеры, включая стволовых клеток белка Lgr5.

Появлением organoids 3D в пробирке , которые имитируют в vivo ткани архитектуры и морфогенез значительно расширить возможности для изучения ключевых биологических вопросов в клетке и биологии развития. Кроме того organoids вместе с последних технических достижений в ген редактирования и вирусных генов доставки обещает продвижения медицинских исследований и разработки новых препаратов для лечения заболеваний. Organoids выращенных в пробирке в подвале матрицы обеспечивают мощную модель системы для изучения поведения и функции различных белков и хорошо подходят для жить изображений меткой флуоресцентных белков. Однако создание выражения и локализации эндогенного белков в ex vivo ткани и в пробирке organoids имеет важное значение для проверки поведения тегами белков. С этой целью мы разработали и изменения тканей изоляции, фиксации и иммуно маркировки протоколы для локализации микротрубочек, centrosomal и связанных с ней белков в ex vivo кишечника ткани и в пробирке кишечных organoids. Целью было для фиксатором для сохранения 3D архитектура organoids/ткани также сохраняя антигенностью антитела и позволяет хорошее проникновение и распродажа фиксатором и антител. Воздействие холода depolymerizes все, но стабильные микротрубочки и это является ключевым фактором при изменении различных протоколов. Мы обнаружили, что увеличение Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) концентрации от 3 мм до 30 мм дал эффективное отряд ворсинки и склепы в тонкой кишке, в то время как ЭДТА 3 мм было достаточно для толстой склепы. Протокол фиксации развитых формальдегида/метанола дали очень хорошие структурных сохранения сохраняя при этом антигенностью для эффективного нанесения этикеток микротрубочек, актина и конец связывающих белков (EB). Он также работал для centrosomal белка ninein, хотя протокол метанола работал более последовательно. Далее мы установили, что фиксация и иммуно маркировки микротрубочек и связанных белков может быть достигнуто с organoids изолированы от или оставаясь в подвале матрицы.

Формирование эпителия с apico базальной полярности является основополагающим процесс развития и включает в себя драматической реорганизации микротрубочек и centrosomal белков. Массив радиальные микротрубочек, вытекающих из расположен centrosomal микротрубочки, организует центр (КТВМ) видно в многих животных клеток, и это хорошо подходит для сравнительно плоские клетки. В противоположность этому столбчатых эпителиальных клеток, таких, как те из кишечника, собрать-радиальная transcellular микротрубочки массивы, которые лучше поддерживать форму и специализированные функции этих клеток. Это драматической реорганизации микротрубочек достигается Центросома, переход к вершине и апикальной не centrosomal MTOCs (n-MTOCs) формирования, который становится ответственным за Анкоридж микротрубочек transcellular,^1,,^{2 , 3 , 4 , 5}.

Большая часть наших знаний эпителиальных дифференциации и связанные микротрубочек реорганизации пришла из исследования 2D в vitro слои клеток, которые не отображаются в vivo ткани архитектуры. Разработка 3D в vitro органоид культур, впервые,⁶Clevers и коллегами, представляет собой крупные технологические улучшения как они имитируют в vivo архитектуры и развития. Иерархия эпителиальных дифференциация проявляется в кишечнике; Стволовые клетки в нижней части склепы порождают незрелых транзита, усиливая клетки, которые размножаются и постепенно дифференцировать как они мигрируют вверх склеп на небольшой кишечных ворсинок или толстой поверхность, где они становятся полностью дифференцированной до того, как сарай в просвете⁷. Важно отметить, что это реплицируется в кишечных organoids, где клетки от ниши стволовых клеток пролиферировать образуя кисты, которые впоследствии сформировать бутоны склеп как с помощью стволовых клеток на дне и дифференциации, постепенно продвигается к кисты региона, который становится ворсинок как⁸. Кишечные органоид поэтому представляет мощную модель для изучения не только микротрубочек и centrosomal реорганизации во время дифференцировки эпителия, но многочисленные другие белки, а также обеспечивая идеальную платформу для скрининга наркотиков и продовольствия соединений потенциал терапевтические преимущества^9,10.

Organoids хорошо подходят для жить изображений меткой флуоресцентных белков и оба забивные и organoids нокаут-может быть создан с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования^11,12. Однако создание выражения и локализации эндогенного белков для изучения важно, особенно для проверки поведения тегами белков. Иммуно маркировки 3D organoids, выращенных в подвале матрицы или ex vivo изолированные ткани является более сложным, чем клетки выросли в культуре блюда в 2D. Протокол фиксации необходимо сохранить деликатные 3D архитектура organoids сохраняя антигенностью антитела (то есть, epitopes для связывания антител). К примеру параформальдегида 4% (PFA) обычно используется как фиксатор, но пока это относительно быстрый обязанности фиксатором и дает хорошие морфологические сохранения, в наш опыт это часто приводит к потере антигенностью и не подходит для многих centrosomal антител. Следует также рассмотреть фиксатором и антител способность проникать 3D конструкций и тканей. С этой целью мы изменили и развитых протоколы для изоляции тканей и косвенные иммуно маркировки 3D в vitro organoids и ex vivo изолированных кишечных тканей. Мы опишем, как изолировать малого кишечника склепы и ворсинки и толстой ткани, и включить протокол для изоляции 3D organoids как альтернатива для фиксации и иммуно маркировки в матрице подвале. Мы представляем три альтернативных фиксации протоколы для иммуно маркировки микротрубочек и centrosomal белков, таких как ninein, и микротрубочек плюс конец отслеживания белков (+ советы), таких как белки EB и клип-170 (см. также ссылки^{8, 13}). Мы также обсудить достоинства и недостатки, связанные с каждым протоколом.

Все методы, описанные здесь проводились согласно руководящим принципам учрежденческой лицензии университета Восточной Англии.

1. изоляция кишечника ткани

1. Изоляция толстой склепы иммуно-маркировки (см. рис. 1, схема)
   1. Усыпить мыши (с использованием CO₂ асфиксия) и удалите двоеточие (начало в caecum и извлечение каудально) с рассечения ножницы и щипчики¹⁴.
   2. Очистка содержимого толстой кишки с фосфатный буфер (PBS) с помощью стеклянной пипетки с резиновую грушу. PBS: натрия хлорид (8,0 г/Л), хлорид калия (0,2 г/Л), динатрия гидрогенфосфат (1,15 г/Л) и калия дигидрогенфосфат (0,2 г/Л), при pH 7,3.
   3. Используя металлический стержень (2,4 мм) или в конце стеклянной пипетки, удерживая один конец толстой трубе мягко скользящие ткани через стержень/пипетки, таким образом everting толстой ткани, так что эпителия в настоящее время на улице.
      Примечание: Если это не представляется возможным откройте толстой кишки с ножницами и нарезать на кусочки 5 мм.
   4. Передавать everted толстой кишки или куски конические Тюбик 50 мл, содержащие 40 мл PBS.
   5. Инвертировать трубки несколько раз для дальнейшего удаления кишечного содержимого, слизи и т.д.
   6. Передача части толстой кишки до 40 мл 3 мм ЭДТА в PBS и инкубации при комнатной температуре (RT) за 15 мин.
      Примечание: Разбавляют 0,5 М ЭДТА рН 8,0 шток с PBS.
   7. Встряхните, чтобы удалить слизь и передачи части толстой кишки на 50 мл Конические трубки, содержащий свежие 40 мл 3 мм ЭДТА в PBS. Инкубируйте 35 мин на RT.
   8. Передача части толстой кишки до 10 мл PBS в 50 мл Конические трубки и встряхнуть для 30 s выпустить склепы (склеп дробь).
   9. Удаление части толстой кишки из трубки и место обратно в 3 мм ЭДТА, в случае, если требуется дальнейшая изоляция. Центрифуга оставшиеся фракции склеп на 300 g x 5 мин.
   10. Удаление 5 мл супернатант и Ресуспензируйте Пелле склеп в остальные тома 5 мл.
   11. Соблюдайте под стереомикроскопом с зумом (50-100 крат) проверить наличие толстой склепы.
       Примечание: Если есть не склепы настоящее затем инкубировать Колон/штук в 3 мм ЭДТА в PBS для еще 30 минут и повторите шаги 1.1.8 - 1.1.11.
   12. Центрифуга склеп дроби на 300 g x 5 мин.
   13. Удалите все супернатант для получения гранул склеп и немедленно приступить к фиксации (раздел 3).
2. Изоляции малых кишечные крипты и Вилли для иммуно маркировки (рис. 2)
   1. Усыпить мыши (с использованием CO₂ асфиксия) и удалить тонкой кишки (проксимальной двенадцатиперстную кишку до терминала подвздошной кишки) с рассечения ножницы и щипчики¹⁴.
      Примечание: для просмотра различных секций тонкой кишки, то на данном этапе отделить и рассматривать отдельно. Смотрите Рисунок 1 и Таблица 1 схема и сроки.
   2. Очистить содержимое тонкой кишки с PBS с помощью стеклянной пипетки с резиновую грушу.
   3. Разрезать тонкой кишки с рассечения ножницами и место в 15 мл PBS в чашке Петри.
   4. Осторожно промойте intestine в PBS для удаления Люминал содержание не повреждая поверхность слизистой оболочки. Передать свежие Петри блюдо ткани и повторить PBS мыть.
   5. Кишечник нарезать 3-5 мм и передачи до 100 мм Петри, содержащих 15 мл 30 мм ЭДТА в PBS и инкубировать на 5 мин на RT. Альтернативно Инкубируйте 30 мин в 3 мм ЭДТА в PBS.
   6. Часть 1 (Villi изоляции): передача части кишечника в 10 мл PBS в 50 мл Конические трубки, shake энергично для 10 s и вылейте в 100 мм Петри. Проверьте дроби для изолированных Вилли под стереомикроскопом. На данном этапе главным образом Вилли должны присутствовать, но это может варьироваться от изоляции.
      Примечание: Для предотвращения изолированных Вилли/склепы придерживаться пластика, чашки Петри и коллекции трубы должна быть предварительно покрытых с плода Bovine сыворотки (ФБС). Налейте FBS блюда или трубы и немедленно удалить его. Приведена Таблица 1 сроки направляющие для каждой фракции.
   7. Передача части кишечника обратно в 30 мм ЭДТА в PBS и инкубировать в течение 5 мин. Во время инкубации Соберите часть 1 в 15 мл Конические трубки (ветротурбин с FBS) и центрифуги на 300 x g 5 мин.
   8. Часть 2: Кишечные штук передать конические Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл PBS, shake энергично для 20 s, а затем налить в чашку Петри 100 мм. Проверьте часть под микроскопом. Как правило, на данном этапе смешанной культуре ворсинки и склепы присутствуют (рисунок 2A).
   9. Передача кишечных куски обратно в 30 мм ЭДТА в PBS и инкубировать еще 5 мин. Во время этой инкубации Пелле фракция 2 в 15 мл Конические трубки (ветротурбин с FBS) на 300 x g 5 минут удалить супернатант из фракций 1 и 2 не нарушая гранулы и немедленно приступить к фиксации (шаг 3).
   10. Часть 3 (склеп изоляции): передача части кишечника в 10 мл PBS в 50 мл трубки, встряска для 20 s и вылейте в 100 мм Петри. Проверьте часть под микроскопом. На данном этапе часть будет содержать преимущественно склепы (рис. 2B).
   11. Часть 4: Передача части кишечника в 10 мл PBS, трясти за 20 сек и вылейте в 100 мм Петри. Проверьте часть под микроскопом. На этом этапе должны присутствовать только склепы.
   12. Часть 5: Передача части кишечника в 10 мл PBS, трясти за 20 сек и вылейте в 100 мм Петри. Проверьте часть под микроскопом. Обычно на этом этапе, очень немногие склепы извлекаются. Если извлекаются более нескольких склепов, затем продолжите с малую 6^тыс .
       Примечание: Если чистая склеп населения (например, для генерации органоид), затем используйте стрейнер ячейки 70 мкм для удаления любых нетронутыми Вилли из склепа обогащенный фракции.
   13. Соберите фракции 3-5 в отдельных 15 мл конические трубы и центрифуги на 300 x g за 5 мин.
   14. Проверьте гранулы фракции 3 - 5 и удалить supernatants не нарушая гранулы и немедленно приступить к фиксации (раздел 3).

2.Изоляция кишечных Organoids с подвале матрица куполов в 24-ну пластины

Примечание: Формирование organoids в подвале матрица купола было описано в других разделах¹².

1. Герб скважин с куполом матрица подвале согласно инструкциям производителя.
2. Мыть Уэллс, содержащие подвале матрица купола с 500 мкл PBS.
3. Добавьте холодной 250 мкл раствора восстановления клеток (4 ° C) для каждой скважины (см. Таблицу материалы).
   Примечание: Решение восстановления холодной камере будет деполимеризуют но все стабильные микротрубочки.
4. Скрип подвале матрица купола с помощью микропипеткой P1000 и тщательно Пипетка вверх и вниз на протяжении также распад и удалить подвале матрица из пластика.
5. Соберите супернатант в 1,5 мл низкой привязки microcentrifuge трубы.
6. Инвертировать 1,5 мл трубки низкого привязки несколько раз и проверьте под микроскопом, organoids были изолированы и свободного перемещения и не в кусты. Держите трубку под стереомикроскопом и просмотр под увеличением низкой (50 X).
7. Пелле organoids центрифугированием на 1000 x g 5 мин на RT.
8. Удаление восстановления реагента и немедленно приступить к фиксации (шаг 3).

3. Фиксация изолированных кишечных тканей и Organoids

1. Фиксация метанола
   1. Ресуспензируйте фракции изолированных кишечные крипты/ворсинок в 10 мл и organoids в 1 мл метанола при-20 ° C.
   2. Инкубировать склепы/Вилли/organoids при-20 ° C в морозильник на 15 мин и инвертировать трубки каждые 5 мин.
   3. Пелле склепы, ворсинки и organoids центрифугированием на 1000 x g за 5 мин.
   4. Удаление метанола и добавление моющего раствора (1 мл для organoids и 10 мл для отдельных крипта/ворсинок фракций). Моющий раствор либо может состоять из PBS с 1% сыворотки или PBS с 0.1% моющего средства и 1% сыворотки.
      Примечание: Использование сыворотки от того же вида, что и вторичные антитела. Например если вторичные антитела были сформированы в козла затем используйте козьего сыворотки.
   5. Сразу же центрифуга склепы/Вилли/organoids на 1000 x g 5 мин в гранулах.
   6. Удаление моющего раствора и Ресуспензируйте склепы, ворсинки и organoids в свежих моющий раствор.
   7. Место на вращателе трубки с скорость, равным 20 об/мин. Вымойте клетки для в общей сложности 1 h, гранулирование склепы, ворсинки и organoids центрифугированием (1000 x g 5 мин) каждые 15 мин и Замена промывочного раствора.
      Примечание: Если трубка ротатор недоступен затем Инвертируйте трубы вручную каждые 5 мин до Ресуспензируйте отдельных культур.
2. Фиксация формальдегида/метанола
   Примечание: Ручка фиксативов и формальдегида в зонта.
   1. Ресуспензируйте изолированных склепы/Вилли в 10 мл или organoids в 1 мл-20 ° C фиксирующие раствора (9.2 мл метанола с 800 мкл раствора формальдегида).
   2. Исправьте склепы, ворсинки и organoids при-20 ° C в морозильник на 15 мин и перевернуть трубку каждые 5 мин.
   3. Пелле склепы, ворсинки и organoids центрифугированием на 1000 x g за 5 мин.
   4. Удаление формальдегида/метанола и добавить моющий раствор (1 мл для organoids или 10 мл для фракции изолированных склепы/ворсинок). Моющий раствор либо может состоять из PBS с 1% козьего сыворотки или PBS с 0.1% моющего средства и 1% сыворотки.
   5. Центрифуга на 1000 x g за 5 мин до Пелле склепы, ворсинки и organoids.
   6. Удаление моющего раствора и Ресуспензируйте в свежих моющий раствор.
   7. Место на вращателе трубки с скорость, равным 20 об/мин. Вымойте клетки для в общей сложности 1 h, гранулирование склепы, ворсинки и organoids центрифугированием (1000 x g 5 мин) каждые 15 мин и Замена промывочного раствора.
3. Фиксация PFA
   Предупреждение: PFA порошок и решения должны обрабатываться в зонта.
   Примечание: В большинстве случаев 4% используется ПФА в PBS, но в зависимости от сохранения антитела антигенностью, могут быть использованы более низкой концентрации.
   1. Ресуспензируйте изолированных гранулированных склепы/Вилли в 10 мл 4% PFA и Инкубируйте на RT 1 h, и изолированных гранулированных organoids в 1 мл 4% PFA и Инкубируйте 30 мин. В обоих случаях Инвертируйте трубки каждые 10 мин.
   2. Пелле склепы, ворсинки и organoids центрифугированием на 1000 x g за 5 мин.
   3. Удаление PFA и добавление моющего раствора (1 мл для organoids и 10 мл для изолированных склепы/Вилли). Моющий раствор состоит из PBS с 0.1% моющего средства и 1% сыворотки.
   4. Центрифуга на 1000 x g за 5 мин до Пелле склепы/Вилли/organoids.
   5. Удаление моющего раствора и Ресуспензируйте в свежих моющий раствор.
   6. Место на вращателе трубки с скоростью, равным 20 об/мин. Вымойте клетки для в общей сложности 1 h, гранулирование склепы, ворсинки и organoids центрифугированием (1000 x g 5 мин) каждые 15 мин и Замена промывочного раствора.
      Примечание: Если трубка ротатор недоступен затем Инвертируйте трубки вручную каждые 5 мин до Ресуспензируйте отдельных культур.
   7. Антиген извлечение (необязательный шаг рекомендуется для фиксации PFA)
      1. Пелле склепы, ворсинки и organoids центрифугированием на 1000 x g 5 минут и удалить супернатант.
      2. Добавление 1-10 мл 10 мм цитрат натрия pH 6.0 (предварительно нагревают до 80 ° C) и Инкубируйте на 80 ° C в течение 20 мин.
      3. Пелле склепы, ворсинки и organoids центрифугированием на 1000 x g 5 минут и удалить супернатант.
      4. Добавление 1-10 мл свежего 10 мм цитрат натрия pH 6.0 (предварительно нагревают до 80 ° C) и Инкубируйте на RT на 20 мин.
      5. Пелле склепы, ворсинки и organoids центрифугированием на 1000 x g 5 минут и удалить супернатант.
      6. Стирать в 1-10 мл PBS с 1% сыворотки и повторять, далее 3 раза грануляции склепы, ворсинки и organoids центрифугированием (1000 x g 5 минут) перед добавлением свежей промывочного раствора.

4. Блокирование шаг

1. Сделать блокировки решение: добавить 10% видов вторичного антитела сыворотки крови в PBS (необязательно: добавить 0,1% моющего средства).
2. Пелле склепы, ворсинки и organoids центрифугированием (1000 x g 5 мин) и удалить супернатант.
3. Добавить 5-10 мл блокирования решения в зависимости от количества необходимых образцов (см. Примечание ниже). На данном этапе разделение склепы/Вилли/organoids решение отдельных труб (1,5 мл низкой привязки microcentrifuge трубки с пробирки, содержащие 0,2 - 1 мл) для окрашивания с различных антител.
   Примечание: Каждой фракции изолированных склепы/Вилли даст между 5-10 примеров, которые могут быть использованы для различных меток комбинации в зависимости от размера гранул. В идеале размером гранул от 2-4 мм требуется для каждого образца.

5. основное антитело инкубации

1. Разбавьте первичного антитела (см. Таблицу материалы) в PBS, содержащие 10% сыворотки и 0,1% моющего средства. Между 100-200 мкл на сэмпл пробки microcentrifuge требуется решение основное антитело.
2. Удалите блокирующие решение центрифугированием (1000 x g 5 мин).
3. Ресуспензируйте склепы/Вилли/органоид Пелле в решении основного антитела и Инкубируйте на 4 ° C на ночь с помощью трубки ротатор (20 мин) держать склепы, ворсинки и organoids в суспензии.
4. Следующий день: вернуть образцы RT 1 h на вращателе трубки (20 мин).
5. Пелле образца центрифугированием (1000 x g 5 мин) и удалите решение основное антитело.
6. Добавить 1 мл моющего раствора и Ресуспензируйте склеп/ворсинок/органоид окатышей.
7. Немедленно удалите решение центрифугированием (1000 x g 5 мин).
8. Добавить свежие промывочного раствора 1 мл и спина клетки на вращателе трубки (20 мин) 2 часа. Измените промывочный раствор центрифугированием каждые 30 мин как шаг 5.7.

6. Вторичное антитело инкубации

1. Разбавленных вторичных антител (см. Таблицу материалы) в PBS с 10% сыворотки и 0,1% моющего средства. За образец пробки microcentrifuge требуется около 200 мкл раствора вторичного антитела.
   Примечание: Высоко кросс поглощается антитела должны использоваться для снижения реактивности вторичных антител в мыши склеп/ворсинок/органоид.
2. Центрифуга на 1000 x g 5 мин Пелле склепы, ворсинки и organoids и Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл раствора вторичного антитела.
3. Спин трубы на вращателе трубки (20 мин) на RT 1 h.
4. Центрифуга на 1000 x g 5 мин Пелле склепы, ворсинки и organoids и удалить supernatants (без привязки к вторичные антитела).
5. Ресуспензируйте гранулы в промывочный раствор и немедленно центрифуги на 1000 x g за 5 мин до Пелле склепы, ворсинки и organoids.
6. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл свежего промывочного раствора.
7. Спина на трубку ротатор (20 мин) на RT для 1,5-2 ч, изменив промывочного раствора каждые 20-30 мин, как описано ранее 6,3-6,6.

7. Ядерная пятно

1. Разбавьте ядерной пятно в промывочный раствор (в соответствии с протоколом производителя), например DAPI или "Хёхст". Например: DAPI Стоковый раствор (20 мг/мл), разбавленных 1:10 000. Стоковый раствор может храниться в аликвоты при-20 ° C.
2. Центрифуга на 1000 x g 5 мин для пеллет склепы, ворсинки и organoids и удаления моющего раствора.
3. Ресуспензируйте гранулы в решении ядерных изображение.
4. Спина на трубку ротатор (20 мин) на RT за 10 мин.
5. Центрифуга на 1000 x g 5 мин Пелле склепы, ворсинки и organoids, удалить решение ядерных пятно и Ресуспензируйте гранулы в промывочный раствор.
6. Спина на трубку ротатор (20 мин) на RT за 30-60 мин, изменив промывочного раствора каждые 10 мин.

8. Монтаж изоляции склепы, ворсинки и Organoids

1. Центрифуга на 1000 x g 5 мин Пелле склепы, ворсинки и organoids и удалить все промывочного раствора.
   Примечание: Если гранулы расходится, затем центрифуга для снова.
2. Добавьте 2 капли установления жесткий монтаж СМИ с antifade агента в гранулы.
3. Вырезать в конце микропипеткой Р200 и тщательно Ресуспензируйте гранулы в средствах массовой информации монтажа. Избегайте возникновения пузырей.
   Примечание: Изолированные органоид культуры очень важно; Убедитесь в том, чтобы Ресуспензируйте полностью.
4. Используйте микропипеткой для передачи смесь склепы/Вилли/organoids в СМИ решения монтажа и распределять в линию вдоль центра микроскопа.
   Примечание: Линия не должны быть длиннее, чем Стекло покровное, которая должна использоваться. Проверьте с помощью стереомикроскопом ли склепы, ворсинки и organoids хорошо распространилась на слайде и не слипаются.
5. Осторожно поместите крышку стекло над верхней частью; Избегайте возникновения пузырей.
6. Место стеклянное скольжение в слайд книги и хранить в холодильнике на ночь для монтажа СМИ установить до анализа на конфокального микроскопа.
   Примечание: Для антитела мыши окрашивание ткани мыши, использовать коммерческие иммунофлюоресценции комплекта (см. Таблицу материалы). Замените блок 10 мин с белком, блокирующие решение следуют 1 ч инкубации с блокировки реагент, который поставляется с комплектом блокировки шаг (раздел 4). Затем на шаге 5,8 (в середине стирка) добавьте 1 ч инкубации с флуоресцентным сигнала усилитель реагента. Затем используйте комплект реагентов в люминесцентных разрежающего (другие вторичные антитела могут также использоваться в сочетании с этого реагента). Инкубировать как указано выше и исходить из шаг 6 с остальной частью протокола.

9. Фиксация и иммуно маркировки Organoids в подвале матрица

Примечание: Organoids предназначенные для фиксации и иммуно маркировки оставаясь в пределах матрицы подвале были получены в подвале матрица купола на вершине круглые стекло coverslips в 24-ну пластине (один купол на хорошо). Органоид подвале матрица купола были обработаны в течение 24-ну пластины путем добавления и удаления различных решений.

1. Удалите носитель из скважин и добавить фиксатором; Оставьте на 1 час.
2. Снимите фиксатор и стирать в PBS, содержащей 1% сыворотки и 0,1% моющего средства для 2 h, меняется каждые 30 мин.
3. Удаление промывочный раствор и блока в PBS с моющим средством сыворотки и 0.1% 10% за 1 час.
4. Разбавьте антитела в PBS с 1% сыворотки или PBS с 1% сыворотки и 0,1% моющего средства.
5. Удалять блокирующие решение и добавить 100-200 мкл основное антитело решение (см. Таблицу материалов) для каждой скважины.
   Примечание: важно удалить все блокирующие решение не для разбавления антитела далее.
6. Установите пластину в холодильнике и инкубировать на ночь при 4 ° C
7. Затем оставьте на RT для 1-2 ч.
8. Удалите раствор антител и мыть за 2-3 ч, изменяя промывочного раствора каждые 20 мин.
9. Удалите все промывочный раствор и добавить 100-200 мкл вторичные антитела разбавленного (см Таблицы материалы) в PBS с 1% сыворотки; инкубировать 1 час на RT.
10. Удалите раствор вторичных антител и мыть за 2 ч, меняется каждые 20 мин.
11. Удаление промывочный раствор и добавить DAPI решение; Оставьте на 10 мин на RT. использования DAPI Стоковый раствор (20 мг/мл) разводят в 1:10, 000.

Изоляция кишечных тканей для иммуно маркировки
Протоколы изоляции описанных ткани для толстой и тонкой кишки были оптимизированы для сохранения и иммуно маркировки микротрубочек и связанных белков, но не для жизнеспособности стволовых клеток и органоид поколения (рис. 1 и Таблица 1 ). Цель состояла в том, чтобы генерировать склеп и ворсинок фракций, которые были как очистить (лишенная слизи и другие ткани) как можно скорее, при сведении к минимуму воздействия ЭДТА и холодной для сохранения структуры и предотвращения деполимеризацию микротрубочек с лед холодной решениями, которые вызывают деполимеризации но все стабильные микротрубочки. Рисунок 2 показывает примеры изображений фракции 2 и 3 от изолированных малого кишечника ткани, с фракция 2, содержащий смесь ворсинки и склепы (рисунок 2A, B), а часть 3 содержит главным образом склепы (рис. 2 c D).

Фиксация и иммуно маркировки изолированных кишечника ткани
Отдельных или комбинированных фракций были затем обработаны для фиксации и иммуно обозначенного через ряд шагов, включая фиксацию, моющих средств, блокирование, антител и мытья решения, прежде чем вновь приостановить окончательное Вилли/склепы Пелле в СМИ монтажа, перенос к слайдам и покрытие с coverslips стекла. Склепы и Вилли были затем отражаться на конфокального микроскопа.

Хорошее сохранение и маркировки микротрубочек и актина ворсинки и склепы было достигнуто следующим: сочетание фиксации формальдегида/метанола при-20 ° C, повторил мытья в PBS, содержащие 0,1% моющего средства и 1% сыворотки и блокирование в PBS с 0.1% моющее и 10% сыворотки, следуют ночи инкубации на 4 ° C в первичных антител, а затем 2 h в вторичные антитела при комнатной температуре (рис. 3). Формальдегид/метанола фиксации также работал хорошо для маркировки + советы как EBs и клип-170 в изолированных склепы и Вилли (рис. 4). EB3 накопления в конце плюс микротрубочек (известный как кометы) были очевидны в склепы (рис. 4A), в то время как Ассоциация вдоль решетки стабильные микротрубочки могут рассматриваться в образцах Вилли (рис. 4 c). Собственный локализация клип-170 и p150^{клееный} (подразделение dynactin) было очевидно в апикальной n-MTOCs в изолированных Вилли (рис. 4В). Фиксация с протоколом формальдегида/метанола последовательно не работает для ninein локализации в изолированных кишечных тканей, с использованием нашего Pep3 антитела против мыши ninein. Однако фиксация метанола при-20 ° C, после чего же стирки и блокирования решения как формальдегид/метанола дали очень хорошие локализации ninein в изолированных склепы и Вилли (рис. 5; ссылка⁸). Интересно, что в то время как ninein сосредоточена на апикальной большое некоторые накопления на базе ячеек очевидно в некоторых ячейках изолированных склепы (рис. 5). Является ли это из-за неспецифичный Этикетировочный или следствием задержки процедуры изоляции фиксации (и таким образом затрагивающих сохранение) будет требуют дальнейшего изучения. Однако метанол исправлена (-20 ° C) криостат разделы Вилли (см. Рисунок 3bi ,⁸) также показал, что ninein в ячейке базы в некоторых клетках, предполагая, что ninein может также связать с базальной населением микротрубочек.

Фиксация и иммуно маркировки organoids изолированы от подвала матрица
Малые кишечника organoids были генерируется и вырос в подвале матрицы для трех недель или дольше (рис. 6A; ссылка^6,15). Холодный (4 ° C) решение восстановления клеток был использован для изолировать organoids из подвала матрицы. Depolymerized подвале решение матрица с organoids был передан трубы и центрифугируют до фиксации и иммуно маркировки. Это производства препаратов очень чистый и хороший доступ к organoids для различных решений. Дифференцированных клеток в пределах органоид ворсинок домены содержат стабильные микротрубочки apico базальная; они помечены хорошо в большинстве случаев (Рисунок 6B, C) и EB1 может также рассматриваться вдоль решетка микротрубочек (Рисунок 6E; ссылка¹³). Однако решение восстановления холодной камере может привести к деполимеризацию микротрубочек динамического, который был очевидным в некоторых образцах отсутствием EB1 комет (которые связывают к концу плюс растущий микротрубочек) в пределах базальной склеп доменов (Рисунок 6F ). В других образцах Астрал (динамический) микротрубочек были сохранены (рис. 6 d). Органоид изоляции до фиксации и иммуно маркировки также работал на соединительной белки, ninein, клип-170 и ячейки маркеры, такие как муцина бокаловидных клеток и chromogranin A для enteroendocrine клеток.

Фиксация и иммуно маркировки organoids в подвале матрица
Рисунок 7 показывает органоид на этапе кисты (CA–) и на ранней стадии развития склеп (D), фиксированного в формальдегид/метанола и иммуно меченых микротрубочек и ninein. Сохранение хорошего микротрубочек и маркировки, а также маркировки для ninein в апикальной n-MTOCs были очевидны. Рис. 8А, B показывает домен склеп в течение дня 6 органоид фиксированной с протоколом метанола и помечены для микротрубочки и EB1. Хорошее сохранение микротрубочек и EB1 комет было очевидно, предполагая Сохранение динамических микротрубочек.

Organoids были также фиксированной и иммуно меченых оставаясь в пределах матрицы подвале. Недостатки этой процедуры может быть плохое проникновение фиксатором и треппинг антител в подвале матрицы (рис. 8Б), хотя в обоих случаях менее часто когда 0,1% моющего средства был включен в фиксатором или вымойте решения. Кроме того, 4% PFA не заповедник подвале матрица хорошо но причиной его распустить, хотя это было не столь с 1% PFA.С другой стороны, фиксация метанола, иногда индуцированной органоид краха.

Маркировка с некоторые антитела такие как против стволовых клеток маркер Lgr5 и Paneth ячейке маркер CD24 оказались безуспешными с протоколами PFA, метанола или формальдегид/метанола 4%. Однако, фиксации organoids в матрице подвал с 1% ПФА в PBS с 0.1% моющего средства при комнатной температуре в результате никто маркировки для Lgr5 и CD24 (рис. 9).

Рисунок 1: изоляции малых кишечные ворсинки и склепы. Схема из ключевых шагов в склепе изоляции до фиксации и иммуно маркировки и небольших кишечных ворсинок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: изолированные ворсинки и склепы от мыши кишечник. Brightfield Микроскоп изображения кишечных фракций, показывая Вилли (большие стрелки) и склепы (маленькие стрелки). (A, B) Часть 2 содержит смесь ворсинки и склепов, и сохранение морфологии ворсинок и склеп проявляется в B. (C, D) Дробь 3 показывает изоляции склепы и отсутствие ворсинки и нетронутыми склепы, включая отделенные склеп в C. Масштаб баров = 500 мкм (A, C); 100 мкм (B, D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: изолированные небольшие кишечных ворсинок и склеп фиксированной в формальдегид/метанола и иммуно меченых микротрубочек и актина. (A) схема эпителия ворсинок и склеп с различных типов клеток указано. Выделенные элементы указывают представителей регионов, отображаемого в B и C. (B, C) Конфокальный оптических разделы через часть ворсинок (B) и базальной склеп (C), изолированных от тонкой кишки с помощью 30 мм ЭДТА и фиксированной в формальдегид/метанола, промывают в PBS, содержащей 1% козьего сыворотки и 0,1% моющего средства, заблокированные в PBS содержит 10% козьего сыворотки и 0,1% моющего средства и помечены для микротрубочек с крыса моноклональные антитела анти тубулин (зеленый) и актина с кролика polyclonal антитела анти β-актина (красный). Хорошо сохранившиеся apico базальной связки микротрубочек очевидны в клетках ворсинок и склеп, и актина можно увидеть сосредоточены в регионе верхушечный, стоящих перед люмен (стрелка). Масштаб баров = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Изолированные небольшие кишечные крипты и Вилли фиксированной в формальдегид/метанола и иммуно меченых микротрубочек, EB3, p150^{клееный}и клип-170. Конфокальный оптических секции склеп и Вилли регионов изолированы от тонкой кишки с использованием 30 мм ЭДТА и зафиксированный в формальдегид/метанола, промывают в PBS, содержащие 10% козьего сыворотки и 0.1% моющего средства, заблокированные в PBS, содержащие 10% козьего сыворотки и 0.1% моющего средства, и иммуно помечены. (A) помечены кролика polyclonal α-тубулина антитела (красный) и крыса моноклональных антител EB3KT36 (зеленый) и витражи для ДНК с DAPI (синий) показаны apico базальной микротрубочки и EB3 комет. Перевернутый один канал изображения ясно показывает EB3 комет во всем клеток базальной склеп, предлагая хорошее сохранение динамики, а также стабильные микротрубочки. (B) ворсинок, эпителиальные клетки помечены кролика polyclonal антитела клип-170 (красный, см. также ссылка¹⁶) и мыши моноклональные p150^{клееный} антитела (зеленый) показаны апикальной Сопредседатель локализации. Ниже приведены изображения Перевернутый один канал. (C) клетки ворсинок помечены кролика polyclonal α-тубулина антитела (красный) и крыса моноклональные антитела EB3-KT36 (зеленый) и витражи для ДНК с DAPI (синий) показаны apico базальной микротрубочек с EB3 вдоль решетки. EB3 решетки Ассоциация выделяется увеличенного изображения в то время как перевернутый один канал изображения предлагает EB3 комет и решетки ассоциации. Масштаб баров = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: изолированной толстой склеп фиксированной в метаноле, иммуно меченых ninein и E-Кадгерины и витражи с DAPI. Конфокальный оптическая часть базальной и усилительных транзита региона склепа изолированы от толстой кишки с помощью 3 мм ЭДТА и фиксированной в метаноле, промывают в PBS, содержащей 1% козьего сыворотки и 0.1% моющего средства и заблокировали в PBS, содержащие 10% козьего сыворотки и 0,1% моющего средства. Склеп был назван с кролика polyclonal ninein антител (Pep3, см. также ссылка⁸, красный) и мыши моноклональные антитела E-Кадгерины (зеленый) и витражи с DAPI (синий). Перевернутый одноканальный изображение показывает только ninein. На рисунке хорошо сохранившийся склеп с E-Кадгерины выявление наброски отдельных клеток и ninein сосредоточены на апикальной большое. Он предлагает хорошее проникновение фиксатором и антител и сохранение антигенностью. Шкалы бар = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: развитие органоид, фиксации и иммуно маркировки изолированных organoids. (A) этап контраст фото показаны различные стадии развития органоид из клеток агрегатов кисты с Бад посвящения и полностью сформирован organoids с доменами, крипта и ворсинок.(FB–) Конфокальный оптических разделы через organoids изолированы от подвала матрицы с помощью решения восстановления клеток при 4 ° C (10 мин) следуют фиксации формальдегида/метанола, промывание в PBS, содержащие 10% козьего сыворотки и 0.1% моющего средства, блокирование в PBS, содержащие 10% козий сыворотки и 0,1% моющего средства и иммуно маркировки микротрубочек, β-катенина и EB1. (B) киста органоид помечены микротрубочек (синий) и β-Катенин (красный) выявление сохранение хорошего микротрубочек и маркировки в большинстве клеток. (C) собственный apico базальной микротрубочек очевидны в эти увеличенные эпителиальных клеток от кисты органоид. (D) деления клеток, помечены для микротрубочек, показаны шпинделей, включая Астрал (динамический) микротрубочек (стрелка). (E, F) Ворсинок домен (E) и склеп домена (F) органоид регионы показаны некоторые EB1 маркировки вдоль решетки стабильные микротрубочки, особенно в ворсинок, в то время как очень немногие EB1 комет видны даже в пределах базальной склеп, предполагая, что dynamic микротрубочки не сохранились. Масштаб баров = 20 мкм (A); 2 мкм (D); 5 мкм (B, C, E-F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: Organoids фиксированной в подвале матрицы в формальдегид/метанола и иммуно меченых микротрубочек и ninein. Конфокальный оптических разделы organoids фиксированной в формальдегид/метанола, промывают и заблокирован в PBS, содержащие 10% козьего сыворотки и 0.1% моющего средства и помечены оставаясь в матрице подвале. (CA–) Органоид кисты помечены микротрубочек (зеленый) и ninein (Pep3; ссылка⁸, красный) и витражи с DAPI (синий) показаны объединенного изображения в A и перевернутый один канал изображения для микротрубочек (B) и ninein (C). Изображения показывают apico базальной микротрубочки и локализации апикального ninein, предлагая очень хорошо структурных сохранение органоид и проникновением антител, а также очистка свободного антител. (D, E) Органоид с разработкой склеп фиксированной и помечены как указано выше и снова показаны Потрясающе структурных сохранения, маркировки и Очистка антител. Собственный apico базальной микротрубочки и апикального n КТВМ ninein Локализация является очевидным и подчеркивается в увеличенного изображения (E) в штучной упаковке региона в D. Масштаб баров = 10 мкм (A-D); 5 мкм (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8: Organoids фиксированной в матрице подвал в метаноле и иммуно меченых микротрубочек и EB1. Конфокальный оптических разделы organoids фиксированной в метаноле, промывают и заблокирован в PBS, содержащие 10% козьего сыворотки и 0.1% моющего средства и помечены, оставаясь при этом в подвале матрицы. (A) киста домена с полностью развитой органоид помечены кролика polyclonal α-тубулина (красный) и мыши моноклональные антитела EB1 (зеленый), показаны apico базальной микротрубочек, шпиндели (стрелка) в два деления клеток и собственный EB1 комет. Очевидно, некоторые треппинга несвязанных EB1 антител. Однако наблюдается хорошая структурных сохранения и маркировки микротрубочек и EB1. Наличие EB1 комет предполагает, что динамические микротрубочек сохранились (A, Инвертировать). (B) изображение инвертированный органоид кисты региона показаны α-тубулина антитела маркировки с значительным антител в ловушке внутри окружающие подвале матрица (стрелка). Масштаб баров = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9: Organoids фиксированной в подвале матрицы в 1% PFA и иммуно меченых Lgr5 и CD24. Конфокальный оптических секции organoids фиксированной в подвале матрицы в 1% ПФА в PBS, содержащие 0,1% моющего средства, промывают в PBS с 1% козьего сыворотки и 0.1% моющего средства и помечены антител против Lgr5 и CD24. (A, B) Ниши стволовых клеток в пределах домена склеп показаны положительные Paneth клетки для CD24 (красный). Конфокальный и фазы контрастность изображения были объединены в A. B показывает, один канал CD24 маркировки. (C) стволовых клеток региона в пределах домена склеп показаны положительные Lrg5 стволовых клеток. Масштаб баров = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: Хронология малых кишечные крипты и Вилли изоляции и фиксация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Изоляция кишечника ткани
Изоляция малого кишечника склепы и ворсинки и толстой склепы предполагает, подвергая поверхность слизистой оболочки, лечение с ЭДТА решение ослабить ячейку контакты, фракционирование (встряхивания) и центрифугирования. Протокол изоляции представленных кишечных ворсинок/склеп был изменен от Belshaw et al. и Уайтхед и др. ^{17 , 18}

Подвергая поверхность слизистой оболочки
Мы экспериментировали с целый ряд подходов к разоблачить поверхности слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта в развитии этой процедуры. Классический подход является Эверт (поворот наизнанку) трубка, обычно в сегментах около 100 мм в длину, с помощью металлического стержня которое перехватывается в складку ткани на одном конце, а затем оставшиеся трубки скользнул через трубу¹⁹. Для мыши ткани идеально металлический стержень (2,4 мм) с закругленными кончиками. Этот подход имеет преимущество расширения поверхности слизистой оболочки, позволяя более широкого доступа к PBS и ЭДТА. Мы изначально используется этот подход, но переехал в резки трубки в короткой длины (около 5 см) и открытия каждой секции с рассечения ножницы, как это оказалось проще. Этот способ уместен, если только несколько кишечника требуется; но если больше животных должны были быть использованы в эксперименте затем устройство специально для резки открыть трубку продольно, как описано в Йонеды et al. ¹⁴ будет более эффективным.

Отряд ворсинки и склепы из мышечных слоя
Сначала мы использовали 3 мм ЭДТА в PBS и относительно длительный инкубационный период до 60 мин ослабить поверхности слизистой оболочки из основной ткани^17,18. На этой концентрации ЭДТА мы обнаружили, что время инкубации 30 минут было достаточно, чтобы ослабить склепы из мыши кишки. Однако для изоляции склеп/ворсинок тонкой кишки мы стараемся, используя более концентрированной ЭДТА за более короткое время, которое оказалось эффективным подходом. Все последующие работа была проведена с ткани, извлеченные с помощью метода ЭДТА 30 мм, создания соответствующих фракций ворсинки или склепы. Для склепы мы обычно объединяют фракции 3-5 до фиксации, но важно проверить, являются ли эти соответствующих фракций как таймингов будет зависеть от ряда факторов, таких как положение вдоль желудочно-кишечного тракта, возраст мышь, воспаление, Предыдущая диета , и т.д. аналогичным образом, продолжительность времени, ткани необходимо быть поколеблен после ЭДТА лечение эффективным могут отличаться в различных условиях. В результате получается фракции изолированных ткани, содержащие смесь ворсинки и склепы или главным образом ворсинки или склепы (рис. 2). Как есть нет ворсинки в толстой кишке, склеп добыча может быть достижимыми в один шаг путем встряхивания ткани в тубе 30 s. Эти фракции можно затем фиксированной и обрабатываются для иммуно маркировки.

Изоляция кишечных organoids из подвала матрицы
Изоляция organoids с подвале матрица куполов можно достичь с помощью решения восстановления клеток. Решение работает на depolymerizing матрице загущенное подвал, но температура должна быть 2-8 ° C. Предостережение что динамический микротрубочки не могут быть сохранены. Таким образом, для иммуно маркировки динамических микротрубочек и + советы как EBs клеток, восстановления от подвала матрицы до фиксации не рекомендуется. Однако большинство микротрубочек в дифференциации органоид клетки являются относительно стабильными, и они были сохранены (рис. 6). Он также работал хорошо для иммуно маркировки centrosomal и соединительной белков, а также ячейки маркеры.

Фиксация протоколы
Формальдегид (свежеприготовленные из PFA) является относительно быстрого действия фиксатором, который формирует реверсивные cross-links, и 4% PFA работает хорошо для, например, в иммуно маркировки микротрубочек и гамма тубулина и окрашивания нитей актина с Фаллоидин. Более разбавлять PFA решения, такие как 1% хорошо работала для иммуно маркировки например, маркером стволовых клеток маркеры Lgr5 и Paneth ячейки CD24 в склепе ниши стволовых клеток, в то время как более высокие концентрации PFA не работает.

Добавление глютаральдегид дает лучшее сохранение микротрубочек и так называемые PHEMO фиксации, которая состоит из смеси 3,7% PFA, глютаральдегид 0,05% и 0,5% моющего средства в PHEMO буфера (68 мм трубы, мм 25 HEPES, 15 мм EGTA и 3 мм MgCl2)² без ущерба для антигенностью дает отличную сохранность микротрубочек. Он также хорошо работает для иммуно маркировки гамма тубулина, β-катенина и E-Кадгерины и окрашивания нитей актина с Фаллоидин. Однако в 3D ткани и органоид культур, PHEMO фиксации несогласованные результаты и поэтому не использовался.

Метанол является коагулянта фиксатором, который дает относительно хорошее проникновение и стремится сохранить антигенностью. Фиксация с 100% метанола (-20 ° C) вводит некоторые усадка, дает умеренный морфология сохранение и работает микротрубочек, + советы и много centrosomal антител, включая ninein в 2D клеточных культур. Однако некоторые organoids рухнул при использовании этого метода фиксации. Кроме того проникновение антител через весь склепы, ворсинки или organoids первоначально было проблемой, но добавление 0,1% моющего средства промывочный раствор и длительное Стиральная достигнуты лучшие результаты.

Сочетание формальдегида и метанола ранее использовалось Роджерс и др. ²⁰ -иммуно лейбл EB1 в дрозофила. Протокол фиксации на основе смеси формальдегида и метанола, поэтому был разработан для кишечных тканей и organoids, основанные на 3% формальдегида и 97% метанола охлажденным до-20 ° C, но пропуск карбонат натрия 5 мм из смеси, которая использовалась Роджерс и др. ²⁰ Кроме того, образцы были установлены в холодильнике при температуре-20 ° C. Это работает особенно хорошо для маркировки immuno + советы, например КЛИПА-170 и EBs, но доказано также отлично подходит для фиксации и иммуно маркировки микротрубочек и актина в ткани и 3D organoids. Очень хорошо структурных сохранение было очевидным и антигенностью сохранилось несколько белков цитоскелета и связанных с ними, а также centrosomal белков, таких как гамма тубулина и ninein, хотя маркировки для ninein более последовательно работал с метанолом Фиксация.

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Авторы благодарят Пол Томас за микроскопом консультации и помощь. Эта работа, здесь была поддержана СИББН (Грант нет. BB/J009040/1 м.м.м. и Т.У).