分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca^{2 +}リザーブと心筋拡張期のカルシウム除去機能を評価するためのプロトコルについて述べる。

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。心筋の筋小胞体 (SR) は、reuptakes 細胞内 Ca^{2 +}安静時の収縮の Ca^{2 +}貯水池として機能します。ビートを利用できる SR Ca^{2 +}予備は心筋収縮性の予測、細胞内 Ca^{2 +}の除去は、心臓の拡張機能のために重大。糖尿病、心不全など、いくつかの病態生理学的条件下で障害カルシウム クリアランスと心筋細胞の Ca^{2 +}ストアは、心機能低下の進行状況に関与する可能性があります。ここでは、方式^{2 +}リザーブと拡張期の Ca^{2 +}除去を評価するプロトコルについて述べる。簡単に言えば、単一心筋細胞が酵素によって分離され、フラ 2 で示された細胞内の Ca^{2 +}蛍光カルシウム イメージング システムによって記録されました。合計 SR Ca^{2 +}放出を誘発するためにカフェインを採用するには、連動した刺激システムと灌流システムによって自動灌流スイッチ プログラムをプリセットします。その後、モノラル指数曲線のあてはめカルシウム濃度のカフェイン誘発性カルシウム パルス減衰時定数を分析に用いる。したがって、SR の Ca^{2 +}の貢献-ATPase (SERCA) と Na⁺-Ca^{2 +}交換 (NCX) 拡張期のカルシウムの除去を行った。

細胞内カルシウム ([Ca^{2 +}]_私) リサイクル¹心筋細胞の収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ご存知のように、カルシウム誘発性 Ca^{2 +}放出は収縮する電気信号に変換するカップリング、興奮収縮を開始します。膜の脱分極は、細胞膜の L 型 Ca^{2 +}チャネル、Ca^{2 +}を引き起こすはリアノジン受容体 2 (RyR2) を介した細胞質に SR からの解放をアクティブにします。一時的な上昇細胞質 Ca^{2 +}筋原線維の収縮を開始します。期には, 細胞質 Ca^{2 +}は SR Ca^{2 +}による SR に reuptaken-atp アーゼ 2 (SERCA2) と、Na⁺-Ca^{2 +}交換 (NCX)²を介して心筋のポンプ。このプロセスはリサイクル、心筋収縮緩和に します。

心臓の SR は収縮機械を囲む細胞内膜ネットワークです。それは収縮の Ca^{2 +}貯水池として機能、それがリラクゼーションの中に細胞内 Ca^{2 +} reabsorbs。ビートを利用できる SR Ca^{2 +}予備は心収縮力の確定です。一方、心臓の拡張期の細胞内 Ca^{2 +}の除去が欠かせません。いくつかの病態生理学的条件下で糖尿病、心不全、障害 Ca^{2 +}クリアランス、落ち込んで SR Ca^{2 +}など心筋に店が関与している心機能低下^{2,3 ,4}。

SR Ca^{2 +}放出と拡張期心筋細胞 Ca^{2 +}除去を測定するために、広く使用されている方法の 2 種類があります: パッチ ・ クランプ^5,6、およびカフェイン誘発性 Ca に基づいて NCX 電流の整合性^{2 +} Ca^{2 +}蛍光イメージング^7,8,9に基づくパルス。前者のアプローチは、Ca^{2 +} SR から解放主ポンプでくまれるセルから NCX によって事実に依存します。ただし、このアプローチは、高度な設備・熟練作業の条件によって制限されます。本研究では Ca^{2 +}パルスのカフェイン誘発性の Ca^{2 +}蛍光イメージング システムに基づく測定による SR Ca^{2 +}リザーブと心筋細胞の Ca^{2 +}除去を評価するための便利な方法をについて説明します。簡単に言えば、細胞内 Ca^{2 +}蛍光はフラ 2 で示されます。連動した刺激システムと灌流システム、によって灌流の切り替えとシステムを自動的にペーシングのためのプログラムを提案します。10 mM カフェインを用いて急速に SR で総 Ca^{2 +}放出を誘発します。カルシウム濃度のカフェイン誘発性カルシウム パルス指数関数的減衰時定数 (タウ) は、それに応じて拡張期の Ca^{2 +}除去 SERCA と NCX の貢献を反映するモノ指数曲線の当てはめから得られました。

機関動物のケアと使用実験研究センター、中国医学科学の中国アカデミー、浙江大学委員会によって承認されたプロトコルに従ってすべての動物実験を行なった

1 ソリューション準備

1. 表 1 で説明したようにすべてのソリューションを準備します。

2 分離の左心室 (LV) 心筋

注: 左心室心筋細胞は酵素によって前述 ⁷ Langendroff 灌流システムを使用して分離、^{、。 8 , 9 , , 10 11}.

1. Langendroff 灌流システムのセットアップ。通常 Tyrode (NT) ソリューションで灌流システムを埋める、36.5 ° C の温度設定、チューブに空気の泡を排除します
。
2. は、重さし、抱水クロラール (400 mg/kg) の腹腔内注入 (ip) による Sprague-dawley ラットの麻酔。5 分後尻尾や足指のピンチの応答を評価することで麻酔状態を確認
3. 手術用ハサミで剣状突起下腹腔内を開く、剣状突起を持ち上げ、シザーと胸を開きます。心膜を削除、わずかに持ち上げ心カーブタイプ鉗子で、大動脈弓を識別、心臓から大動脈のルートから鋏による切断します
。
4. は、60 mm ディッシュに心を転送し、NT ソリューションで洗っています。大動脈を持つ 2 つの微細解剖鉗子と蛍光灌流カニューレにマウントし、しっかりと縛る手術用縫合糸を使用してカニューレに大動脈
   。 注: 熟練したオペレーターが 15 内でこのプロセスを終えることができる s.
5. は、冠状動脈の循環を回復する 30 mL NT ソリューションと心臓を灌流します。その後、液を 30 mL Ca ^{2 +} に切り替える-無料の枝 (10 mM タウリン、1 mg/mL BSA) ハートビートを停止します。次に、コラゲナーゼ、分離ソリューション (0.6 mg/mL) 酵素の消化力のために、出納を切り替えます
   。 注: 使用コラゲナーゼは糖尿病ラットやコラゲナーゼ II での実験のための実験の糖尿病ラットなし
。
6. 20-25 分の消化力の後すぐに Ca ^{2 +} を灌流液を変更-無料の消化をさらに停止する枝。中心部を鉗子で保持、カニューレから切って、KB ソリューションを含む 35 mm ディッシュの中心の場所 (テーブル 1 を参照).
7. 解剖はさみ鉗子と左心室壁です。心房、右心室、房室接合部を切った。残りの組織は LV です。KB ソリューションと新しい 35 mm ディッシュにそれを転送します。LV の組織を細かくミンチします
。
8. ゆっくりピペットのフィルター処理されたプラスチック スポイト入りと 10 mL KB ソリューションで再停止します
。
9. は、150 μ m 絞りステンレス フィルター、および 15 mL 遠心管への転送の細胞をフィルター処理します。30 s と破棄上清の 150 x g で遠心分離機します。再 10 mL KB ソリューション、無料で細胞が 6 分のために解決を中断、上澄みを廃棄し、再 10 mL KB ソリューション内のペレットを中断します
   。 注: すべての手順を 100% O ₂ 毒ガス ソリューションで 36 ° C で行った
。

3。カルシウム再導入

1. KB ソリューションで 20 分間定住した後、上澄みを廃棄し、カルシウムの再導入溶液を細胞を再停止 (0.3 mM Ca ^{2 +}、4.5 mL Ca ^{2 +}-無料枝、1.5 mL NT ソリューション)10 分
2. カルシウム再導入液と B で上記の手順を繰り返します (0.3 mM Ca ^{2 +}、3 mL Ca ^{2 +}-無料枝、3 mL NT ソリューション).
3. は、NT ソリューション (1.2 mM Ca ^{2 +}) で利用可能な細胞を浄化するために上記の手順を繰り返します。このソリューションで孤立した左心室心筋細胞を保存し、研究それらを 4-6,

4。設定上の灌流システム

1. NT ソリューション室灌流 ( 図 1 a) の流入管を接続します
。
2. ターゲット細胞針灌流、多バレルのマニホールド ヒント (例えば、灌流鉛筆、今後鉛筆と呼ばれます) に接続、マニピュレーターで修正、バルブに灌流システムを制御します。NT ソリューションと 10 mM カフェイン ソリューションを鉛筆 ( 図 1 a) の各列に追加します
。
3. をはずして空気管に空気の泡を避難
。
4. 10 鉛筆数ミクロンの先端から点滴をカウント s、3 ドリップ/10 s のおおよその速度で流れの速度を保つために流量制御を手動で調整

5。細胞内 Ca ^{2 +} 過渡的筋節の短縮 ^{7 , 8 , 9} 測定

1. スライドで、ピペット 10 μ L 細胞懸濁液顕微鏡で細胞カウンターで細胞数をカウントし、密度を計算します。おおよそ 50,000 セル/ml 濃度に細胞を希釈します
。
2. 2 μ M に最終濃度をもたらす細胞の懸濁液 1 mL に追加 Fura 2 アセトキシメチルセファロスポリン (午前) 株式 (カルシウム敏感な染料) を室温で 20 分間暗闇の中で保持します
。
3. 150 g で 30 s、および再中断 2 時間を NT ソリューションと心筋細胞間遠心します
。
4. ターン、光と暗闇の中で細胞を維持します。15 分用灌流チェンバに筋紡錘を配置します。その後 NT ソリューション室灌流 (1.5 mL/分) を開始します。5 分刺激 (波期間 4.0 ms パルス振幅 8.0 V) を使用して 1 Hz 刺激と筋紡錘のペース
5. 形のよい細胞を選択 (棒状、鋭いエッジ、およびクロス縞をオフに)、顕微鏡の対物レンズ × 10 の下で安定した刺激収縮 (自発収縮なし)。次に、顕微鏡の倍率を 40 倍に変更し、水平方向の位置で、細胞を保つために CCD カメラの向きを回転します
。
6. フレーム単一心筋細胞フレーミング アダプターを調整することによって。バック グラウンドが明確であることを確認します
。
7. 340 または 380 nm 波長励起フィルターとキセノン ランプが発する光を細胞を公開し、40 × 対物を介して細胞をイメージします。510 で蛍光シグナルを検出 nm。一方で、心筋の筋節長変化に注意してくださいし、同時に柔らかい端モジュールを使用して記録します
。 光電子増倍管の二重励起蛍光測定システムによる
8. レコード蛍光。カルシウム イメージング システムの録音プログラムを実行をクリックして " ファイル/新しいファイル " 新しい記録ファイルを作成し、クリックする、" 開始 " 蛍光および筋節の長さを同期的に記録します
。

6。SR Ca ^{2 +} リザーブと拡張期の Ca ^{2 +} 除去機能 ^{7 , 8 , 9} 評価

1. Interlink、" Aux アウト " ポート刺激、" アナログの " バルブ制御システムのポート (例えば バルブの司令官、材料表 を参照) (TTL 信号を同期) に BNC ケーブルで
。
2. プリセット前述 ^{8 , 9}; として自動的に灌流バルブの切り替えのためのプログラム操作の詳細な手順については、次として表示されます。
   1. プリセット 表 2 に従って、ソフトウェアを制御し、バルブ内のパラメーター、" ダウンロード " プログラムにロード シーケンスをダウンロード] ボタンをクリックします。クリックして、" ・ トリッグ小胞体 " トリガー関数を有効にする] ボタンをクリックします
      。 注: バルブ制御システム TTL 信号を受信した後のシーケンスを実行することができます
   。
   2. シーケンス モードに刺激をプリセットし、表 3 に従ってパラメーターを設定します
   。
3. で刺激を設定 " S1 ステップ " LV のペースを細胞 1 Hz では NT ソリューションを 1.5 mL/min の速度で針灌流を開始。
   。 注意: 針ストリームの速度は灌流チャンバーよりも速く、針のストリームの光の屈折が灌流チャンバーの光の屈折とは異なる。光の屈折の違いは、ターゲット細胞をとりまく効果的な針灌流の範囲を示します
。
4. 選択 (上流に下流のシーケンス) の低消費電力ミクロな視点の下でターゲット細胞と確認されるによって到達できる鉛筆のマイクロ チップ。顕微鏡の倍率を 400 倍に変更します。水平方向の位置で、細胞を保つために CCD カメラの向きを回転させます。筋紡錘を格納する適切なウィンドウにセル フレーミング アダプターの下の長方形の開口部を調整します。最小限の背景があることを確認します。他の細胞またはこのウィンドウで死んだ細胞の残骸を認めていない
。
5. 鉛筆、マイクロマニピュレーターの固定の位置を調整し、顕微鏡倍率 x 400 未満ターゲット細胞に視界の半径の距離でマイクロ チップを慎重に配置します
。
6. 主ターゲット細胞をカバーし、心筋が針流れによって一掃できないことを確認してください針ストリームの範囲を調整します
。
7. 後 60 s の基本的なペーシング、カーソルを刺激する、" D2 ステップ ".
   注: プロトコルの残りの部分は、刺激とバルブ コントロール システムによって自動的に実行されます。上記の設定に基づき、プロトコルが自動的に実行される 図 2 a、1 Hz 基本 60 NT ソリューションとペーシングのように s。ペーシングと 2 の遅延、一時停止 s、15 の 10 mM カフェイン灌流に急速に切り替える (機能的、SR 内の Ca ^{2 +} ストレージをリリース) を s、NT ソリューションに切り替えてと
。
8. 記録の最後に、個々 の細胞のバック グラウンド蛍光を検出します。クリックして、" 一時停止 " ミクロな視点を近く空白エリアに移動記録、ファイルを一時停止するボタンです。クリックして、" レコード " 秒の記録を再開するボタンをクリックし、バック グラウンド補正の数値 340 と 380 nm の強度値を記録します
。
9. オープン、" 操作/定数 " ダイアログ ボックスでに値を入力し、" 背景 "、それぞれを形成; ソフトウェアは、バック グラウンドを引いて Fura 2 比率値を修正できます
。

7。データ分析 ⁹

1. カルシウム トランジェントおよび基本的なペーシングの段階で短縮筋の測定、収縮パルスの平均値、カルシウム濃度、時定数などの動的パラメーターを分析します。カルシウム一時的な崩壊 (タウ 1 Hz)、自動的にソフトウェアを使用しています
   。 注: ソフトウェアの decay セグメントがうまく適合しない場合は、手動のモノラル指数曲線のあてはめの減少トレースをエクスポートします
。
2. カフェイン誘発性カルシウム パルス カルシウム除去機能の解析のための急な波とパルスのみを選択します。信号障害、異常パルスまたはそれらの距離の中間を流れていたセルを除外します
。
3. カフェイン誘発性カルシウム パルス (Ca-カフェイン、方式 ^{2 +} 予備のインデックス) の振幅を測定します
。
4. モノラル指数曲線あてはめ (10 時間) 手動でソフトウェア ( 図 2) からカフェイン誘発性カルシウム パルス (タウ カフェイン) の減衰時定数を取得します
。

ストレプトゾトシン (STZ) - 誘発糖尿病ラット (DM) と年齢をマッチさせたスプレイグ - を示すここで、ドーリー (SD) ラットの例。8 週齢雄 SD ラット (200 ± 20 g) は、管理グループのための DM グループまたはクエン酸バッファーの STZ (70 mg/kg, ip) の単一腹腔内注射を受けた。STZ 投与後 1 週間ラット血糖値と > 16.7 ミリ モル/L が糖尿病と考えられていた。8 週間後左心室心筋細胞は酵素によって分離されました。カルシウム再導入後の生存状態のまま細胞の約 70-80% があります。ロッド形、明確な縞および安定した収縮の唯一の細胞は (図 1 b) を記録するために選ばれました。図 1 aのように、我々 は商工会議所の血流と細胞の針灌流を設定します。プリセット ・ プログラムされた自動的に灌流バルブとペーシング システムを切り替える図 2 aで説明したようです。細胞内カルシウム蛍光イメージング システム カルシウムによって記録されました。値は、平均 ± SEM. として報告されました。

SD 群と比較して、DM 群, カフェイン誘発性カルシウム パルス (Ca カフェイン) の低い振幅が大きく (0.332 ± 0.008 対. 0.276 ± 0.008、t-テスト: p < 0.05) と低い小数カルシウム放出 SR (Ca 1 Hz/Ca-caffeine) (78.5 ± 1.5 %72.1 ± 1.0%、対 t 検定: p < 0.05) (図 2 b)。タウ 1 Hz とタウ カフェイン吊せますモノラル指数曲線から得られました。DM グループを示した顕著な長い減衰カフェイン誘発性カルシウム パルス (タウ カフェイン) の時定数 (1.822 ± 0.07 ms 対. 2.896 ± 0.088 ms, t 検定, p < 0.05) とタウ 1 Hz/タウ-カフェイン比 (0.076 ± 0.003 対.のより高いレベル0.086 ± 0.003, t 検定, p < 0.05) SD グループ (図 2 D) より。これらの結果は、落ち込んで SR Ca^{2 +}予備を示され、糖尿病心筋細胞内の Ca^{2 +}クリアランスの障害。

図 1。灌流システムと孤立した左心室心筋のイラスト。商工会議所の血流と灌流鉛筆の (A) のイラスト。矢印は、灌流チェンバの NT ソリューションのフローの方向を示します。鉛筆は、NT やカフェイン溶液でターゲット細胞を周囲の血流を提供します。ミクロンのチップは、商工会議所の上自由に操作できます。(B) の微視的見解はロッド形左心室心筋細胞を分離し、クロスの縞をクリアします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2。SR カルシウム リザーブとカルシウム除去機能の評価.灌流バルブの切り替えとシステムを自動的にペーシング用のプロトコルの (A) のイラスト。1 Hz の刺激 SR Ca^{2 +}リザーブと SR 分数 Ca^{2 +}の値のリリース (B) 統計が DM と SD グループにひきつる。DM グループ示した大幅減少した SR Ca^{2 +}リザーブと SR 分数 Ca^{2 +} SD グループよりリリースします。(C) ソフトウェア パネル カフェイン誘発性カルシウム パルス (タウ カフェイン) 一定減衰時間にふさわしい手動でモノラル指数曲線を示します。(D) タウ カフェインとタウ 1 Hz/タウ-カフェイン DM と SD グループ間比較棒グラフ。DM グループは、タウ カフェインとタウ 1 Hz タウ - SD グループよりもカフェインの重要な増加値を示した。値 = 平均 ± SEM は、t 検定を行った、 *p < 0.05 は SD 群と比較して。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1。LV 細胞の分離と細胞の灌流のためのソリューション。

表 2。バルブ コントロール システム (バルブ司令官) のパラメーターのプリセットします。

表 3。刺激のパラメーターのプリセット。

SR からリリースされたカルシウム変化は心臓の収縮の Ca^{2 +}の主要な源です。程度、SR Ca^{2 +}コンテンツの振幅および小数部の Ca^{2 +} SR からリリース心筋収縮のため利用できる SR Ca^{2 +}予備を反映します。その一方で、SR の Ca^{2 +}予備は拡張期^12,13,14の間に SR で SR Ca^{2 +}再取り込み、Ca^{2 +} SR のリークとそのバランスの能力に依存します。私たちの実験では 10 mM カフェインの急速なアプリケーションは総 Ca^{2 +}リリースおよび RyR チャネルを開いて、SR 内の Ca^{2 +}再取り込みを防ぐを誘導するために目指しています。このように、カフェイン誘発性 Ca^{2 +}パルスの振幅は、SR Ca^{2 +}予備のインデックスとして使用できます。さらに、1 Hz と 3 Hz で基本的なペーシングと我々 さらに SR 負荷とその基になる機構⁶の周波数依存性を調査するでした。

Ca^{2 +}細胞質の除去は、心臓の拡張期機能にとって重要です。カルシウム濃度の低下が、有棘と遅い輸送システム (ミトコンドリアの Ca^{2 +}細胞と細胞膜の Ca 2 +^{で SR で SERCA、NCX に起因した 1 Hz 刺激の段階で図 2 aに示すように、}-Atp アーゼ)。遅いメカニズムの寄与は無視、Ca^{2 +}過渡 (タウ 1 Hz) の減衰時定数 SERCA NCX^7,8,9の結合されたアクティビティが反映されます。カフェイン灌流の段階で、SERCA は SR カルシウム リザーブを作成できませんでした。したがって、カフェイン誘発性カルシウム パルス (タウ カフェイン) の衰退は NCX に主に起因しました。同様に、NCX 関数はタウ カフェインに関連すると負の値です。拡張期の Ca^{2 +}除去 NCX 貢献はタウ 1 Hz/タウ-カフェインの比率に関連する肯定的です。SERCA 貢献はタウ カフェインとタウ 1 Hz^7,8,9の違いに関連する肯定的です。

手順を正常に完了する (図 2)、注意すべきいくつかの技術的な重要ポイントがあります。まず、自動化システムの確立は、ペーシングと灌流システムを正確に切り替えに重要です。プリセット プログラムは、遅延時間を正確に制御でき、カフェイン灌流を急速に適用。第二に、過程で、筋紡錘は灌流液によって洗い流されている危険を冒しています。維持する筋紡錘が商工会議所の皿に安定付着、セルは録音の前に 15 分以上の皿に配置する必要があります。

さらに、カフェインのアプリケーションのための安定した針灌流システムの設定は、別の重要なステップです。このステップの 3 つ重要なポイントがある: (1) 高速チャネル ・ スイッチと滑らかな針灌流、(2) 制御された血流流速 (3) 適切な針の先端間の距離し、心筋を対象します。許容カフェイン誘発性カルシウム パルスを取得に失敗した流速、先端間隔、またはソリューション チャネル スイッチに干渉の不適切な設定があります。カフェイン誘発性カルシウム パルスのカルシウム除去機能の解析のため急な波高のパルスのみを選択でした。

パッチ ・ クランプ システムに基づいて別の方法は、比較的正確なデータを提供できます。しかし、内向き整流性 K⁺現在など、いくつかの要因は、精度に影響可能性があります。さらに、先進的な設備、熟練した技術者、および時間消費の高い要件もパッチ ・ クランプのアプリケーションを制限可能性があります。ある程度私達のプロトコル SR 負荷の値を直接または SERCA NCX の活動が提供できなかったという制限があります。(例えばCa-カフェイン、タウ カフェイン) のパラメーターのみない変化の SR コンテンツと拡張期の Ca^{2 +}除去への貢献を直接反映します。しかし、このプロトコルより少ない制限の技術と設備の利便性の利点があります。

著者が明らかに何もありません。

この作品は中国の国家自然科学基金からの助成金によって支えられた (号 81100159、修習ライ; 81401147、区張)、医療と健康科学プログラムの浙江省 (号 201646246、修習 Lai)、健康科学、杭州市 (第 2013A28 号、丁林) の技術計画。