Glycoproteomics внеклеточного матрикса: Метод анализа интактного гликопептидных использованием масс-спектрометрии

Этот документ описывает методику для подготовки образцов тканей сердечно-сосудистой системы для анализа MS, что позволяет (1) анализ белкового состава ECM, (2) идентификации сайтов гликозилирования, и (3) композиционной характеристике гликанов форм. Эта методика может быть применена, с незначительными изменениями, к изучению ЕСМА в других тканях.

Фиброз является отличительной чертой многих сердечно-сосудистых заболеваний и связан с усиленной секрецией и отложением внеклеточного матрикса (ECM). Использование протеомики, ранее мы определили более 150 ECM и ECM-ассоциированных белков в тканях сердечно-сосудистой системы. Следует отметить, что многие ECM белки гликозилированный. Это посттрансляционная модификация влияет сворачивание белка, растворимость, связывание и деградацию. Мы разработали последовательную экстракцию и способ обогащения для белков ЕСМ, который совместим с последующей жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS) анализа интактных гликопептидов. Стратегия основана на последовательных инкубирования с NaCl, SDS для decellularization ткани, и гидрохлорида гуанидина для солюбилизации белков ЕСМ. Последние достижения в LC-MS / MS включают методы фрагментации, такие как комбинации столкновений диссоциации больших энергий (HCD) и диссоциации переноса электрона (ETD), которые позволяютпрямой анализ состава гликопептидов белков ЕСМ. В данной работе, мы опишем способ получения ЕСМА из образцов ткани. Метод позволяет не только для профилирования белка, но также и оценки и характеристики гликозилирования с помощью анализа MS.

Фиброз является отличительным признаком многих заболеваний. Фибробласты пролиферируют и дифференцируются в стороне высокого синтетических фенотипов, которые связаны с усиленной секрецией и отложением внеклеточного матрикса (ECM) ^1. Чрезмерное отложение ECM может продолжаться даже после того, как первоначальная травма стихла, что приводит к функциональным нарушениям. Использование протеомика, ранее мы определили более 150 ECM и ECM-ассоциированные белки в сердечной ткани ^{2, 3.} Они являются не только структурные белки, но также matricellular белки и протеазы, которые способствуют непрерывному ремоделирования и динамической адаптации сердца. Следует отметить, что многие ECM белки гликозилированный ^4. Это посттрансляционная модификация (ПТМ) включает добавление остатков сахаров в определенные положения аминокислот, и это влияет на сворачивание белков, растворимость, связывание и деградация ⁵ .

Есть два основных типа гликозилирования, которые встречаются у млекопитающих. (1) N-гликозилирование происходит в карбоксамидо азоте остатков аспарагина (Asn) в пределах консенсусной последовательности Asn-Хаа-Thr / Ser, где Хаа обозначает любая аминокислота, кроме пролина. (2) В O-гликозилировании, остатки сахаров прикрепить к остаткам серина и треонина (Ser, Thr) или, в гораздо меньшей степени, гидроксипролине и гидроксилизин. В то время как О-гликозилирование может происходить в различных белковых групп, N-гликозилирования ограничивается секретируемых белков или внеклеточных доменов мембранных белков ^5. Это делает N-гликозилирования привлекательную мишень при изучении ECM.

Протеомика устанавливает новый стандарт для анализа изменений белков при болезни. До сих пор большинство протеомики исследования были сосредоточены на внутриклеточных белков ^6. В основном это связано со следующими причинами. Во-первых, обильные внутриклеточные белки препятствуют Identiфикации дефицитных компонентов ECM. Это особенно важно в сердечной ткани, в которой приходятся митохондриальные белки и myofilament значительной доли содержания белка ^7. Во-вторых, интегральные ECM белки сильно сшитый и трудно солюбилизации. Наконец, наличие обильных PTMs (т.е. гликозилирования) изменяет молекулярную массу, заряд и электрофоретических свойств пептидов, влияющих как разделение и идентификацию с помощью жидкостной хроматографии тандемной масс - спектрометрии (ЖХ-МС / МС). За последние годы, мы разработали и улучшили последовательную экстракцию и способ обогащения для белков ЕСМ, который совместим с последующим масс-спектрометрии (МС) анализа. Стратегия основана на последовательном инкубационных.

Первый шаг выполняются с NaCl, ионным буфером, который облегчает извлечение ECM-ассоциированный и слабосвязанный ECM белков, а также вновь синтезированные белка ECM. Это яс моющим средством свободно, без денатурации, без нарушения клеточных мембран, а также пригодны для дальнейших биохимических анализов ^8. Затем decellularization достигается с помощью додецилсульфата натрия (SDS). На этом этапе, низкая концентрация ДСНЫ обеспечивает мембраны дестабилизацию и высвобождение внутриклеточных белков, предотвращая разрушение более растворимых нецелых компонентов ECM. И, наконец, ECM белки экстрагируют гуанидин гидрохлорид буфера (GuHCl). GuHCl эффективен при извлечении сильно сшитых белков и протеогликанов из тканей , таких как сухожилия ^{9, 10,} хрящ сосудов ^{11, 12, 13} и сердце ^{2, 3.} Мы применили это биохимическое фракционирование, в сочетании с LC-MS / MS, чтобы исследовать ECM ремоделирования в сердечно - сосудистых ^{заболеваниях- , 3, 11, 12, 13, 14. Последние достижения в MS включают новые методы фрагментации, такие как комбинации столкновений диссоциации высших энергий (HCD) и диссоциации переноса электрона (ETD), которые позволяют для прямого анализа интактных гликопептидов 3, 15.}

Здесь мы описываем методологию для подготовки ECM для анализа MS, который позволяет для анализа белковой композиции, идентификации сайтов гликозилирования, и характеристика гликанов форм. По сравнению с предыдущим анализом ECM гликозилирования ^16, эта методика позволяет прямой оценки композиционных изменений профилей гликозилирования в сайт-специфическим образом с помощью MS. Мы применили эту методику для сердечно-сосудистой системы тканей. Тем не менее, он может альтак быть применены, с незначительными изменениями, к изучению ЕСМА в других образцах тканей и может обеспечить беспрецедентное понимание ECM биологии.

Исследование было одобрено Комитетом по Уандсворту местного исследовательской этики (ссылочный номер: 06 / Q0803 / 37) и получил институциональное одобрение от научных исследований и разработок офиса. Все пациенты дали письменное информированное согласие.

1. Выделение белков внеклеточного матрикса

Примечание: предсердные ткани человека, используемые для этих экспериментов были получены из ушек предсердий при кровообращении, сразу после ареста кардиоплегического сердца. Все образцы были собраны в Георгиевской больницу, Лондон, Великобританию. Все образцы ткани должны быть заморожены при -80 ° С. Не следует использовать образцы, хранящиеся с фиксаторами, такие как параформальдегид, что белки с поперечными связями.

1. Подготовьте все буферы извлечения заранее экспериментов, согласно Таблице 1, для того , чтобы свести к минимуму время между стадий экстракции. Выполните всю инкубацию при комнатной температуре (RT) в среде с контролируемой температурой(То есть ~ 20 ° C) , чтобы обеспечить соответствие между извлечений.
2. Взвешивание 20-50 мг ткани. Если несколько образцов должны быть извлечены, вырезать и взвесить их один за другим, чтобы избежать полного оттаивания тканей. Используя скальпель, кости ткани на 3-4 мелкие кусочки (то есть, 2-3 мм) и поместите их вместе в 1,5 мл пробирки.
3. Добавьте 500 мкл охлажденного на льду фосфатно-солевого буферного раствора (PBS, таблица 1 и таблица материалов) и выполняют пять промывок , чтобы свести к минимуму загрязнение крови.
4. Экстракция Шаг 1: Инкубация с NaCl буфером
   1. После промывания PBS, поместите образцы в 1,5 мл пробирки с винтовыми крышками. Добавить NaCl буфер (таблица 1) в 10 раз (V: W) от веса ткани. Вихревые трубки при КТ в течение 1 ч при минимальной скорости (то есть, 600 оборотов в минуту).
      Примечание: Низкая скорость вихря имеет решающее значение, чтобы избежать механического разрушения ткани во время этого этапа.Используйте адаптер пены, чтобы поместить все пробирки во время экстракции.
   2. Передача выдержки в новые пробирки и центрифуге при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Хранить экстракты при -20 ° С до использования. Кратко мыть оставшиеся гранулы ткани со свежим буфером NaCl. Используйте один и тот же тип буфера (то есть, 100 мкл буфера NaCl) для промывки , чтобы предотвратить извлечение других белков с различной растворимостью (т.е. белки , не извлекаемых NaCl).
   3. После промывки, обеспечить полное удаление буфера, чтобы минимизировать перекрытие в содержании белка с последующими стадиями экстракции. Удалите буфер NaCl, используемый для промывки.
      Примечание: Соотношение между объемом буфера и весом ткани имеет важное значение для воспроизводимой экстракции. 10: 1 отношение (объем: ж) для экстракции NaCl и SDS и 5: 1 для стадии GuHCl обеспечить достаточное количество белка без насыщения буфера. Концентрации белка приблизительно 1-2 мкг / мкл после добraction.
5. Экстракция Шаг 2: Decellularization с SDS буфера
   1. Добавить SDS буфера (таблица 1) в десять раз (V: W) вес ткани; использование низких концентраций SDS (т.е. 0,1%) имеет решающее значение , чтобы избежать потери белков ЕСМ в течение decellularization. Вихревые трубки при КТ в течение 16 ч при минимальной скорости (то есть, 600 оборотов в минуту).
      Примечание: Низкая скорость вихря минимизирует механическое разрушение ЕСМ.
   2. Передача выписок в новые пробирки. Центрифуга при 16000 мкг в течение 10 мин при 4 ° C; хранить при температуре от -20 ° С до использования. Кратко мыть оставшиеся гранулы ткани с _дд H ₂ O , чтобы удалить SDS. Обеспечить полное удаление жидкости после промывки.
6. Экстракция Шаг 3: Инкубация с GuHCl буфера
   1. Добавить GuHCl буфер (таблица 1) в пять раз (V: W) от веса ткани. Вихревые трубки при КТ в течение 72 ч при максимальной скорости (т.е. 3200 оборотов в минуту); энергичный вортекс облегчает механическое разрушение ЕСМА.
   2. Передача выписок в новые пробирки. Центрифуга при 16000 × г в течение 10 мин при 4 ° C и хранят при -20 ° C до использования.

2. Белок Количественное и осадки

Примечание: В связи с наличием моющих средств, буфер SDS несовместима с прямым белка на основе количественного измерения оптической плотности при длине волны 280 нм. Для того, чтобы обеспечить воспроизводимые количественное определение , использовать колориметрические анализы для всех белковых экстрактов ^17.

1. Количественное.
   1. Подготовка стандартов для калибровочной кривой с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) , серийно разведенного в соответствующем буфере для экстракции (т.е., NaCl, SDS, или GuHCl) ^17. За это время, разморозьте образцы экстрактов.
   2. Развести образцы в буфере для экстракции, чтобы получить концентрацию в пределахлинейный диапазон оптической плотности; разведение 1:10 (по объему) дает удовлетворительные результаты. Развести образцы GuHCl с равным количеством DDH ₂ O для количественного определения , как колориметрический анализ не совместим с концентрациями> 4 М GuHCl.
   3. Используйте бицинхониновую кислоту (BCA) основа колориметрического анализа ¹⁷ (см таблицы материалов), в соответствии с инструкциями изготовителя для анализов в 96-луночных планшетах; рекомендуются выполнять по меньшей мере два измерения.
   4. После инкубации в течение 30 мин, принимают оптической плотности при длине волны 570 нм для расчета концентрации белка с использованием БСА стандартной калибровочной кривой ^17.
2. протеин Осадки
   1. Оттепель GuHCl извлекает при комнатной температуре. Алигота 10 мкг белка для каждого образца в новые пробирки. Для прямого анализа гликопептидов, аликвота 50 мкг. Добавить в 10 раз больше объема этанола и INCUBATE в течение ночи при -20 ° С.
      Примечание: GuHCl не совместим с другими ферментативных реакций и большинства электрофоретических приложений. Удаление GuHCl требуется перед дегликозилированием и трипсина пищеварения. Растворимость GuHCl в этаноле и, наоборот, низкая растворимость белков позволяют для эффективного удаления GuHCl в то время , получ приблизительно восстановления 98% белков , ^18.
   2. Центрифуга образцов при 16000 × г в течение 30 мин при 4 ° С и аспирата супернатант. Позаботьтесь, чтобы не нарушить осажденный осадок. Сухие гранулы в течение 15 мин с помощью вакуумного концентратора (см Таблицы материалов) при комнатной температуре.
      Примечание: Этот протокол может быть остановлена ​​здесь и высушенные гранулы хранили при -20 ° С до использования.
   3. Необязательно, запустить гель - электрофорез в качестве контроля качества (QC, см Методы Справочной).

3. Последовательное Дегликозилирование дляОценка N-гликозилирования размещения сайта

1. Во время сушки образца (смотрите стадию 2.2.2), подготовить буфер , содержащего дегликозилирование суков дегликозилирования ферментов, в соответствии с таблицей 1. Таблица материалов для деталей продукта.
2. Добавьте 10 мкл буфера, содержащего дегликозилированием ферменты для каждого образца. Обеспечение надлежащего окатышей взмучивания путем выполнения быстрого вихря и спин-вниз образцов.
   Примечание: Удаление сахарных мономеров с использованием сучьев ферментов имеет важное значение для последующего и полного удаления О-связанных сложных сахаридов и облегчает позже расщепление N-связанных сахаров с помощью PNG-азой-F.
3. Инкубировать в течение 2 ч при 25 ° С, чтобы обеспечить удаление гепарансульфата путем гепариназой II.Increase температуры до 37 ° С и инкубируют в течение 36 ч при осторожном перемешивании.
   Примечание: Учитывая низкие объемы реакции и на длительное время инкубации, используйте инкубатор шейкеры и плотно упаковать несколько 1,5 мл ванныES внутри конической трубки 50 мл, опираясь внутри инкубатора при температуре приблизительно 45 °.
4. После 36 ч, центрифугировать образцы в течение 1 мин при 16000 х г и выпарить H ₂ O из образцов с помощью вакуумного концентратора при комнатной температуре в течение приблизительно 45 мин.
5. Ресуспендируют высушенные образцы с 10 мкл H ₂ O ¹⁸ , содержащим 50 ед / мл F-PNG - азой, которая расщепляет все аспарагин-связанные гликан в реакции дезамидирования.
   Примечание: В результате аспарагиновой кислоты несет избыток массы 2,98 Da, что свидетельствует о присутствии N-гликозилирование во время анализа MS.
6. Инкубировать в течение 36 ч при 37 ° С при постоянном перемешивании в инкубаторе шейкере.

4. В-раствор трипсина Расщепление

Примечание: Этот шаг следует проводить как для не-дегликозилированных (то есть, используемых для прямого анализа гликопептидов) и дегликозилированных образцов (то есть, используемый для оценки гликановой осcupancy).

1. Используйте 10 мкг общего белка для оценки размещения N-гликозилирования сайта (как указано в предыдущем шаге). Для образцов, предназначенных для непосредственного анализа гликопептидов, используют 50 мкг белка в качестве исходного количества.
   Примечание: Следующие шаги описаны в течение 10 мкг белка. Масштабирование й evolumes (т.е., 5 раз по 50 мкг) по мере необходимости.
2. Денатурации белков на каждом образце с использованием аликвоты 9 М мочевины и 3 М тиомочевины, при конечной концентрации 6 М мочевины и 2 М тиомочевины, соответственно (например, для образца 10 мкл, 20 мкл мочевины / тиомочевины).
3. Сокращение белков путем добавления 100 мМ дитиотреитола (DTT, 3,33 мкл, конечная концентрация: 10 мМ). Инкубируют при 37 ° С в течение 1 ч при перемешивании при 240 оборотах в минуту.
4. Охладить образцы до комнатной температуры перед выполнением алкилирования путем добавления 0,5 М иодацетамида (3,7 мкло, конечно концентрай: 50 мМ). Выдержите в темноте в течение 1 часа.
5. Использование предварительно охлажденный (-20° С) ацетоном (6 раза объема образца) для инкубации образцов в течение ночи при -20 ° С. Осадок центрифугирования при 14000 х г в течение 25 мин при 4 ° С.
6. Аспирата супернатант. Позаботьтесь, чтобы не нарушить осажденный осадок. Сухие гранулы белка с использованием вакуумного концентратора в течение 30 мин при комнатной температуре.
7. Ресуспендируют в 20 мкл 0,1 М бикарбоната триэтиламмония (TEAB) буфере, рН 8,2, содержащий трипсин (0,01 мкг / мкл) и переваривают в течение ночи при 37 ° С и 240 оборотах в минуту.
8. Остановить пищеварение путем подкисления образцов с 10% -ной трифторуксусной кислоты (TFA, 2 мкл до конечной концентрации 1% TFA).

5. Пептид Очистка с помощью С18 столбцов

Примечание: Удаление мешающих загрязняющих веществ из смеси пептидов после переваривани уменьшает подавление иона и улучшает отношение сигнал-шум и коэффициенты охвата последовательности. Этот шаг должен осуществляться как для не-дегликозилированных и дегликозилированных саmples.

1. Активация смолы на С18 спиновой пластины (см Таблицу материалов) с использованием 200 мкл метанола на лунку и центрифуге при 1000 мкг в течение 1 мин.
2. Промыть добавлением 200 мкл на лунку 80% ацетонитрила (ACN) и 0,1% TFA в H ₂ O. центрифуге при 1000 мкг в течение 1 мин.
3. Равновесие добавлением 200 мкл на лунку 1% ACN и 0,1% TFA в H ₂ O. центрифуге при 1000 мкг в течение 1 мин. Повторите этот шаг еще два раза.
4. Загрузка образцов (весь объем) со стадии 4 в лунки, содержащие смолу и центрифуге при 1500 мкг в течение 1 мин. Обновить проточный во второй раз и повторить центрифугирование.
5. Промыть добавлением 200 мкл на лунку 1% ACN и 0,1% TFA в H ₂ O. центрифуге при 1500 мкг в течение 1 мин. Повторите этот шаг еще два раза.
6. Элюции образцов с 170 мкл на лунку 50% ACN, 0,1% TFA в H ₂ O. центрифуге при 1500 мкг в течение 1 мин. Повторите предыдущий шаги объединить собранный элюат.
7. Сушат элюата с использованием вакуумного концентратора в течение 2 ч при комнатной температуре. Если он не используются немедленно, держать высушенные образцы при температуре -80 ° С до использования.
   Примечание: дегликозилированные образцы, предназначенные для идентификации белков только готово к использованию для LC-MS / MS после этого шага. Шаги 6 и 7 не требуется для этих образцов.
8. Оттепель и ресуспендируют дегликозилированного образцы в 2% ACN и 0,05% TFA в H ₂ O до конечной концентрации белка 0,5 мкг / мкл. Далее с шагом 6 для прямого анализа гликопептидов не-дегликозилированных образцов.
9. Необязательно, фильтровать пептиды до маркировки с тандемной масс-тегами (ТМТ); Методы см Справочная для пептидного fitration.

6. Маркировка с TMT (для прямого анализа гликопептидных только)

1. Оттепель и ресуспендируют высушенных гранул в 50 мкл 50 мМ TEAB, чтобы получить концентрацию 1 мкг / мкл.
2. ResusPED 0,8 мг флакон TMT ноль ⁽⁰ ТМТ, смотри таблицу материалов) реагента в 41 мкл ACN. Следуйте recommendantions производителя для взмучивания.
3. Этикетка образцы пептидов в соотношении 50 мкг пептидов до 0,4 мг TMT ⁰ (т.е. 50 мкл пептидов до 20,5 мкл TMT ^0). Инкубирую при комнатной температуре в течение 1 ч.
4. Реакцию останавливают маркировки добавлением 5% гидроксиламина в соотношении 6: 100 (т.е. 4,23 мкл 5% -ного гидроксиламина). Инкубирую при комнатной температуре в течение 15 мин.
5. Сухие образцы пептидного ТМТ ⁰ меченных в течение 1 ч при комнатной температуре с использованием вакуумного концентратора. Ресуспендируют в 10 мкл DDH ₂ O.
   Примечание: Из-за остатки гликанов, гликопептиды отображать более высокую молекулярную массу, чем не-гликозилированные пептиды. TMT ⁰ увеличивает состояние заряда гликопептидов. Это снижает их относительную массу для зарядки (m / z) коэффициентов и облегчает фрагментацию ETD.

7, ГЛИКОПЕПТИДНОЕ Обогащение

1. Использование буферов реакции , представленные в наборе (см Таблицу материалов).
2. Добавьте 50 мкл буфера для связывания к каждому образцу 10 мкл с шагом 6,5. Vortex раствора glycocapture смолы, пока она не станет однородной. Используйте цвиттерионные гидрофильное взаимодействия жидкостной хроматографии (ZIC-HILIC) основе захвата ^15.
3. Аликвоты по 50 мкл суспензии смолы к новым 1,5 мл пробирки. Вращение в течение 1 мин при 2500 мкг и удалите надосадочную жидкость. Добавьте 60 мкл образца (т.е. образец с буфером для связывания) в пробирки , содержащие гранулы смолы. Смешайте с помощью пипетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 мин в перемешивании со скоростью 1200 оборотов в минуту.
4. Центрифуга в течение 2 мин при 2000 мкг и переносят супернатант в новые пробирки. Хранить трубы. Добавьте 150 мкл промывочного буфера в пробирки смолы. Смешайте с помощью пипетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин в перемешивании со скоростью 1200 оборотов в минуту.
5. Вращение в течение 2 мин при 2500 х г. Переводсупернатант в одних и тех же труб (с шагом 7.4). Повторите этапы стирки в два раза.
6. Добавьте 75 мкл буфера для элюции и перемешать с помощью пипетки. Перемешивают при 1200 оборотах в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем центрифугировать пробирки в течение 2 мин при 2500 х г. Передача супернатанты к новым 1,5 мл пробирки. Повторите этапы стирки, а затем передать элюата супернатант в одной и той же трубе.
7. Центрифуга пробирки , содержащие элюата (то есть, гликопептиды) в течение 2 мин при 2500 х г. Передача супернатантов в новые пробирки, чтобы обеспечить удаление любой оставшейся смолы из предыдущих стадий.
8. Сушат общий объем 150 мкл элюата с использованием вакуумного концентратора в течение примерно 2 ч при комнатной температуре. Ресуспендируют сушат вниз гликопептиды в 15 мкл 2% ACN и 0,05% TFA в DDH ₂ O.
9. Продолжать выполнять LC-MS / MS с использованием фрагментации HCD для анализа состава белки ЕСМ, и ЖЙ-МС / МС с использованием HCD и фрагментации ETD для гликопептидных характеристик. Смотрите раздел 8.

Анализ 8. Масс-спектрометрия

1. Выполните LC-MS / MS с использованием фрагментации HCD для анализа состава ЕСМ белка; см Методики ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ для деталей.
2. Выполните LC-MS / MS с использованием HCD и фрагментации ETD для гликопептидных характеристик (см методы Справочной для деталей); обогащенный образец должен быть по сравнению с не-обогащенного исходного материала ^15.
   Примечание: Подробное описание методов LC-MS / MS для косвенного анализа гликопептидов, прямого анализа гликопептидов, и поиска в базе данных представлены в Methods Дополнительного. Исследователи , заинтересованные в характеризующем белок ECM и гликаны композицию с помощью масс - спектрометрии рекомендуются ссылаться на предыдущие публикации ^{3, 11, 15.}

Схема документооборота протокола представлена на рисунке 1.

Протокол экстракции ЕСМ

Эффективность экстракции можно контролировать путем запуска аликвоты формирования каждого экстракта на Бис-Трис акриламид гелей и с окрашиванием серебром для визуализации. На фиг.2А показана комплементарности NaCl, SDS и GuHCl экстрактов после последовательной экстракции. Это КК позволяет идентифицировать потенциальные проблемы с качеством образца, такие как чрезмерная деградация белка. После экстракции, ECM гликопротеинов в изобилии в экстрактах GuHCl (фигура 2В).

Дегликозилирование

Для оценки эффективности дегликозилирования, не-дегликозилированное управление должно быть запущенно в раrallel. Дегликозилирование раз должно быть пригодны для достижения полного и однородного удаления остатков сахаров, как проиллюстрировано на фигуре 3А. На фиг. показан типичный пример образцов эффективны дегликозилированных добавлением ферментов для удаления ГАГ и дегликозилирования ферментов , которые нацелены на меньшие N- и О-связанные олигосахариды.

Glycoproteomics

Протокол для оценки заселенности NxT / S sequons улучшает охват последовательности белка для ECM гликопротеинов после MS (фиг.3С) и позволяет в течение первоначального скрининга на наличие гликопротеинов. Это помогает сократить время поиска гликопептидов, так как базы данных могут быть настроены, чтобы содержать ранее идентифицированных гликопротеинов. фрагментации HCD-ETD используются для идентификации и характеризации композиционных олигосахаридов, прикрепленной к ECM г lycoproteins. Фигура 4А показывает репрезентативный спектр , полученный для пептида , меченного ¹⁸ O после дегликозилированием (косвенного анализа гликопептидов). Фиг.4В является типичным примером спектра , полученного после анализа интактных гликопептидов из экстрактов (ECM прямого анализа Гликопептида).

Рисунок 1: Обзор методов. (А) После последовательного обогащения белков ЕСМ, ЖХ-МС / МС анализы выполняются на дегликозилированного экстрактов. (В) В качестве альтернативы, не являющийся дегликозилированный Экстракты ECM дополнительно обогащены гликопептиды. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg" />
Рисунок 2: Извлечение белков ЕСМ. (A) 3 различных экстрактов из процедуры последовательной экстракции ( «Английский Quickstep») дополняют друг друга по содержанию белка. В то время как экстракты SDS обогащены внутриклеточных белков, GuHCl экстракты содержат большинство белков ЕСМ. Успешное фракционирование визуализировали с помощью различного рисунка окрашивания серебром. (В) ECM белки , такие как небольшой лейцин-богатый протеогликан декорин, бигликане и mimecan преимущественно обнаружены в экстрактах GuHCl, с небольшим присутствием в экстрактах SDS и NaCl. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Анализ Glycosylation. (A) Соответствующие периоды инкубации требуется для полного дегликозилирования. Пример показывает вли ние времени инкубации при удалении гликозаминогликановых цепей из гликопротеина декорина. (В) ECM гликопротеинов украшены крупными и повторяющимися гликозаминогликанов цепей и короткой и разнообразной N- и О-связанных олигосахаридов. Полоса 1 в каждом из иммуноблотов представляет собой необработанные сердечные экстракты. Дорожка 2 содержит экстракты, обработанные ферменты, которые переваривают гликозаминогликаны. Образцы в дорожке 3 содержат, кроме того, ферменты для удаления N- и О-связанных oligossacharides. Галектин-1 не является гликозилированным, следовательно, нет никакого сдвига по размеру белка. Адаптировано из Lynch М., и др. ⁴ (C) В ЖХ-МС анализа / МС, образцы , обработанные с PNG - азой-F в присутствии H ₂ ¹⁸ O , достичь более полного охвата последовательности (%, на правой стороне) по сравнению с не-дегликозилированного образцов. Dковчег зеленых зоны покрытия представляют собой последовательность с помощью LC-MS / MS. Красные, пунктирные линии представляют glycosites, с числами, указывающими их положение аминокислоты. Обнаружение гликозилирования декорина в положении Asn ²¹¹ (N, выделены жирным шрифтом) подробно показано в качестве примера на рисунке 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. гликопептидного Анализ с помощью MS. (А) С помощью дробовика протеомики подхода к ECM обогащенных экстрактов, гликопептиды могут быть идентифицированы по наличию дезамидированного аспарагина в пределах NxT / S sequons и метили ¹⁸ O. Пример показывает спектр HCD МС / МС для пептида декорина , содержащего ранее гликозилированный Asn ^211. Полученные данные могут быть использованысоздать пользовательскую базу данных ECM гликопротеинов. Фрагментации (В) HCD-ETD используется для анализа Гликопептид обогащенного ЕСМ экстракта. Спектр ETD МС / МС дает характеристику гликановой композиции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: маточные растворы, реакция Буферы и энзима. В этой таблице перечислены состав каждого буфера исходного раствора и реакции, необходимое для экстракции и последующей обработки (в том числе ферментативных расщеплений) кардиальных белков ЕСМ до анализа MS.

Этот протокол протеомики был оптимизирован в течение последних нескольких лет в нашей лаборатории. Здесь мы использовали сердечную ткань, но лишь незначительные корректировки могут потребоваться для его применения в другие ткани. Например, протокол экстракции необходимо принимать клеточности ткани во внимание. Сердечный ткань является высоко по сравнению с сотовым сосудистой тканью. При использовании сосудистой ткани, концентрация ДСН может быть ниже (т.е. 0,08%) , а время decellularization короче (т.е. 4 ч) ^{11, 12, 13.} Использование дегликозилированием ферментов имеет решающее значение для ЖХ-МС / МС-анализа состава ECM. Тем не менее, время инкубации должно быть отрегулировано для различных типов тканей. Например, гепариназы II , необходимая расширенное времени инкубации при 25 ° С при использовании образцов , таких как кожа, которые богаты белками базальной мембраны (например , агрин, перлеканно) (данные не показаны), Анализ прямого гликопептида может быть выполнен на кондиционированной среде из клеток в культуре ^15. Обогащение шаги могут не потребоваться для анализа этой упрощенной subproteome. Подобно экстракты GuHCl, NaCl экстракты также пригодны для анализа glycoproteomics с незначительными изменениями. Другие протоколы экстракции для обогащения белков ЕСМА может быть адаптированы для характеристики ECM гликопептидов ^{19, 20.}

Гликозилирование является наиболее сложным PTM ^5. Косвенное идентификация гликопептидов достигается за счет обнаружения дезамидированной Asn со встроенным ¹⁸ O в NXT / S sequon. Дезамидированная Asn в других положениях может представлять ложные срабатывания. Аналогично, N-гликозилирования следует рассматривать в контексте белковых онтологий: внутриклеточные белки, содержащие / S sequon NXT не будет гликозилированным, но может привести к возникновению ложных срабатываний. В текущем SearcАлгоритмы ч не дают для скрининга PTMs в предварительно определенных последовательностях только (т.е. Asn на NXT / S), ручная фильтрация данных требуются. Определение наличия / отсутствия гликозилирования в этих положениях могут быть сопоставлены между заболеванием и контрольных проб. Там нет фермента эквивалентна F для PNG - азой O-дегликозилированием (т.е. введение массовый сдвиг на треонин или серин). Таким образом, идентификация O-гликозилирования ограничивается прямым анализом гликопептидов. Прямой анализ Гликопептида используется для получения информации о составе сахаров, присоединенных к белкам, но не обеспечивает структурную информацию о Гликанах. Кроме того, композиция гликанов является результатом гликанового синтеза и обработок после секреции.

Наш метод экстракции 3-шаг для ECM белков ( «Английский квикстеп») ⁶ позволило характеризующий ECM в различных сердечно - сосудистых тканей. Фракционирование тканина несколько экстрактов требуются , чтобы получить упрощенную ECM протеым , как обсуждаются в другом месте ^6. Внутриклеточные белки бы в противном случае способствовать чрезмерному динамическому диапазону белковых содержаний в пределах экстрактов, которые будут препятствовать идентификациям менее распространенных белков ЕСМА. Кроме того, белки несут внутриклеточные О-гликозилирование ⁵ , что усложнило бы ЕСМ обогащения гликопептидного и последующий анализ MS. Другие авторы использовали аналогичные методики экстракции , чтобы охарактеризовать, например , легкий ²¹ и хрящевую ткань ^10, однако они не преследовали анализ гликозилирования. Предыдущий анализ гликозилирования сосредоточено на определении только glycosites, требуют удаления из гликанов из сердцевины белка, а также не может оценить O-гликозилирование ^{22, 23.} Лектин массивы и химическое обогащение доступны для оценки гликанового стандаэс на биологических образцах на основе их специфичности связывания, но эти методы не могут назначать гликан типов , специфические белки , ²⁴ они не могут оценить сайты гликозилирования.

Первоначально мы использовали гель-электрофореза перед LC-MS / MS ЕСМ белков. Хотя разделение геля полезно в получении упрощенных белковых фракций поддается анализу ЖХ-МС / МС, последние инструменты предлагают скорость сканирования быстрее. Таким образом, электрофоретическая стадия разделения может быть опущена. Это дает дополнительное преимущество, так как крупная ECM белки, которые удерживаются в верхней части геля, анализируется более эффективны. Тем не менее, информация, касающаяся Mw интактных белков теряется. Стадия выпаривания до F дегликозилирования PNG - азой обеспечивает полное удаление регулярного H ₂ O , чтобы свести к минимуму ложных негативов. Сахарные остатки (т.е. переменные гликановые массы) мешают разделение с помощью LC и скомпрометировать последующую идентификацию пептидов с помощью MS / MS. пан-дегликозилирование протокол также рекомендуется для анализа протеомики белков ЕСМ не сосредоточены на гликозилирование.

Протеомика может обеспечить беспрецедентное понимание ЕСМА. Помимо структурной поддержки, гликано , присоединенные к ECM имеют важное значение для хоста-патоген взаимодействия, коммуникации клетки-клетки и иммунного ответа ^25, то есть отторжение аллотрансплантата после трансплантации органов. Glycoproteomics будет важным инструментом в гликобиологии.

Никто.

JBB является карьера Создание Fellow в British Heart Foundation Center короля. ММ является старшим научным сотрудником Британского кардиологического фонда (FS / 13/2/29892). Исследование было поддержано по инициативе передового опыта (Центры компетенции для отличившихся технологий - COMET) Австрийского исследований Promotion Agency FFG: «Научно-исследовательский центр повышения квалификации в области сосудистой Старение - Тироль, VASCage» (номер K-Project 843536) и NIHR биомедицинских исследований Центр на базе Национальной службы здравоохранения Foundation Trust Гая и Святого Томаса и Королевского колледжа в Лондоне в партнерстве с больницы Королевского колледжа.