Method Article
Wir präsentieren Protokolle zur Isolierung der intestinalen 3D-Strukturen aus in-Vivo -Gewebe und in-vitro- Keller-Matrix eingebettet, Organellen, und Detail verschiedene Fixierung und Färbung Protokolle für Immuno-Kennzeichnung von Mikrotubuli optimiert, centrosomal und Knoten Proteine sowie Handy-Marken einschließlich des Stammzell-Proteins Lgr5.
Das Aufkommen von 3D in-vitro- Organellen, die in Vivo Gewebearchitektur und Morphogenese imitieren hat die Fähigkeit, wichtige biologische Fragestellungen in Zell- und Entwicklungsbiologie stark vorangetrieben. Darüber hinaus verspricht Organellen zusammen mit technischen Fortschritten in gen bearbeiten und virale gen Lieferung, medizinische Forschung und Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung von Krankheiten zu gelangen. Organellen in Vitro im Keller Matrix gewachsen bieten leistungsstarke Modellsysteme für das Studium, das Verhalten und die Funktion von verschiedenen Proteinen und eignen sich gut für live-Aufnahmen von Leuchtstoff-markierten Proteine. Allerdings ist zur Gründung der Ausdruck und die Lokalisierung der körpereigene Proteine in Gewebe Ex Vivo und in Vitro Organellen wichtig, das Verhalten der tagged Proteine zu überprüfen. Zu diesem Zweck haben wir entwickelt und modifiziert Gewebe Isolierung, Fixierung und Immuno-Kennzeichnung Protokolle für die Lokalisierung von Mikrotubuli, centrosomal und damit verbundenen Proteine im Darmgewebe Ex Vivo und in Vitro Darm Organellen. Das Ziel war, dass das Fixiermittel, 3D-Architektur der Organellen/Gewebe zu bewahren und auch gleichzeitig Antikörper Antigenität und ermöglicht gute Penetration und Räumung von Fixativ und Antikörper. Kälteexposition depolymerizes alle, aber stabilen Mikrotubuli und dies war ein Schlüsselfaktor, wenn Sie die verschiedenen Protokolle ändern. Wir fanden, dass die Erhöhung der Ethylenediaminetetraacetic Säuren (EDTA) Konzentration von 3 mM bis 30 mM effiziente Ablösung der Zotten und Krypten im Dünndarm gab, während 3 mM EDTA für Kolon Krypten ausreichte. Die entwickelten Formaldehyd/Methanol-Fixierung-Protokoll gab sehr guten baulichen Erhaltung Beibehaltung auch Antigenität für wirksame Kennzeichnung von Mikrotubuli, Actinfilamente und Ende-Bindeproteine (EB). Er arbeitete auch für das centrosomal Protein-Ninein, obwohl das Methanol-Protokoll konsequenter gearbeitet. Wir ergab weiter, dass Fixierung und Immuno-Kennzeichnung der Mikrotubuli und damit verbundenen Proteine mit Organellen von isoliert oder im Keller Matrix bleibt erreicht werden konnte.
Bildung von Epithelien mit Apico-basale Polarität ist ein fundamentaler Prozess in der Entwicklung und beinhaltet eine dramatische Reorganisation von Mikrotubuli und centrosomal Proteine. Eine radiale Mikrotubuli Array ausgehend von einer zentral gelegenen centrosomal Mikrotubuli Organisation Zentrum (MTOC) ist prominent in vielen tierischen Zellen, und das ist gut geeignet für relativ flache Zellen. Im Gegensatz dazu montieren säulenartige Epithelzellen, wie diejenigen des Darms, nicht Radial transzelluläre Mikrotubuli-Arrays, die die Form und die spezielle Funktionen dieser Zellen besser zu unterstützen. Diese dramatische Reorganisation der Mikrotubuli wird durch den Umzug in die Spitze und apikalen nicht centrosomal MTOCs (n-MTOCs) bilden, Centrosome erreicht, die verantwortlich für die Verankerung des transzelluläre Mikrotubuli1,2 , 3 , 4 , 5.
Ein Großteil unseres Wissens über epithelialen Differenzierung und der damit verbundenen Mikrotubuli Reorganisation kommt aus Untersuchungen von 2D in Vitro Zellschichten, die die Gewebearchitektur in Vivo nicht angezeigt werden. Entwicklung von 3D in Vitro organoide Kulturen, vorangegangen durch Clevers und Kollegen6, stellt einen großen technologischen Fortschritt dar, wie sie in Vivo Architektur und Entwicklung imitieren. Eine Hierarchie der epithelialen Differenzierung spiegelt sich im Darm; Stammzellen am unteren Krypten geben Anlass zu unreif Transit verstärkt Zellen, die sich vermehren und allmählich zu unterscheiden, da sie die Gruft auf dem kleinen Darm Villus oder Kolon Oberfläche wandern wo sie vollständig vor unterschieden werden Schuppen Sie in das Lumen-7. Wichtig ist, ist dies im Darm Organellen repliziert, wo Zellen aus der Stammzellnische bildende Zysten wuchern, die anschließend Krypta-wie Knospen mit Stammzellen an der Unterseite und Differenzierung allmählich Fortschritte auf dem Weg der Zyste Region erzeugen, die Villus-wie8wird. Der Darm organoide stellt daher ein leistungsfähiges Modell, nicht nur Mikrotubuli und centrosomal Reorganisation bei epithelialen Differenzierung aber zahlreiche andere Proteine, sowie bietet eine ideale Plattform für das Screening von Medikamenten und Lebensmitteln zu studieren Verbindungen des therapeutischen Potentials nutzen9,10.
Organellen sind gut geeignet für live-Aufnahmen von Leuchtstoff-markierten Proteine und beide Knock-in und Knock Out Organellen mit CRISPR/Cas9 gen11,12Bearbeitung erzeugt werden können. Jedoch ist es wichtig, vor allem um das Verhalten der tagged Proteine überprüfen, zur Gründung der Ausdruck und die Lokalisierung der körpereigene Proteine untersucht werden. Immuno-Beschriftung 3D Organellen gewachsen in Keller Matrix oder Ex Vivo isolierte Gewebe ist komplexer als Zellen in Kultur Gerichte in 2D angebaut. Die Fixierung-Protokoll muss die zarte 3D Architektur der Organellen zu erhalten Beibehaltung noch Antikörper Antigenität (d.h. die Epitope für die Bindung von Antikörpern). Beispielsweise 4 % Paraformaldehyd (PFA) wird allgemein als ein Fixiermittel verwendet, aber während es ein relativ schnelles Handeln Fixiermittel ist und guten morphologische Erhaltung gibt, nach unserer Erfahrung es häufig führt zu Verlust der Antigenität und eignet sich nicht für viele centrosomal Antikörper. Die Fähigkeit von Fixativ und Antikörpern 3D Strukturen und Gewebe eindringen sollte auch berücksichtigt werden. Zu diesem Zweck haben wir modifiziert und entwickelten Protokolle für Gewebe isoliert und indirekte Immuno-Kennzeichnung der 3D in Vitro Organellen und Ex Vivo isoliert Darmgewebe. Wir beschreiben, wie kleine Darm Krypten und Zotten und Kolon Gewebe zu isolieren, und beinhalten ein Protokoll für die Isolierung von 3D Organellen als Alternative zur Festsetzung und Immuno-Kennzeichnung innerhalb der Keller-Matrix. Wir präsentieren Ihnen drei Alternativen Fixierung-Protokolle für die Immuno-Kennzeichnung von Mikrotubuli und centrosomal, wie Ninein, und Mikrotubuli Plus-Ende Tracking-Proteine (+ Tipps), wie die EB Proteine und CLIP-170 (siehe auch Referenzen8, 13). Wir diskutieren auch die vor- und Nachteile jedes Protokoll zugeordnet.
Alle hier beschriebene Methoden wurden nach der University of East Anglia Institutslizenz Richtlinien durchgeführt.
1. Isolierung von Darmgewebe
2.Isolierung der intestinalen Organellen von Keller Matrix Domes in 24-Well-Platten
Hinweis: Die Bildung von Organellen im Keller Matrix Kuppeln wurde an anderer Stelle12beschrieben.
(3) Fixierung der isolierten Darmgewebe und Organellen
4. blockieren Schritt
5. Primärantikörper Inkubation
(6) Sekundärantikörper Inkubation
(7) nukleare Fleck
8. Montage isoliert, Krypten, Zotten und Organellen
9. Befestigung und Immuno-Kennzeichnung von Organellen in Keller-Matrix
Hinweis: Organellen bestimmt zur Fixierung und Immuno-Kennzeichnung innerhalb der Matrix Keller im Untergeschoss Matrix Kuppeln auf Runde Glasdeckgläser in einer 24-Well-Platte (eine Kuppel pro Well) generiert wurden. Die organoide Keller Matrix Kuppeln wurden durch das Hinzufügen und Entfernen von verschiedenen Lösungen innerhalb der 24-Well-Platte verarbeitet.
Isolierung von Darmgewebe für Immuno-Beschriftung
Die beschriebenen Gewebe isoliert Protokolle für Dickdarm und Dünndarm wurden für Erhaltung und Immuno-Etikettierung von Mikrotubuli und damit verbundenen Proteine, aber nicht für Stammzell-Lebensfähigkeit und organoide Generation (Abbildung 1 und Tabelle 1 optimiert. ). Ziel war es, die Krypta zu generieren und Villus Splittergruppen, die als waren sauber (frei von Schleim und andere Gewebe) wie möglich, bei gleichzeitiger Minimierung der Exposition gegenüber EDTA und Kälte Struktur beibehalten und verhindern Depolymerisation von Mikrotubuli mit Eis kalt Lösungen, die bewegen Depolymerisation von Mikrotubuli alles andere als stabil. Abbildung 2 zeigt Beispiele von Bildern der Brüche 2 und 3 aus isolierten kleinen Darmgewebe mit Teil 2 mit einer Mischung aus Zotten und Krypten (Abb. 2A, B), während der Teil 3 enthält hauptsächlich Krypten (Abbildung 2 D).
Fixierung und Immuno-Kennzeichnung von isolierten Darmgewebe
Die einzelnen oder kombinierten Fraktionen wurden dann zur Fixierung verarbeitet und Immuno-gekennzeichnet durch eine Reihe von Schritten, einschließlich Fixierung, Waschmittel, Sperrung, Antikörper und Waschlösungen, bevor erneut Aussetzung der endgültigen Zotten/Krypten pellet in Montage-Medien, auf Folien zu übertragen, und mit Glasdeckgläser abdecken. Die Krypten und Zotten wurden dann auf einem confocal Mikroskop abgebildet.
Gute Erhaltung und Kennzeichnung der Mikrotubuli und Aktin in Zotten und Krypten wurde durch Folgendes erreicht: eine Kombination von Formaldehyd/Methanol-Fixierung bei-20 ° C, wiederholt waschen in PBS mit 0,1 % Waschmittel und 1 % Serum und blockieren mit PBS-Puffer mit 0,1 % Waschmittel und 10 % Serum, gefolgt von Übernachtung Inkubation bei 4 ° C im primären Antikörper und dann 2 h in Sekundärantikörper bei Raumtemperatur (Abbildung 3). Formaldehyd/Methanol Fixierung auch funktionierte gut für Kennzeichnung + Tipps wie die EBs und CLIP-170 in isolierten Krypten und Zotten (Abbildung 4). EB3 Ansammlungen am Plus-Ende von Mikrotubuli (bekannt als Kometen) zeigten sich in Krypten (Abb. 4A), während Vereinigung entlang der Gitter von stabilen Mikrotubuli in Zotten Proben (Abbildung 4) gesehen werden könnte. Eindeutige Lokalisierung des CLIP-170 und p150geklebt (Untereinheit des Dynactin) war klar ersichtlich an der apikalen n-MTOCs in isolierten Zotten (Abbildung 4 b). Fixierung mit dem Formaldehyd/Methanol-Protokoll funktionierte nicht konsequent für die Lokalisierung der Ninein in isolierten Darmgewebe mit unseren Pep3 Antikörper gegen Maus Ninein. Jedoch Methanol Fixierung bei-20 ° C, gefolgt von der gleichen waschen und blockiert Lösungen für Formaldehyd/Methanol gab sehr gute Lokalisierung von Ninein in isolierten Krypten und Zotten (Referenz8;Abbildung 5). Interessant ist, während Ninein in der apikalen Zentrosomen konzentriert zeigte einige Ansammlung an der Basis der Zelle in einigen Zellen innerhalb von isolierten Krypten (Abbildung 5). Ob dies aufgrund unspezifischer Beschriftung oder eine Folge der Isolation Verfahren zu verzögern ist benötigen Fixierung (und damit auf Erhaltung) weitere Untersuchung. Methanol-behoben (-20 ° C) Kryostat Abschnitte von Villi (siehe Abbildung 3bi in8) zeigte jedoch auch, dass Ninein an der Zelle Basis in einigen Zellen, was darauf hindeutet, dass Ninein auch eine basale Bevölkerung von Mikrotubuli zuordnen kann.
Fixierung und Immuno-Kennzeichnung der Organellen von Keller Matrix isoliert
Kleinere Darm Organellen wurden generiert und im Keller Matrix für drei Wochen oder länger (Abbildung 6A; Referenz6,15) angebaut. Ein kalt (4 ° C) Zelle-Recovery-Lösung wurde zur Organellen aus der Keller-Matrix zu isolieren. Depolymerisiert Keller-Matrix-Lösung mit Organellen wurde nach Röhrchen überführt und vor der Fixierung und Immuno-Kennzeichnung zentrifugiert. Dies produziert sehr saubere Vorbereitungen und erlaubt guten Zugang zu den Organellen für die verschiedenen Lösungen. Die differenzierte Zellen innerhalb der organoide Villus Domains enthalten stabile Apico-basale Mikrotubuli; Diese Bezeichnung auch in den meisten Fällen (Abb. 6 b, C) und EB1 könnte auch entlang der Mikrotubuli-Gitter (Abbildung 6E; Referenz13) gesehen werden. Jedoch kann die kalte Zelle-Recovery-Lösung führen Depolymerisation von dynamischen Mikrotubuli, die zeigte sich in einigen Proben durch das Fehlen von EB1 Kometen (die an das Plus-Ende des wachsenden Mikrotubuli binden) innerhalb der basalen Krypta-Domains (Abbildung 6F ). In anderen Proben blieben astral (dynamischen) Mikrotubuli (Abbildung 6). Organoide Isolierung vor der Fixierung und Immuno-Kennzeichnung arbeitete auch für Knoten Proteine, Ninein, CLIP-170 und Zelle Marker wie Mucin Becherzellen und Chromogranin A für Enteroendocrine Zellen.
Fixierung und Immuno-Kennzeichnung der Organellen im Keller-matrix
Abbildung 7 zeigt eine organoide Stadium der Zyste (A–C) und in einem frühen Stadium der Entwicklung der Krypta (D), feste in Formaldehyd/Methanol und Immuno-Label für Mikrotubuli und Ninein. Gute Mikrotubuli Erhaltung und Kennzeichnung sowie die Kennzeichnung für Ninein am apikalen n-MTOCs zeigten. Abbildung 8A, B zeigt eine Krypta Domain innerhalb eines Tages 6 organoide mit Methanol-Protokoll fixiert und mit der Bezeichnung für Mikrotubuli und EB1. Guter Erhaltung von Mikrotubuli und EB1 Kometen war offensichtlich darauf hindeutet Erhaltung der dynamischen Mikrotubuli.
Organellen waren auch feste und Immuno-Label gleichzeitig innerhalb der Keller-Matrix. Die Nachteile dieses Verfahrens können Lösungen zu waschen und/oder werden schlechte Penetration Fixativ und Trapping von Antikörpern in der Keller-Matrix (Abbildung 8 b), obwohl in beiden Fällen weniger häufig als 0,1 % Waschmittel in das Fixiermittel enthalten war. Zusätzlich 4 % PFA nicht beibehalten das Keller-Matrix gut aber verursacht es aufzulösen, obwohl dies weniger so mit 1 % PFA.Methanol-Fixierung, induziert auf der anderen Seite manchmal organoide Zusammenbruch.
Etikettierung mit einige Antikörper wie z. B. gegen die Stammzell-Marker Lgr5 und Paneth Zelle Marker erfolglos CD24 mit den 4 % PFA, Methanol oder Formaldehyd/Methanol-Protokollen. Jedoch Befestigung der Organellen innerhalb der Keller-Matrix mit 1 % PFA in PBS mit 0,1 % Waschmittel bei Raumtemperatur führte zu Kennzeichnung für Lgr5 und CD24 (Abbildung 9).
Abbildung 1: Isolierung von kleinen Darmzotten und Krypten. Flussdiagramm der wichtigsten Schritte im kleinen Darm Villus und Krypta Isolation vor der Fixierung und Immuno-Kennzeichnung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: isolierter Zotten und Krypten aus Maus Dünndarm. Hellfeld-Mikroskop-Bilder der intestinalen Brüche zeigen (große Pfeile) Zotten und Krypten (kleine Pfeile). (A, B) Teil 2 enthält eine Mischung aus Zotten und Krypten und Erhaltung der Morphologie auf die Villus und Krypta ist offensichtlich in B. (C, D) Teil 3 zeigt Isolierung der Krypten und Abwesenheit von Zotten und intakten Grüfte unter anderem eine gegabelte Krypta in C. Skalieren von Balken = 500 μm (A, C); 100 μm (B, D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: isolierter kleiner Darm Villus und Krypta in Formaldehyd/Methanol fixiert und Immuno-Label für Mikrotubuli und Actin. (A) schematische Darstellung der Villus und Krypta Epithel mit verschiedenen Zelltypen angegeben. Die hervorgehobenen Felder zeigen die repräsentativen Regionen abgebildet in B und C. (B, C) Konfokalen optischen Abschnitte durch Bestandteil eines Villus (B) und basalen Krypta (C) isoliert aus dem Dünndarm mit 30 mM EDTA und in Formaldehyd/Methanol fixiert, in PBS mit 1 % Ziege Serum und 0,1 % Waschmittel gewaschen, mit PBS-Puffer blockiert enthält 10 % Ziegenserum und 0,1 % Waschmittel und beschriftet für Mikrotubuli mit Ratte monoklonalen Anti-Tubulin Antikörper (grün) und Actin mit Kaninchen polyklonale Anti-β-Aktin-Antikörper (rot). Gut erhaltene Apico-basale Mikrotubuli-Bündel sind offensichtlich in Villus und Krypta Zellen und Aktin kann gesehen werden, konzentriert sich in der apikalen Region mit Blick auf das Lumen (Pfeil). Skalieren von Balken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Isoliert, kleine Darm Krypta und Zotten in Formaldehyd/Methanol fixiert und Immuno-Label für Mikrotubuli, EB3, p150geklebtund CLIP-170. Konfokalen optischen Teile der Krypta und Zotten Regionen aus dem Dünndarm mit 30 mM EDTA isoliert und fixiert in Formaldehyd/Methanol in PBS mit 10 % Ziegenserum und 0,1 % Waschmittel gewaschen in PBS mit 10 % Ziegenserum und 0,1 % Waschmittel, blockiert und Immuno-beschriftet. (A) Gruft mit Kaninchen α-Tubulin polyklonalen Antikörper (rot) und Ratte monoklonalen EB3KT36 Antikörper (grün) gekennzeichnet und gebeizt für DNA mit DAPI (blau) zeigt Apico-basale Mikrotubuli und EB3 Kometen. Das invertierte Einkanal-Bild zeigt deutlich EB3 Kometen in der basalen Krypta Zellen darauf hindeutet gute Erhaltung der dynamischen sowie stabile Mikrotubuli. (B) Villus Epithelzellen mit Kaninchen polyklonale CLIP-170-Antikörper beschriftet (rot, siehe auch verweisen16) und die Maus monoklonalen p150geklebt Antikörper (grün) zeigt apikalen Co Lokalisierung. Invertierte Einkanal-Bilder sind unten dargestellt. (C) Villus Zellen mit Kaninchen α-Tubulin polyklonalen Antikörper (rot) und Ratte monoklonalen EB3-KT36 Antikörper (grün) gekennzeichnet und gebeizt für DNA mit DAPI (blau) zeigt Apico-basale Mikrotubuli mit EB3 entlang der Gitter. Vereins EB3 Gitter ist in das vergrößerte Bild hervorgehoben, während das umgekehrte Einkanal-Bild EB3 Kometen und Gitter Verband schlägt. Skalieren von Balken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: isolierte Doppelpunkt Krypta in Methanol, Immuno-Label für Ninein und E-Cadherin, fixiert und gefärbt mit DAPI. Konfokalen optischen Teil der basalen und Transit-Verstärkung Region eine Krypta isoliert aus dem Dickdarm mit 3 mM EDTA in Methanol fixiert, in PBS mit 1 % Ziegenserum und 0,1 % Waschmittel gewaschen und blockiert in PBS mit 10 % Ziege Serum und 0,1 % Waschmittel. Die Krypta wurde mit Kaninchen Ninein polyklonalen Antikörper beschriftet (Pep3, siehe auch Referenz8, rot) und Maus monoklonalen Antikörper in E-Cadherin (grün) und gefärbt mit DAPI (blau). Das invertierte Einkanal-Bild zeigt nur Ninein. Das Bild zeigt eine gut erhaltene Krypta mit E-Cadherin enthüllt die Umrisse der einzelnen Zellen und Ninein an der apikalen Zentrosomen konzentriert. Es schlägt gute Penetration von Fixativ und Antikörpern und Erhaltung der Antigenität. Maßstabsleiste = 5 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Entwicklung, Fixierung und Immuno-Kennzeichnung von organoide isoliert Organellen. (A) Phase Kontrast zeigen verschiedene Entwicklungsstadien organoide von Zelle Aggregaten zur Zyste mit Knospe Einleitung und voll Bilder ausgebildet Organellen mit Krypta und Villus Domains.(B–F) Konfokalen optischen Abschnitte durch Organellen von Keller-Matrix mit Zelle-Recovery-Lösung bei 4 ° C (10 min), gefolgt von Formaldehyd/Methanol-Fixierung, waschen in PBS mit 10 % Ziegenserum und 0,1 % Waschmittel, Sperrung in PBS mit 10 % Ziege isoliert Serum und 0,1 % Waschmittel und Immuno-Kennzeichnung für Mikrotubuli, β-Catenin und EB1. (B) organoide Zyste für Mikrotubuli (blau) und β-Catenin (rot) zeigen gute Mikrotubuli Erhaltung und Kennzeichnung in den meisten Zellen beschriftet. (C) unterschiedliche Apico-basale Mikrotubuli sind offensichtlich in dieser erweiterten Epithelzellen aus eine organoide Zyste. (D) teilenden Zellen für Mikrotubuli zeigt Spindeln einschließlich astral (dynamischen) Mikrotubuli (Pfeil) beschriftet. (E, F) Villus Domäne (E) und Krypta (F) Domäne organoide Regionen zeigen einige EB1 Kennzeichnung entlang das Gitter aus stabilen Mikrotubuli, vor allem in der Villus, während sehr wenige EB1 Kometen auch innerhalb der basalen Krypta, was darauf hindeutet, dass Dynamik zu sehen sind Mikrotubuli sind nicht erhalten geblieben. Skalieren von Balken = 20 μm (A); 2 μm (D); 5 μm (B, C, E-F). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Organellen innerhalb der Keller-Matrix in Formaldehyd/Methanol fest- und Immuno-Label für Mikrotubuli und Ninein. Konfokalen optischen Teile der Organellen in Formaldehyd/Methanol fixiert, gewaschen und in PBS mit 10 % Ziegenserum und 0,1 % Waschmittel blockiert und beschriftet, während die übrigen in der Keller-Matrix. (A–C) Organoide Zyste für Mikrotubuli (grün) und Ninein (Pep3 Referenz;8, rot) beschriftet und befleckt mit DAPI (blau) zeigt das zusammengefügte Bild a und invertiert einkanalige Bilder für Mikrotubuli (B) und Ninein (C). Die Bilder zeigen Apico-basale Mikrotubuli und apikalen Ninein Lokalisierung, was darauf hindeutet, sehr gute bauliche Erhaltung der die organoide und Durchdringung von Antikörpern sowie clearing von ungebundenen Antikörper. (D, E) Organoide mit Krypta fixiert und mit dem Label wie oben und wieder zeigt hervorragende bauliche Erhaltung zu entwickeln, Kennzeichnung und clearing von Antikörpern. Unterschiedliche Apico-basale Mikrotubuli und apikalen n-MTOC Ninein Lokalisierung ist offensichtlich und in das vergrößerte Bild (E) die boxed Region in Dhervorgehoben. Skalieren von Balken = 10 μm (A-D); 5 μm (E). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Organellen feste innerhalb der Keller-Matrix in Methanol und Immuno-Label für Mikrotubuli und EB1. Konfokalen optischen Teile der Organellen in Methanol fixiert, gewaschen und in PBS mit 10 % Ziegenserum und 0,1 % Waschmittel blockiert und gekennzeichnet, während die übrigen in der Keller-Matrix. (A) Zyste Domäne von einer voll entwickelten organoide beschriftet mit Kaninchen polyklonale α-Tubulin (rot) und Maus monoklonalen EB1 (grün) Antikörper zeigen Apico-basale Mikrotubuli Spindeln (Pfeil) in zwei teilenden Zellen und unterschiedlichen EB1 Kometen. Einige fangen von ungebundenen EB1 Antikörper ist offensichtlich. Allerdings sind gute bauliche Erhaltung und Kennzeichnung der Mikrotubuli und EB1 beobachtet. Das Vorhandensein von EB1 Kometen schlägt vor, dass dynamische Mikrotubuli erhalten geblieben sind (A, invertieren). (B) Invertiertes Bild organoide Zyste Region zeigt α-Tubulin Antikörper Etikettierung mit erheblichen Antikörper innerhalb der umgebenden Matrix Keller (Pfeil) gefangen. Skalieren von Balken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: Organellen, die fest in der Keller-Matrix in 1 % PFA und Immuno-Label für Lgr5 und CD24. Konfokalen optischen Teile der Organellen, die fest in der Keller-Matrix in 1 % PFA in PBS mit 0,1 % Waschmittel in PBS mit 1 % Ziegenserum und 0,1 % Waschmittel gewaschen und beschriftet mit Antikörpern gegen Lgr5 und CD24. (A, B) Stammzellnische innerhalb einer Krypta Domäne zeigt Paneth Zellen positiv für CD24 (rot). Die konfokale und Phase Kontrast-Bilder wurden in Averschmolzen. B zeigt die einzelnen Kanal CD24 Kennzeichnung. (C) Stammzellen in einer Krypta Domäne zeigt eine positive Stammzelle Lrg5 Region. Skalieren von Balken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1: Timeline der kleinen Darm Krypta und Zotten Isolation und Fixierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Isolierung von Darmgewebe
Isolierung der kleinen Darm Krypten und Zotten und Kolon Krypten beinhaltet Freilegung der Schleimhautoberfläche, Behandlung mit EDTA Lösung Zellkontakte, Fraktionierung (schütteln) und Zentrifugation lösen. Die vorgestellten intestinalen Darmzotten/Krypta Isolierung Protokoll wurde von Belshaw Et Al. und Whitehead Et Al. modifiziert 17 , 18
Verfügbarmachen der Schleimhautoberfläche
Wir haben mit einer Reihe von Ansätzen, die Schleimhautoberfläche des Verdauungstraktes bei der Entwicklung dieses Verfahrens aussetzen experimentiert. Ein klassischer Ansatz soll evert (innen nach außen drehen) das Rohr, in der Regel in Segmente ca. 100 mm lang, mit einem Metallstab, der in einer Falte des Gewebes an einem Ende und dann die restlichen Röhre gefangen ist glitt über die u-19. Für Maus Gewebe eignet sich ein Metallstab (2,4 mm Durchmesser) mit abgerundeten Enden. Dieser Ansatz hat den Vorteil der Schleimhautoberfläche ermöglicht besseren Zugang zu PBS und EDTA zu erweitern. Wir hatten ursprünglich verwendet diesen Ansatz aber zog in die Röhre in kurzen Längen (ca. 5 cm) schneiden und öffnen jeden Abschnitt mit Präparierscheren, wie dies erwies sich einfacher als. Diese Methode eignet sich, wenn nur wenige Darm erforderlich sind; aber wenn mehr Tiere werden in einem Experiment dann ein speziell gebaute Gerät verwendet für aufschneiden das Rohr längs, wie von Yoneda Et Al. beschrieben 14 wäre effizienter.
Ablösung der Zotten und Krypten von der Muskelschicht
Zunächst haben wir 3 mM EDTA in PBS und relativ langen Inkubationszeiten von bis zu 60 min um der Schleimhautoberfläche aus den zugrunde liegenden Gewebe17,18zu lösen. Bei dieser Konzentration von EDTA fanden wir eine Inkubationszeit von 30 min ausreichend, Krypten von Maus Colon zu lösen war. Jedoch für die kleinen Darm Krypta/Villus Isolierung haben wir versucht, mit konzentrierter EDTA für eine kürzere Zeit, die einen effizienten Ansatz erwiesen. Alle nachfolgenden Arbeiten erfolgte mit Gewebe extrahiert, mit der 30 mM-EDTA-Technik Generierung von relevanten Fraktionen für Zotten und Krypten. Für Krypten wir gebündelt normalerweise 3-5 Fraktionen vor der Befestigung, aber es ist wichtig zu prüfen, ob diese die entsprechenden Fraktionen sind, wie die Zeiten eine Reihe von Faktoren wie z. B. Position entlang den Darm-Trakt, Alter der Maus, Entzündung, vorherige Diät hängen , etc. in ähnlicher Weise kann die Länge der Zeit, die das Gewebe muss im Anschluss an die EDTA Behandlung effektiv zu geschüttelt werden unter verschiedenen Bedingungen variieren. Das Ergebnis ist isolierte Gewebe Brüche mit einer Mischung aus Zotten und Krypten oder hauptsächlich Zotten oder Krypten (Abbildung 2). Da gibt es keine Zotten im Dickdarm, die Krypta-Extraktion kann erreichbar in einem Schritt durch Schütteln des Gewebes in der Röhre für 30 s. Diese Fraktionen können dann fixiert und für Immuno-Kennzeichnung verarbeitet werden.
Isolierung der intestinalen Organellen von Keller-matrix
Isolierung der Organellen von Keller Matrix Domes kann mithilfe von Zelle-Recovery-Lösung erreicht werden. Die Lösung funktioniert, indem depolymerizing die gelierte Keller-Matrix, sondern die Temperatur um 2 bis 8 ° c betragen. Ein Wort der Warnung ist, dass dynamische Mikrotubuli nicht beibehalten werden können. Also, für Immuno-Kennzeichnung von dynamischen Mikrotubuli und + Tipps, wie die EBs-Zelle, Erholung von Keller-Matrix vor der Fixierung ist nicht zu empfehlen. Jedoch die meisten der Mikrotubuli in den differenzierenden organoide Zellen sind relativ stabil und diese blieben (Abbildung 6). Es funktionierte auch gut für Immuno-Kennzeichnung von centrosomal und Knoten Proteine sowie Zellenmarkierungen.
Fixierung-Protokolle
Formaldehyd (frisch hergestellt aus PFA) ist ein relativ schnell wirkende Fixiermittel, die reversible Formen Vernetzungen und 4 % PFA eignet sich gut für z.B. in Immuno-Kennzeichnung Mikrotubuli und Gamma-Tubulin und Färbung Actinfilamente mit Phalloidin. Mehr verdünnen PFA Lösungen wie 1 % funktionierte gut für Immuno-Beschriftung z. B. mit der Stammzell-Marker Lgr5 und Paneth Zelle Marker CD24 innerhalb der Krypta Stammzellnische, während höhere Konzentrationen von PFA nicht funktioniert hat.
Der Zusatz von Glutaraldehyd gibt bessere Konservierung von Mikrotubuli und die so genannte PHEMO Fixierung besteht aus einer Mischung von 3,7 % PFA, 0,05 % Glutaraldehyd und 0,5 % Waschmittel in PHEMO Puffer (68-mM-Rohre, 25 mM HEPES, EGTA 15 mM und 3 mM MgCl2)2 bietet ausgezeichnete Erhaltungszustand der Mikrotubuli ohne Antigenität. Es funktioniert auch gut für Immuno-Kennzeichnung Gamma-Tubulin, β-Catenin und E-Cadherin und Färbung Actinfilamente mit Phalloidin. Jedoch in 3D Gewebe und organoide Kulturen, die PHEMO Fixierung inkonsistente Ergebnisse produziert und wurde deshalb nicht verwendet.
Methanol ist ein Gerinnungsmittel Fixiermittel, das relativ gute Penetration und tendenziell Antigenität zu bewahren. Fixierung mit 100 % Methanol (-20 ° C) führt einige Schrumpfung, gibt moderate Morphologie Erhaltung und arbeitet für Mikrotubuli, + Tipps und viele centrosomal Antikörper einschließlich Ninein in 2D Zellkulturen. Jedoch brach einige Organellen bei Verwendung dieser Methode der Fixierung. Darüber hinaus Eindringen von Antikörpern durch gesamte Krypten, Zotten oder Organellen war zunächst ein Problem aber die Zugabe von 0,1 % Waschmittel der Waschlösung und längeren waschen bessere Ergebnisse erzielt.
Eine Kombination von Formaldehyd und Methanol hatte früher von Rogers Et al. 20 , Immuno-Label EB1 in Drosophila. Eine Fixierung-Protokoll basiert auf einer Mischung aus Formaldehyd und Methanol wurde daher für Darmgewebe und Organellen basierend auf 3 % Formaldehyd und 97 % Methanol,-20 ° C gekühlt, aber weglassen der 5 mM Natriumcarbonat aus der Mischung, die von Rogers verwendet wurde Et Al. 20 Außerdem wurden Proben in der Tiefkühltruhe bei-20 ° c fixiert Dies funktioniert besonders gut für Immuno-Kennzeichnung + Tipps, wie CLIP-170 und der EBs, sondern erwies sich auch hervorragend für die Befestigung und Immuno-Kennzeichnung Mikrotubuli und Aktin in Gewebe und 3D Organellen. Sehr guter baulicher Erhaltung zeigte und Antigenität blieb für mehrere Zellskelett und assoziierte Proteine sowie centrosomal Proteine wie Gamma-Tubulin und Ninein, obwohl Kennzeichnung für Ninein konsequenter mit Methanol gearbeitet. Fixierung.
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Die Autoren danken Paul Thomas für Mikroskop-Beratung und Unterstützung. Dieses hier wurde unterstützt durch die BBSRC (keine zu gewähren. BB/J009040/1, M.M.M. und t.w.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | washing and PFA |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | isolate organoids |
lobind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30108116 | prevent cells sticking |
0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | Crypt isolation |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 11517532 | Isolate crypts from villi |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | detergent |
goat serum | Sigma | G6767 | blocking agent |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | used as non-stick agent | |
Paraformaldehyde, 4% in PBS | Alfa Aesar | J61899 | fixative |
Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) | Sigma | F8775 | used as fixative |
Methanol 99.9% Analytical grade | Fisher | M/4000/17 | used as fixative |
MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit | Maxvision Biosciences | MF01-S | commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling |
Rotator SB2 or SB3 | Stuart | microcentrifuge tube rotator | |
Sodium citrate | antigen retrieval | ||
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | mountant |
DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802 | anti-fade agent |
Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges | Clarity | N/C366 | slides |
Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | coverslips |
Matrigel | Corning | 356231 | Basement matrix for 3D organoid culture |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | for processing tissue/organoids |
15 mL conical tubes | Sarstedt | 62.554.502 | for processing tissue/organoids |
1.5 mL LoBind tubes | Eppendorf | 30108051 | for isolated organoids |
Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | primary antibody 1:500 |
Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody | Abcam | ab6160 | primary antibody 1:100 |
Rabbit alpha-tubulin antibody | Abcam | ab15246 | primary antibody 1:100 |
Rabbit anti-beta-actin antibody | Abcam | ab8227 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal anti-p150Glued antibody | BD Bioscience | 610473/4 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal EB3KT36 antibody | Abcam | ab53360 | primary antibody 1:200 |
Mouse monoclonal EB1 antibody | BD Bioscience | 610535 | primary antibody 1:200 |
Rabbit anti-Lgr5 antibody | Abgent | AP2745d | primary antibody 1:100 |
Dylight anti-rat 488 | Jackson | 112545167 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-mouse 488 | Jackson | ST115545166 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-rabbit 647 | Jackson | 111605144 | seconday antibody 1:400 |
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