Оценка саркоплазматический ретикулум кальция резерва и внутриклеточного кальция диастолического удаления в изолированных кардиомиоцитов желудочков

Утилизация внутриклеточного кальция играет важную роль в регуляции систолической и диастолической функции в кардиомиоцитов. Здесь мы описываем протокол для оценки саркоплазматический ретикулум Ca^{2 +} резерв и функция удаления диастолического кальция в кардиомиоцитов, кальция, визуализации системы.

Утилизация внутриклеточного кальция играет важную роль в регуляции систолической и диастолической функции в кардиомиоцитов. Сердца саркоплазматический ретикулум (SR) служит как Ca^{2 +} резервуар для сжатия, который reuptakes внутриклеточный Ca^{2 +} во время отдыха. Для ударов SR Ca^{2 +} резерв Детерминантный для сердца стягиваемости, и устранению внутриклеточного Ca^{2 +} имеет решающее значение для сердца диастолической функции. В некоторых патофизиологических условиях, например сахарного диабета и сердечной недостаточности Распродажа нарушениями кальция и SR Ca^{2 +} магазин в cardiomyocytes могут быть вовлечены в процессе работы сердца дисфункции. Здесь мы описываем протокол для оценки SRCa^{2 +} резерв и диастолического Ca^{2 +} удаления. Кратко один cardiomyocyte был ферментативно изолирован, и внутриклеточных Ca^{2 +} флуоресценции обозначается фура-2 был записан кальция съемочной системы. Применять кофеин для стимулирования общей SR Ca^{2 +} релиз, мы предварительно программу переключатель Автоматическое перфузии взаимосвязанных перфузии системы и системы стимулирования. Затем моно экспоненциальной кривой был использован для анализа константы времени распада транзиентов кальция и кальция, кофеин индуцированной импульсов. Таким образом, вклад SR Ca^{2 +}-АТФазы (SERCA) и Na⁺-Ca^{2 +} теплообменник (NCX) для удаления диастолического кальция оценивалась.

Внутриклеточного кальция ([Ca^{2 +}]_я) переработка играет важную роль в регуляции систолической и диастолической функции в cardiomyocytes¹. Как мы знаем, кальций индуцированной Ca^{2 +} релиз инициирует возбуждения сокращение муфты, который переводить электрического сигнала, чтобы сокращение. Деполяризации мембраны активирует sarcolemmal L-типа Ca^{2 +} каналы, которые вызывают Ca^{2 +} освобождение от SR в цитоплазму через рианодиновыми рецепторов 2 (RyR2). Переходных повышенных цитоплазматических Ca^{2 +} инициирует сокращением миофибрилл. Во время фазы, цитоплазматических Ca^{2 +} является reuptaken в SR посредством SR Ca^{2 +}-АТФазы 2 (SERCA2) и закачиваются из cardiomyocyte через Na⁺-Ca^{2 +} теплообменник (NCX)². Этот процесс приводит к сокращение релаксации, переработка в cardiomyocyte.

Сердца SR является сеть внутриклеточные мембраны, которая окружает сократительной машины. Он служит Ca^{2 +} резервуар для сжатия, и он reabsorbs внутриклеточный Ca^{2 +} во время отдыха. Для ударов SR Ca^{2 +} резерв Детерминантный для сократимости сердца. Тем временем удаление внутриклеточных Ca^{2 +} имеет решающее значение для сердца диастола. В некоторых патофизиологических условиях как диабет и сердечной недостаточностью, нарушениями Ca^{2 +} распродажа и депрессии SR Ca^{2 +} магазин в cardiomyocytes могут быть вовлечены в процессе сердечной дисфункции^{2,3 ,4}.

Для измерения SR Ca^{2 +} выпуска и диастолического Ca^{2 +} удаление в кардиомиоцитов, существует два широко используемых подходов: целостность NCX тока на основе патч зажим^5,6и кофеин индуцированной Ca ^{2 +} импульса на основе Ca^{2 +} флуоресценции изображений^7,8,9. Первый подход зависит тот факт, что Ca^{2 +} освобожден от SR основном перекачивается из клетки, NCX. Однако этот подход ограничивается требованием современного оборудования и умелой эксплуатации. В настоящем исследовании мы описываем удобный подход к оценке SR Ca^{2 +} резерв и Ca^{2 +} удаление в миоциты путем измерения кофеин индуцированной Ca^{2 +} импульса на основе Ca^{2 +} флуоресценции тепловизионные системы. Вкратце внутриклеточный Ca^{2 +} флуоресценции обозначается фура-2. Путем увязки системы стимулирования и перфузии системы, мы представляем программу для переключения перфузии и электрокардиостимуляции системы автоматически. 10 мм кофеин работал быстро вызвать общее Ca^{2 +} релиз в СР. Константы времени экспоненциального распада (Тау) кальция переходные процессы и кофеин индуцированной кальция импульсы были получены из моно экспоненциальной кривой, которые отражают вклад диастолического Ca^{2 +} удаления SERCA и NCX соответственно.

всех животных эксперименты были проведены в соответствии с протоколами, утвержденных Комитетом институциональный уход животных и использования на экспериментальный научно-исследовательский центр, Китай Академии медицинских наук и Чжэцзянский университет.

1. приготовления раствора

1. подготовить все решения, как описано в таблице 1.

2. изоляция из левого желудочка (LV) кардиомиоцитов

Примечание: LV кардиомиоцитов изолированы ферментативно с помощью системы перфузии Langendroff как описано ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

1. Настройка Langendroff перфузии системы. Заполняют раствором нормальный Tyrode (NT) системы перфузии, установить температуру на 36,5 ° C и устранить любые воздушные пузыри в трубе.
2. Весят и анестезировать Sprague-Dawley крыса внутрибрюшинной инъекцией (ip) хлораль гидрат (400 мг/кг). Подтверждать статус цистит, оценивая хвост или мыс щепотку ответ после 5 минут
3. Открыть брюшной полости под мечевидного отростка с хирургические ножницы, поднять мечевидного отростка и открыть сундук с ножницами. Удаление перикарда, слегка поднять сердце с Изогнутый пинцет, определить аорты и отрезали сердце ножницами из корня аорты.
4. Сердце передать блюдо 60-мм и мыть его с раствором NT. Держите аорты с двух микро Рассекающий щипцами и смонтировать его на Langendorff перфузии канюля, затем прочно перевязать аорты на канюли, используя хирургические нити.
   Примечание: Квалифицированный оператор может завершить этот процесс в течение 15 s.
5. Perfuse сердце с 30 мл NT решение для восстановления циркуляции коронарных артерий. Затем, переключитесь 30 мл Ca ^{2 +} perfusate-бесплатные решения (10 мм таурина, 1 мг/мл BSA) Tyrode чтобы остановить биение сердца. Затем, переключитесь на коллагеназы A изоляции решение (0,6 мг/мл) для пищеварения энзима perfusate.
   Примечание: Используйте коллагеназы для экспериментов с диабетической крысы, или коллагеназы II для экспериментов без диабетической крысы.
6. После переваривания для 20-25 мин, быстро изменить решение перфузии на Ca ^{2 +}-бесплатная Tyrode решение, чтобы остановить дальнейшее пищеварение. Затем, удерживая сердце пинцетом, отрезать его от канюлю и место сердце в 35-мм блюдо, содержащий решение КБ (см. таблицу 1).
7. Вскрыть LV стены с ножницами и пинцет. Отрезать Атриум, правый желудочек и предсердно Джанкшен области. Остальные ткани является LV; перевести его в новое блюдо 35-мм раствором КБ. Фарш LV ткани на мелкие кусочки.
8. Нежно Пипетка куски с отфильтрованной пластиковые капельницы и вновь приостановить в растворе 10 мл КБ.
9. Фильтр клетки с 150 мкм фильтром из нержавеющей стали диафрагмы и передачи для пластиковых пробирок 15мл. Центрифуга при 150 g x 30 s и удалить супернатант. Вновь приостановить миоцитов в растворе 10 мл КБ, свободный соглашаться на 6 мин, отменить супернатанта и вновь приостановить гранул в растворе 10 мл КБ.
   Примечание: Все шаги были выполнены на 36 ° C в растворах, загазованность с 100% O ₂.

3. Реинтродукции кальция

1. после урегулирования для 20 минут в растворе КБ, отменить супернатанта и вновь приостановить миоцитами с кальция реинтродукции решения A (0,3 мм Ca ^{2 +}, 4,5 мл Ca ^{2 +}-бесплатные Tyrode раствор, раствор 1,5 мл NT) 10 мин
2. Повторите вышеописанную процедуру с кальция реинтродукции решение B (0,3 мм Ca ^{2 +}, 3 мл Ca ^{2 +}-бесплатные Tyrode раствор, раствор 3 мл NT).
3. Повторите вышеописанную процедуру раствором (1,2 мм) Ca ^{2 +} NT для очистки доступны миоцитов. Хранить изолированных LV миоцитов в этом растворе и изучить их в течение 4-6 ч.

4. Установите вверх перфузии системы

1. подключить трубку приток с NT решение для камеры перфузии ( рис. 1A).
2. Иглы перфузии целевой myocyte, подключите кончик мульти ствол коллектор (например, перфузии карандаш, именуемый отныне карандаш), исправлена в микроманипулятор, клапан контролируется перфузии системы. Добавить решение NT и 10 мм кофеин решение для каждого столбца карандаш ( рис. 1A).
3. Эвакуировать воздушные пузыри в трубы, чтобы избежать засорения воздуха.
4. Количество капельного от микрона кончик карандаша для 10 s и вручную настроить регулятор потока, чтобы держать скорость потока приблизительной скоростью 3 капельного/10 с

5. Измерения внутриклеточного Ca ^{2 +} переходных и укорочение Саркомер ^{7 , 8 , 9}

1. пипетки 10 мкл суспензии клеток на слайде Подсчет числа клеток с счетчик соматических клеток под микроскопом и вычислить плотность. Разбавить миоцитах Приблизительные концентрации 50 000 клеток/мл.
2. Добавить фура-2 acetoxymethyl (AM) запасов (кальция чувствительных красителя) в 1 мл суспензии миоцитах довести окончательное концентрации до 2 мкм. хранить в темноте для 20 мин при комнатной температуре.
3. Центрифуг в 150 g 30 s, и вновь приостановить кардиомиоцитов раствором NT 2 раза.
4. Очередь выключить свет и сохранить клетки в темноте. Место миоцитов в зале перфузии за 15 мин. Затем запустите палата перфузии (1,5 мл/мин) с NT решения. ПАСЕ миоцитами с 1 Гц поле стимуляции с помощью стимулятора (длительности волны 4.0 мс, амплитуда импульса 8.0 V) для 5 минут
5. Выберите myocyte с хорошей форме (форма стержня, острые края и снимите крест страт) и стабильной стимулировали дергаться (не спонтанное сужение) под 10 x микроскопического объектива. Далее измените микроскопические увеличение до 40 x и вращение ориентации камеры CCD держать myocyte в горизонтальном положении.
6. Рамка одного myocyte, регулируя адаптер обрамления ячеек. Убедитесь, что фон ясно.
7. Предоставляют миоцитах для света, излучаемого Ксеноновая лампа, 340 фильтров или с 380 Нм длины волны возбуждения и образ миоцитах через объектив 40 x. Обнаружение сигнала флуоресценции в 510 нм. В то же время, отметить изменения длины Саркомер миоцитов и запись одновременно с помощью мягкого края модуля.
8. Запись флуоресценции системой двойной возбуждения флуоресценции фотоэлектронный умножитель. Запустите программу записи для кальция изображений системы, щелкните " файл/новый файл " для создания нового файла записи и нажмите кнопку " начало " кнопку, чтобы длина синхронно записи флуоресценции и Саркомер.

6. Оценка SR Ca ^{2 +} резерв и диастолического Ca ^{2 +} функция удаления ^{7 , 8 , 9}

1. Interlink " выход Aux " порт в стимулятор с " аналог в " порт на клапана системы управления (например, командир клапан, см. Таблицу материалы), BNC кабель (для синхронизации сигнала TTL).
2. Пресет программа для переключения клапанов перфузии автоматически, как описано в ^{8 , 9}; Подробные шаги для операции перечислены следующим.
   1. Предустановки параметров в клапан управления программное обеспечение согласно таблице 2 и нажмите " скачать " кнопку, чтобы загрузить последовательность загрузки в программе. Нажмите кнопку " Триггэ " кнопку, чтобы включить функцию триггера.
      Примечание: Система управления клапаном может выполнить последовательность после получения сигнала TTL.
   2. Заданной стимулятор в последовательном режиме и установить параметры согласно таблице 3.
3. Задать стимулятор на " шаг S1 " ПАСЕ LV миоцитов в 1 Гц. начать иглы перфузии со скоростью 1,5 мл/мин с решением NT.
   Примечание: Потому что скорость потока иглы быстрее, чем камеры перфузии, преломление света иглы потока отличается от преломления света камеры перфузии. Разница преломление света указывает диапазон перфузии эффективного иглы, которая окружает целевой myocyte.
4. Выберите целевой myocyte под микроскопическим вид низкой мощности (в последовательности до вверх по течению), и убедитесь, что это может быть достигнуто путем микро кончиком карандаша. Измените масштаб микроскопа до 400 x. Вращение ориентации камеры CCD держать myocyte в горизонтальном положении. Отрегулируйте прямоугольные отверстия под клетки обрамление адаптер подходящее окно, которое наполняет миоцитов. Убедитесь, что минимальное фон; не позволяют другим миоцитами или мертвые клетки мусора в этом окне.
5. Отрегулировать положение зафиксировано на микроманипулятор карандаш и осторожно поместите кончик микро на расстояние радиуса поля зрения для целевого myocyte до 400 x микроскоп увеличением.
6. Настроить диапазон поток иглу в основном охватывают целевые myocyte и убедитесь, что myocyte не может быть сметены поток иглу.
7. После 60 s основные электрокардиостимуляции, рулон курсор, стимулятор " D2 шаг ".
   Примечание: Остальная часть протокола будет осуществляться автоматически стимулятор и система управления клапаном. На основе выше параметра, протокол может быть выполнена автоматически как рисунок 2A, 1 Гц основных ходить с NT решение для 60 s. Затем пауза ходить и задержки для 2 s, быстро переключиться на 10 мм кофеин перфузии для 15 s (функционально выпустить Ca ^{2 +} хранения в SR) и затем переключиться обратно на NT решение.
8. В конце записи, обнаружить фон флуоресценции для отдельных миоцитов. Нажмите кнопку " пауза " кнопку, чтобы приостановить файл запись, переместить микроскопические видом в близлежащем пустую область. Нажмите кнопку " запись " кнопку возобновить запись для секунд и запись численного 340 и 380 Нм значения интенсивности для коррекции фона.
9. Открытые " операции/константа " диалоговое окно и заполнить значения в " фон " составляют, соответственно, программное обеспечение может исправить фура 2 соотношение значения вычитанием фона.

7. Анализ данных ⁹

1. для измерения кальция переходные процессы и Саркомер сокращения на основные стадии стимуляции, среднем сокращающиеся импульсов и затем анализировать динамические параметры, такие как кальций транзиентов, постоянная времени кальция переходных распада (Тау-1 Гц), используя программное обеспечение автоматически.
   Примечание: Если программное обеспечение не соответствует сегмент распада хорошо, экспорт снижение трассировки для ручной моно экспоненциальной кривой.
2. Кальция, кофеин индуцированной импульсов, выберите только пульс с крутыми волны для анализа функции удаления кальция. Исключить ячейки с сигнал помехи, Аномальные пульс или те, которые текли прочь Мидуэй.
3. Измерения амплитуды импульса кофеин индуцированной кальция (Ca кофеин, индекс SRCa ^{2 +} резерва).
4. Получения постоянной времени распада кофеин индуцированной кальция импульса (Тау кофеин) на моно экспоненциальную кривую установку (продолжительность 10 s) вручную из программного обеспечения ( рис. 2 c).

Здесь, мы иллюстрируем Стрептозотоцин (СТЗ) - индуцированной диабетической крысы (DM) и возраст соответствует Sprague - Dawley (SD) к примеру крысы. 8-недельных самцов крыс SD (200 ± 20 г) получил однократной внутрибрюшной инъекции СТЗ (70 мг/кг, ip) для буфера цитрата или группы DM для контрольной группы. Через одну неделю после администрации СТЗ, крысы с глюкозы крови > 16.7 ммоль/Л, были рассмотрены диабетической. После 8 недель LV миоцитов были ферментативно изолированы. После возобновления кальция есть около 70-80% миоцитов, которые остаются в состоянии выживания. Только миоцитами с стержень форму, четкие страты и стабильной схватки были отобраны для записи (рис. 1B). Как показано на рисунке 1A, мы создали палаты перфузии и перфузии иглы для миоцитов. Перфузии клапаны и электрокардиостимуляции система автоматически переключается с предустановленной программы как описано в рисунке 2A. Флуоресценции внутриклеточного кальция был записан кальция, системы обработки изображений. Значения были сообщены как среднее ± SEM.

По сравнению с группой SD, DM группы показали значительное меньше амплитуда импульса кофеин индуцированной кальция (Ca кофеин) (0.332 ± 0,008 vs 0,276. ± 0,008, t тест: p < 0,05) и нижней долей кальция релиз SR (Ca-1 Гц / CA-Caffeine) (78.5 ± 1,5% против 72,1 ± 1,0%, t тест: p < 0,05) (рис. 2B). Тау-1 Гц и Тау кофеин были получены из моно экспоненциальной кривой; Группа DM показал замечательный дольше распада константы времени кофеин индуцированной кальция импульса (Тау кофеин) (1.822 ± 0,07 ms против. 2.896 ± 0,088 ms, т тест, p < 0,05) и более высокий уровень коэффициента Тау-1 Гц/Тау кофеин (0,076 ± 0,003 против. 0,086 ± 0,003, т тест, p < 0,05), чем в SD (Рисунок 2D). Эти результаты указал депрессии SR Ca^{2 +} резерв и нарушениями Ca^{2 +} Распродажа в диабетической кардиомиоцитов.

Рисунок 1. Иллюстрация системы перфузии и изолированных LV миоцитах. (A) Иллюстрация палата перфузии и карандаш перфузии. Стрелки указывают направление потока раствора NT в зале перфузии. Карандаш обеспечивает перфузии, окружающих целевой myocyte раствором NT или кофеин. Кончик микрон можно свободно манипулировать выше камеры. (B) микроскопические изолированных LV миоцитами с род форму и снимите крест страт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Оценка функции удаления резерва и кальция, SR кальция. (A) Иллюстрация протокола для переключения клапанов перфузии и электрокардиостимуляции системы автоматически. (B) статистика выпуске значения SR Ca^{2 +} резерва и SR дробных Ca^{2 +} 1 Hz стимулировал дергается в группах DM и SD. DM группы показали значительное снижение SR Ca^{2 +} резерв и SR дробных Ca^{2 +} релиз чем SD группы. (C) программного обеспечения панели показаны вручную моно экспоненциальной кривой для распада время постоянной кофеин индуцированной кальция импульса (Тау кофеин). (D) бар графики сравнения Тау кофеин и Тау-1 Гц/Тау кофеин между DM и SD группами. DM группы показали значительное увеличение значения Тау кофеин и Тау-1 Гц/Тау кофеина, чем SD группы. Значение = среднее ± SEM, t теста были выполнены, *p < 0,05 по сравнению с группой SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1. Решения для LV миоцитах изоляции и сотовых перфузии.

Таблица 2. Предустановленных параметров в системе управления клапан (клапан командир).

Таблица 3. Предустановки параметров в стимулятор.

Кальция поток освобожден от SR является основным Ca^{2 +} источником для систолы в сердце. До некоторой степени, амплитуда SR Ca^{2 +} контента и дробные Ca^{2 +} освобожден от SR отражают SR Ca^{2 +} резерв для сердечного сокращения. С другой стороны Ca^{2 +} резерв SR зависит от способности SR Ca^{2 +} reuptake, Ca^{2 +} утечка SR и их баланс через SR во время диастола^12,,1314. В нашем эксперименте быстрое применение кофеина 10 мм призвана побудить всего Ca^{2 +} выпуска и предотвратить Ca^{2 +} reuptake в SR, открыв в RyR канал. Таким образом амплитуда кофеин индуцированной Ca^{2 +} импульсный может использоваться в качестве индекса SR Ca^{2 +} резерва. Кроме того с основного темпов в 1 и 3 Гц, мы могли бы далее исследовать зависимость частоты SR нагрузки и ее основной механизм⁶.

Удаление Ca^{2 +} в цитоплазме имеет решающее значение для диастолической функции сердца. Как показано на рисунке 2А, на стадии 1 Гц поле стимуляции, снижение кальция транзиентов приписывали SERCA в SR, NCX в cytomembrane и медленно транспортных систем (митохондриальной Ca^{2 +} Унипорт и sarcolemmal Ca^{2 +} -АТФаза). Как вклад медленных механизмов является незначительным, постоянная времени распада Ca^{2 +} переходных (Тау-1 Гц) отражает комбинированное действие SERCA и NCX^7,8,9. На стадии кофеин перфузии SERCA удалось построить заповедник SR кальция. Таким образом снижение кальция, кофеин индуцированной импульса (Тау кофеин) было главным образом обусловлено NCX. Соответственно функция NCX является негативное отношение к Тау кофеин. NCX вклад диастолического Ca^{2 +} удаление положительное отношение к отношение Тау-1 Гц/Тау кофеин. SERCA вклад положительное отношение к разницу между Тау кофеин и Тау-1 Гц^7,8,9.

Для завершения процедуры успешно (рис. 2), есть некоторые технические ключевые моменты, которые следует отметить. Во-первых создание автоматизированной системы имеет решающее значение для темпов и перфузии системы коммутации точно. Предустановленные программы могли контролировать время задержки точно и быстро применять кофеин перфузии. Во-вторых во время процесса, миоцитов, рискуя подмывания раствором перфузии. Для держать миоцитах стабильно придерживаться палата блюдо, клетки должны помещаться в блюдо для более чем за 15 минут до начала записи.

Кроме того создание системы перфузии стабильной иглы для применения кофеина является еще один важный шаг. Существует три ключевых точек для этого шага: выключатель (1) быстрого канала и гладкой иглы перфузии, скорость потока (2) хорошо контролируемых перфузии и (3) правильное расстояние между кончиком иглы и целевых myocyte. Неуместным параметр скорости потока, расстояние наконечник или вмешательства в решение переключатель каналов может привести к сбой получения приемлемого кофеин индуцированной кальция пульс. Кофеин индуцированной кальция импульсов только пульс с гребнем крутые волны может быть выбран для анализа функции удаления кальция.

Альтернативный метод, основанный на системе патч зажим может обеспечить относительно точных данных. Однако некоторые факторы, такие как внутрь выпрямлять K⁺ тока, могут влиять точность. Кроме того более высокие требования, современное оборудование, квалифицированный техник и время потребления может также ограничить применение патч зажим. В некоторой степени наш протокол имеет ограничение, что он не может представить прямого значения нагрузки SR или деятельности SERCA и NCX. Параметры (например, Ca кофеин, Тау кофеин) только отражают меняющиеся SR содержание и вклад диастолического Ca^{2 +} удаления косвенно. Однако этот протокол имеет преимущество удобства, меньше ограничения техники и оборудования.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Эта работа была поддержана субсидий из национального фонда естественных наук Китая (№ 81100159, Dongwu Лай; 81401147, Чжан Juhong), медицинских и здравоохранения наук программа из провинции Чжэцзян (№ 201646246, Dongwu Лай) и медицинских наук и Технология план города Ханчжоу (№ 2013A28, Дин Лин).