Evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Aquí, describimos un protocolo para evaluar el Ca^{2 +} reserva de retículo sarcoplásmico y función para eliminar calcio diastólico en los cardiomiocitos por un sistema de imagen de calcio.

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Cardiaco retículo sarcoplásmico (SR) sirve como un depósito de Ca^{2 +} para la contracción, que reuptakes intracelular Ca^{2 +} durante la relajación. El SR Ca^{2 +} reserva disponible para golpes es determinada para contractibility cardiaca, y la eliminación de Ca intracelular^{2 +} es crítica para la función diastólica cardíaca. Bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes y la insuficiencia cardíaca, remoción de calcio deteriorada y SR Ca^{2 +} tienda en cardiomiocitos pueden implicar en el progreso de la disfunción cardiaca. Aquí, describimos un protocolo para evaluar SRCa^{2 +} reserva y diastólica Ca^{2 +} extracción. Brevemente, un cardiomiocito solo fue enzimático aislado, y la intracelular Ca^{2 +} fluorescencia indicada con Fura-2 se registró por un sistema de proyección de imagen del calcio. Para emplear cafeína para inducir total SR Ca^{2 +} liberación, preselección de un programa de interruptor automático de la perfusión por la interconexión del sistema de estimulación y el sistema de perfusión. Entonces, la guarnición de curva exponencial mono fue utilizada para analizar las constantes de tiempo de decaimiento de calcio transitorios y pulsos de calcio inducida por la cafeína. En consecuencia, la contribución de la SR Ca^{2 +}-ATPasa (SERCA) y Na⁺-Ca^{2 +} cambiador (NCX) a quitar calcio diastólico se evaluó.

Calcio intracelular ([Ca^{2 +}]) reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en cardiomiocitos¹. Como sabemos, inducida por el calcio Ca^{2 +} lanzamiento inicia la excitación-contracción de acoplamiento, que traducen la señal eléctrica a la contracción. Despolarización de la membrana activa lo sarcolemales Ca tipo L^{2 +} canales, que inducen Ca^{2 +} lanzamiento de SR en el citoplasma a través de receptores de Ryanodina (RyR2) de 2. La transitoria elevada citoplásmicas Ca^{2 +} inicia la contracción de las miofibrillas. Durante el diástole, citoplásmicas Ca^{2 +} es reuptaken en el SR con el SR Ca^{2 +}-ATPasa 2 (SERCA2) y bombeado en el cardiomiocito a través de la Na⁺-Ca^{2 +} cambiador (NCX)². Este proceso conduce a la contracción y relajación de los cardiomiocitos.

El SR cardiaco es una red intracelular de la membrana que rodea la maquinaria contráctil. Sirve como un depósito de Ca^{2 +} para la contracción, y reabsorbe Ca intracelular^{2 +} durante la relajación. El SR Ca^{2 +} reserva disponible para beats es determinada para la contractilidad cardiaca. Mientras tanto, la eliminación de Ca intracelular^{2 +} es crítica para la diástole cardiaca. Bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes e insuficiencia cardíaca, alteración Ca^{2 +} despacho y deprimido SR Ca^{2 +} tienda en cardiomiocitos puede estar involucrado en el proceso de disfunción cardiaca^{2,3 ,4}.

Para medir Ca SR^{2 +} liberación y diastólica Ca^{2 +} retiro en cardiomiocitos, hay dos métodos ampliamente utilizados: la integridad de la corriente NCX basado en abrazadera del remiendo^5,6y el Ca inducida por la cafeína ^{2 +} pulso basado en Ca^{2 +} fluorescencia imagen^7,8,9. Lo anterior depende el hecho de que el Ca^{2 +} de la SR es en gran medida bombeada fuera de la célula por NCX. Sin embargo, este enfoque está limitado por sus requerimientos de equipo avanzado y experto. En el presente estudio, describimos un método conveniente para evaluar reserva de SR Ca^{2 +} y Ca^{2 +} retiro en miocitos mediante la medición de un inducido por cafeína Ca^{2 +} pulso basado en un Ca^{2 +} fluorescencia sistema de imagen. Brevemente, intracelular Ca^{2 +} fluorescencia indica Fura-2. Por la interconexión del sistema de estimulación y sistema de perfusión, presentamos un programa para la perfusión y el sistema de estimulación automáticamente. cafeína 10 mM fue empleada para inducir rápidamente la total liberación de Ca^{2 +} en el SR. Las constantes de tiempo de decaimiento exponencial (Tau) de calcio transitorios y pulsos de calcio inducida por la cafeína se obtuvieron de mono exponencial curva de ajuste, que reflejan la contribución de SERCA y NCX para diastólica Ca^{2 +} retiro en consecuencia.

animal todos los experimentos fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en el centro de Investigación Experimental, Academia China de ciencias médicas chinas y la Universidad de Zhejiang.

1. preparación de la solución

1. preparar todas las soluciones como se describe en la tabla 1.

2. aislamiento de izquierda Ventricular (LV) cardiomiocitos

Nota: LV cardiomiocitos son aisladas enzimáticamente mediante un sistema de perfusión de Langendroff como se describió anteriormente ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

1. Instalar el sistema de perfusión Langendroff. Llene el sistema de perfusión con solución Tyrode Normal (NT), temperatura 36,5 ° c y eliminar cualquier burbuja de aire en el tubo de.
2. Pesan y anestesiar una rata Sprague-Dawley por inyección intraperitoneal (ip) de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirme el estado anestésico evaluando respuesta pizca de cola o dedo del pie después de 5 minutos
3. Abrir la cavidad abdominal debajo del proceso xifoides con una tijera quirúrgica, levante el proceso xifoides y abre el cofre con la tijera. Quitar el pericardio, levante levemente el corazón con fórceps curvado, identificar el arco aórtico y cortar el corazón de tijeras de la raíz de la aorta.
4. Transferir el corazón a un plato de 60 mm y lavarlo con solución de NT. Mantener la aorta con dos pinzas de disección micro y móntelo en la cánula de perfusión de Langendorff y luego ligar firmemente la aorta en la cánula utilizando suturas quirúrgicas.
   Nota: Un operador experto puede terminar este proceso dentro de los 15 s.
5. Inundar el corazón con solución 30 mL NT para recuperar la circulación de las arterias coronarias. Luego, cambiar la solución 30 ml Ca ^{2 +}-libre solución de Tyrode (taurina, 1 mg/mL BSA de 10 mM) para detener los latidos del corazón. A continuación, cambie la solución a la solución de aislamiento de colagenasa A (0,6 mg/mL) para la digestión de la enzima.
   Nota: Uso colagenasa para experimentos con ratas diabéticas o colagenasa II para experimentos sin ratas diabéticas.
6. Después de la digestión para 20-25 minutos, cambiar rápidamente la solución de perfusión para el Ca ^{2 +}-libre solución Tyrode para detener aún más la digestión. Luego, mantenga el corazón con unas pinzas, cortado de la cánula y coloque el corazón en un plato de 35 mm que contenga solución KB (ver tabla 1).
7. Disecan la pared del LV con tijeras y pinzas. Corte la aurícula, ventrículo derecho y zona de la ensambladura auriculoventricular. El tejido restante es LV; traslado a una nueva placa de 35 mm con solución KB. Pique el tejido del LV en pedazos pequeños.
8. Pipetear las piezas con un gotero plástico filtrada y resuspender en solución de 10 mL KB.
9. Filtro de las células con 150 μm filtro de acero inoxidable de abertura y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue a 150 x g por 30 s y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender los miocitos en solución de 10 mL KB, reposar 6 minutos, descartar el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en solución de 10 mL KB.
   Nota: Todas las medidas se realizaron a 36 ° C en soluciones de gaseado con 100% O ₂.

3. Reintroducción de calcio

1. después de colocar por 20 min en solución KB, deseche el sobrenadante y resuspender los miocitos con solución de calcio reintroducción A (0.3m m Ca ^{2 +}, 4,5 mL Ca ^{2 +}-solución de Tyrode gratuita, NT de 1,5 mL de solución) durante 10 minutos
2. Repita el procedimiento anterior con solución de reintroducción de calcio B (0,3 mM Ca ^{2 +}, 3 mL Ca ^{2 +}-solución de Tyrode gratuita, NT de 3 mL de solución).
3. Repita el procedimiento anterior con solución de NT (1.2m m Ca ^{2 +}) para purificar los miocitos disponibles. Los miocitos aislados de LV en esta solución y estudiar dentro de 4-6 h.

4. Set Up de perfusión sistema

1. Conecte el tubo de entrada con la solución de NT para la perfusión de la cámara ( figura 1A).
2. Para perfusión de aguja de la blanco del miocito, conecte la punta múltiple multi-cañón (p. ej., lápiz de perfusión, conocido en adelante como lápiz), fijo en el instrumental quirúrgico, a la válvula de control sistema de perfusión. Añadir solución de NT y cafeína 10 mM a cada columna del lápiz ( figura 1A).
3. Evacuar cualquier burbuja de aire en los tubos para evitar la obstrucción de aire.
4. Cuenta el número de goteo desde la punta del micrón del lápiz de 10 s y ajustar manualmente el regulador de flujo para mantener la velocidad del flujo a una velocidad aproximada de 3 s. de goteo/10

5. Las mediciones de Ca intracelular ^{2 +} transitorio y el acortamiento del sarcómero ^{7 , 8 , 9}

1. suspensión pipeta 10 μL en la diapositiva, contar el número de células por un contador de células bajo el microscopio y calcular la densidad. Diluir los miocitos a una concentración aproximada de 50.000 células/mL.
2. Añadir el Fura-2 acetoxymethyl (AM) stock (un colorante sensible de calcio) en una suspensión de 1 mL de miocitos para llevar la concentración final de 2 μm. mantener en la oscuridad por 20 min a temperatura ambiente.
3. Centrifugar a 150 g durante 30 s y volver a suspender los cardiomiocitos con solución de NT 2 veces.
4. Giro de la luz y mantener las células en la oscuridad. Colocar los miocitos en la cámara de perfusión durante 15 minutos. Luego iniciar la perfusión de cámara (1.5 mL/min) con solución de NT. Ritmo de los miocitos con estimulación de campo de 1 Hz usando un estimulador (duración de onda ms de 4,0, amplitud de pulso 8.0 V) durante 5 minutos
5. Seleccione un miocito con buena forma (forma de varilla, filo y claro estriaciones cruzadas) y contracción estimulada estable (sin contracción espontánea) debajo de los 10 x objetivo microscopio. A continuación, cambiar la ampliación microscópica a 40 x y girar la orientación de la cámara CCD para mantener el miocito en posición horizontal.
6. Marco el miocito solo ajustando el adaptador de estructura celular. Asegúrese de que el fondo es claro.
7. Exponer los miocitos a la luz emitida por una lámpara de xenón, con 340 380 nm longitud de onda excitación filtros o y la imagen de los miocitos a través de un objetivo de 40 x. Detectar la señal de fluorescencia a 510 nm. Mientras tanto, tenga en cuenta los cambios de longitud de sarcómera de los miocitos y grabar utilizando el módulo de borde suave al mismo tiempo.
8. Registro de la fluorescencia por un sistema de fotomultiplicador doble excitación de fluorescencia. Ejecute el programa de grabación para el calcio en el sistema de imagen, haga clic en " archivo/nuevo archivo " para crear un nuevo archivo de registro y haga clic en la " Inicio " botón para longitud de sarcómero y fluorescencia síncrono registro.

6. Evaluación de la Ca de SR ^{2 +} reserva y diastólica Ca ^{2 +} función eliminar ^{7 , 8 , 9}

1. Interlink el " Aux Out " puerto de el estimulador con el " análogo en " puerto en el sistema de control de válvula (p. ej., comandante de la válvula, véase Tabla de materiales) por un cable BNC (para sincronizar la señal de la TTL).
2. Preset un programa para cambiar las válvulas de perfusión automáticamente como se describió anteriormente ^{8 , 9}; Pasos detallados para la operación se enumeran como sigue.
   1. Predefinidos los parámetros de la válvula de controlan de software según la tabla 2 y haga clic en el " descargar " el botón para descargar la secuencia de cargado en el programa. Haga clic en el " TriggER " botón para activar la función de trigger.
      Nota: El sistema de control de la válvula puede ejecutar la secuencia después de recibir la señal de la TTL.
   2. Preset el estimulador a modo de secuencia y definir los parámetros según la tabla 3.
3. Set estimulador en " S1 paso " a paso LV miocitos a 1 Hz. iniciar la perfusión de la aguja a la velocidad de 1,5 mL/min con solución NT.
   Nota: Debido a la velocidad de la corriente de la aguja es más rápido que la perfusión de la cámara, la refracción de la luz de la secuencia de la aguja es diferente de la refracción de la luz de la perfusión de la cámara. La diferencia de refracción de la luz indica el rango de perfusión aguja eficaz, que rodea el destino del miocito.
4. Seleccione un destino del miocito bajo visión microscópica de baja potencia (en la secuencia de abajo a arriba), y asegúrese de que se puede llegar por la micro punta del lápiz. Cambiar la ampliación del microscopio a 400 x. Girar la orientación de la cámara CCD para mantener el miocito en posición horizontal. Ajuste la abertura rectangular en el adaptador de estructura celular a una ventana conveniente que llena de los miocitos. Asegurar que exista un mínimo fondo; No permita que otros miocitos o restos de células muertas en esta ventana.
5. Ajustar la posición del lápiz en el instrumental quirúrgico y cuidadosamente coloque la punta de la micro a la distancia del radio del campo de visión para el miocito blanco bajo 400 x aumentos de microscopio.
6. Ajustar el rango de corriente de aguja para sobre todo cubrir el objetivo del miocito y asegúrese de que el miocito no puede ser arrastrado por el flujo aguja.
7. Después de 60 s básicos de estimulación, rodar el cursor estimulador para el " paso D2 ".
   Nota: El resto del Protocolo se ejecutarán automáticamente por el estimulador y el sistema de control de la válvula. Basado en el ajuste anterior, el protocolo podría ser ejecutado automáticamente como en la figura 2A, básica de estimulación con solución de NT para 60 1 Hz s. Luego pausa estimulación y demora de 2 s, rápidamente cambiar a perfusión de cafeína de 10 mM de 15 s (funcionalmente libera Ca ^{2 +} almacenamiento en SR) y luego cambiar a solución NT.
8. Al final de la grabación, detectar la fluorescencia de fondo para miocitos individuales. Haga clic en el " pausa " botón para pausar el archivo de registro, mover el punto de vista microscópico a una zona en blanco. Haga clic en el " registro " botón para reanudar la grabación durante segundos y grabar numérico 340 y 380 nm intensidad los valores de corrección de fondo.
9. Abierto el " operación, constante " cuadro de diálogo y llenar los valores en el " fondo " forman, respectivamente, el software puede corregir Fura 2 valores del cociente restando el fondo.

7. Análisis de datos ⁹

1. para la medición de calcio transitorios y sarcómeras acortamiento en la fase de establecimiento del paso básica, promedio de los impulsos de contracción y luego analizar parámetros dinámicos, como oscilaciones de calcio, la constante de tiempo de deterioro transitorio del calcio (Tau-1 Hz), utilizando el software automáticamente.
   Nota: Si el software no entra bien el segmento de decaimiento, exportar el rastro de decadencia para la guarnición de curva exponencial mono manual.
2. Pulsos de calcio inducida por la cafeína, seleccione sólo el pulso con una onda escarpada para el análisis de la función de eliminación de calcio. Excluir las células con alteración de la señal, pulso anormal o que fluyó a mitad del camino centraa.
3. Medir la amplitud del pulso de calcio inducida por la cafeína (Ca-cafeína, un índice de SRCa ^{2 +} reserva).
4. Obtener la constante de tiempo de decaimiento del pulso de calcio inducida por la cafeína (Tau-cafeína) instalando mono exponencial curva (duración de 10 s) manualmente desde el software ( figura 2).

Aquí ilustramos streptozotocin (STZ) - indujo ratas diabéticas (DM) y pareados por edad Sprague - Dawley (SD) las ratas por ejemplo. las ratas macho SD 8 semanas de edad (200 ± 20 g) recibieron una inyección intraperitoneal de STZ (70 mg/kg, ip) para el búfer de grupo o citrato de DM en el grupo control. Una semana después de la administración de STZ, ratas con glucosa en la sangre > 16,7 mmol/L se considera diabético. Después de 8 semanas, los miocitos del LV se aislaron enzimáticamente. Después de la reintroducción del calcio, hay cerca de 70-80% de los miocitos que quedan en el estado de supervivencia. Miocitos único con forma de barra, estriaciones claras y estables contracciones fueron seleccionados para la grabación (figura 1B). Como se muestra en la figura 1A, hemos creado la cámara perfusión y perfusión aguja de miocitos. Válvulas de perfusión y el sistema de estimulación se conecta automáticamente por un programa preestablecido como se describe en la figura 2A. La fluorescencia de calcio intracelular fue grabada por un sistema de imagen de calcio. Valores fueron registrados como la media ± SEM.

En comparación con el grupo de SD, el grupo DM mostró significativa menor amplitud del pulso de calcio inducida por la cafeína (Ca-cafeína) (0,332 ± 0.008 vs. 0.276 ± 0.008, t-test: p < 0.05) y una menor liberación de fraccional de calcio SR (Ca-1 Hz / CA-caffeine) (78,5 ± 1.5% vs 72,1 ± 1.0%, t-test: p < 0.05) (figura 2B). El Tau-1 Hz y Tau-cafeína se obtuvieron de mono exponencial curva de ajuste; el grupo DM mostró notable decaimiento más constantes del tiempo de pulso de calcio inducida por la cafeína (Tau-cafeína) (1,822 ± 0,07 ms vs. 2.896 ± 0,088 ms, prueba t, p < 0.05) y un nivel más alto en proporción de 1 Tau Tau/Hz-cafeína (0,076 ± 0,003 vs. 0,086 ± 0,003, prueba t, p < 0.05) que el grupo de SD (Figura 2D). Estos resultados indican la depresión SR Ca^{2 +} reserva y deterioraron el Ca^{2 +} despacho en cardiomiocitos diabética.

Figura 1. Ilustración del sistema de perfusión y miocitos aislados de LV. Ilustración (A) de la cámara perfusión y perfusión de lápiz. Las flechas indican la dirección del flujo de la solución de NT en la cámara de perfusión. El lápiz ofrece perfusión que rodea el destino del miocito con solución NT o cafeína. La punta de micrones se puede manipular libremente por encima de la cámara. Vista microscópica (B) del aislado del LV miocitos con forma de barra y claro estriaciones cruzadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Evaluación de la función de eliminación de calcio calcio y reserva de SR. (A) ilustración del protocolo para la conmutación de las válvulas de la perfusión y estimulación sistema automáticamente. Estadística (B) valores de SR Ca^{2 +} reserva y SR fraccionario Ca^{2 +} lanzamiento de 1 Hz estimula contracciones en los grupos de MS y SD. El grupo de MS mostró significativa disminución SR Ca^{2 +} reserva y SR fraccionario Ca^{2 +} de liberación que el grupo de SD. (C) Software panel mostrando una curva manualmente mono-exponencial para el tiempo de decaimiento constante del pulso de calcio inducida por la cafeína (Tau-cafeína). (D) gráficos de barras que comparaban la cafeína Tau y Tau-1 Hz Tau-cafeína entre los grupos MS y SD. El grupo DM mostró valores significativos aumento de cafeína Tau y Tau-1 Hz/Tau-cafeína que el grupo de SD. Valor = media ± SEM, se realizaron test de la t, *p < 0.05 en comparación con el grupo de SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Soluciones para perfusión de aislamiento y celular de miocitos del LV.

Tabla 2. Preajuste de parámetros en el sistema de control de válvula (comandante de la válvula).

Tabla 3. Preajuste de parámetros en el estimulador.

Flujo de calcio liberado de lo SR es el Ca^{2 +} fuente principal para la sístole en el corazón. A cierto punto, la amplitud del SR Ca^{2 +} contenido y el fraccionario Ca^{2 +} de la SR reflejan el SR Ca^{2 +} reserva disponible para la contracción cardiaca. Por otra parte, la Ca^{2 +} reserva de SR depende de la capacidad de la recaptación de Ca SR^{2 +} , Ca^{2 +} fuga de SR y su equilibrio a través del SR durante diástole^12,13,14. En nuestro experimento, aplicación rápida de la cafeína de 10 mM se pretende inducir total Ca^{2 +} liberación y evitar la recaptación de Ca^{2 +} en el SR abriendo el canal de RyR. Por lo tanto, la amplitud de^{la cafeína inducida por Ca 2 +} pulso podría utilizarse como un índice de reserva de SR Ca^{2 +} . Además, con paso básico en 1 Hz y 3 Hz, además podríamos investigar la dependencia de frecuencia de carga de SR y su subyacente mecanismo⁶.

Remoción de Ca^{2 +} en el citoplasma es crítico para la función diastólica cardíaca. Como se muestra en la figura 2A, en la etapa de estimulación de campo de 1 Hz, la disminución de las oscilaciones de calcio fue atribuida a SERCA del SR, NCX en el cytomembrane y sistemas de transporte lento (Ca^{2 +} uniporter mitocondrial y Ca sarcolemales^{2 +} -ATPasa). Como la contribución de mecanismos lentos es insignificante, la constante de tiempo de decaimiento de Ca^{2 +} transitorios (Tau-1 Hz) refleja la actividad combinada de SERCA y NCX^7,8,9. En la fase de perfusión de cafeína, SERCA no se pudo construir la reserva de calcio SR. Así, la disminución del pulso de calcio inducida por la cafeína (Tau-cafeína) fue atribuida principalmente a NCX. En consecuencia, la función NCX es negativa como relevantes a la Tau-cafeína. La contribución de NCX diastólica Ca^{2 +} eliminación es positiva como pertinentes a la relación de Tau-1 Hz/Tau-cafeína. La contribución de SERCA es positiva según corresponda a la diferencia entre cafeína Tau y Tau-1 Hz^7,8,9.

Para completar con éxito el procedimiento (figura 2), hay algunos puntos claves técnicas que deben señalarse. En primer lugar, establecer un sistema automatizado es fundamental para cambiar el sistema de estimulación y perfusión precisamente. El programa preestablecido puede controlar exactamente el tiempo de retardo y aplicar rápidamente la perfusión de la cafeína. En segundo lugar, durante el proceso, los miocitos son a riesgo de ser arrastrado por la solución de perfusión. Para el mantenimiento de que los miocitos estable adheridos al plato de cámara, las células deben colocarse en el plato durante más de 15 minutos antes de grabar.

Además, establecer un sistema de perfusión aguja estable para el uso de la cafeína es un paso crítico. Hay tres puntos clave para este paso: conmutador de canal (1) rápida y perfusión aguja suave, velocidad del flujo de perfusión (2) bien controlados y (3) adecuada distancia entre la punta de la aguja y destino del miocito. Inadecuado ajuste de la velocidad de flujo, distancia de la punta o interferencia en el interruptor de canal de solución puede resultar en el fracaso de la adquisición de un pulso de calcio inducida por la cafeína aceptable. Para pulsos de calcio inducida por la cafeína, sólo el pulso con una cresta de ola empinada puede seleccionarse para el análisis de la función de eliminación de calcio.

El método alternativo basado en el sistema de la abrazadera del remiendo puede proporcionar datos relativamente precisos. Sin embargo, algunos factores, como interno rectificando K⁺ corriente, pueden influir en la precisión. Además, un requisito más alto de equipo avanzado, técnico especializado y tiempo de consumo también puede limitar el uso de patch-clamp. En cierta medida, nuestro protocolo tiene la limitación que no puede dar valores directos de carga SR o actividad de la SERCA y NCX. Los parámetros (p. ej., Ca-cafeína, cafeína Tau) sólo reflejan cambio contenido de SR y contribución a la eliminación de Ca^{2 +} diastólica indirectamente. Sin embargo, este protocolo tiene la ventaja de la conveniencia, menor limitación de la técnica y equipos.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (no. 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), médico y salud ciencia programa de la provincia de Zhejiang (no. 201646246, Dongwu Lai) y las Ciencias de la salud y Plan de tecnología de la ciudad de Hangzhou (n º 2013A28, Ding Lin).