Использование Фармакологический манипуляция и высокоточный Радиотелеметрия для изучения пространственного познания в свободном выгуле животных

Эта статья описывает протокол нового, который сочетает в фармакологической манипуляции с памятью и радио телеметрии для документирования и количественной оценки роли познания в навигации.

Способность животного воспринимать и узнавать о своей среде играет ключевую роль во многих поведенческих процессов, в том числе навигации, миграции, распространения и поиска пищи. Тем не менее, понимание роли познания в разработке стратегий навигации и механизмов, лежащих в основе этих стратегий ограничивается методологических трудностей, связанных с мониторингом, манипулируя познанием, и отслеживания диких животных. Это исследование описывает протокол для решения вопроса о роли познания в навигации, которая сочетает в себе фармакологическую манипулирование поведением с высокоточной радиотелеметрии. Подход использует скополамин, антагонист мускариновых рецепторов ацетилхолина, манипулировать когнитивные пространственные способности. Обработанные животные затем мониторинг с высокой частотой и высоким пространственным разрешением с помощью дистанционного триангуляции. Этот протокол был применен в популяции Восточной расписные черепахи (Chrysemys ПИКТА), которая заселенасезонно эфемерные источники воды в течение ~ 100 лет, двигаясь между дальним источников с использованием точных (± 3,5 м), комплекс (т.е. нелинейный с высокой извитости , которые пересекают несколько мест обитания), и предсказуемых маршрутов , полученных ранее 4 -х лет. Это исследование показало, что процессы, используемые этими черепахами согласуются с формированием пространственной памяти и вспомнить. В совокупности эти результаты согласуются с ролью пространственного познания в сложной навигации и выделить интеграцию экологических и фармакологических методов в изучении познания и навигации.

Познание (далее определяется как "все процессы , связанные с приобретением, хранением и использованием информации из окружающей среды" ¹⁾ занимает центральное место в массив сложных навигационных задач ^2. Например, Сандхилл краны (Журавль Canadensis) показывают заметное улучшение в миграционном точности с опытом работы ³ и след видов морских черепах на их натальных пляжи как мальков и вернуться как взрослые ^4-6. Кроме того , успешная миграция, расселение, и собирательство Петля на способность животного , чтобы собрать информацию об их пространственной среды ^7,8. Некоторые животные появляются , чтобы узнать маршруты в навигационных отношении конкретных ландшафтных особенностей ⁹ и может использовать пространственное познавательную при перемещении между гнездования и нагула ^10. Последние работы на восточных расписные черепахи (Chrysemys ПИКТА) предлагает критический период навигации, где успешная навигация нагорных обитания как взрослые шарниров на Ювенильский опыт в узком возрастном диапазоне (<4 лет ^11-13). Хотя вместе эти исследования демонстрируют прогресс, достигнутый в понимании роли обучения в плавании ^{4-6, 14-16,} механизмы, лежащие в основе такого поведения и в полной мере роль познания в навигации остаются загадочными, особенно у позвоночных ^{8, 17 , 18.}

Полевые исследования в роли познания в навигации редко ^{2, 8, 18,} во многом из - за методологических трудностей , связанных с мониторингом, манипулируя и отслеживания диких животных. Например, большие пространственные и временные масштабы, на которых многие животные часто исключают навигация расследование как тип информации, что эти животные потенциально узнать и как приобретается эта информация. Экспериментаторы часто сталкиваются с материально-технические трудности обнаружения и локализации животных при наблюдении за поведением над такими большими площадями и временные рамки, тем самым ограничивая типданных, которые могут быть собраны и выводы, которые можно сделать. Хотя использование системы глобального позиционирования животного монтажа (GPS) регистраторы могут повысить вероятность обнаружения широко в пределах животных, пространственные данные, собранные с помощью этих средств, как правило, очень грубое разрешение и отсутствие детального поведенческий компонент. Следовательно, данные, которые могут быть собраны при таких обстоятельствах имеют ограниченную ценность для изучения тонкое изменение в поведении между различными группами или экспериментальных методов лечения. Аналогичным образом, прямое, контролируемое манипулирование целевым поведением часто запрещенных пространственных и временных масштабах, характерных для навигации поведения, а также присущих материально-технических ограничений полевых исследований. Нахождение животных в их естественной среде обитания, ловить и манипулировать ими, а затем сбор поведенческих данных без непреднамеренного производства паразитные поведения являются основными проблемами работы с животными в полевых условиях. Таким образом, дизайн экспериментов по фрэи круг животных часто ограничивается и возможность проводить тщательные, контролируемые полевые эксперименты на роли познания в навигации ограничен.

Настоящее исследование позволяет обойти многие предыдущие трудности исследования взаимосвязи между познанием и навигации в поле с помощью новой комбинации фармакологической манипуляции и с высокой разрешающей способностью отслеживания свободно плавающих животных в полевых условиях. Скополамин, мускариновых ацетилхолиновых рецептор (mAChR) антагонист, было показано , что блок формирования пространственной памяти и вспомнить, блокируя холинергическую активность в мозге различных позвоночных животных таксонов ^18-24. Скополамин может быть эффективно использован на свободно пасущихся животных в полевых условиях ^{11, 18} и оказывает выраженное но временный эффект (например, 6 - 8 ч в рептилии). Метилскополамин, антагонист mAChR , который не проникает через гематоэнцефалический барьер , ^19-21, может быть использован для контроля завозможные периферические эффекты скополамин и для некогнитивных аспектов поведения ^11. Фармакология позволяет точно манипуляции познания, непосредственно влияющих на рецепторы, и высокоточный радиотелеметрия позволяет для наблюдения в результате воздействия на поведение. Измерения , проведенные с помощью дистанционного триангуляции и с высоким пространственным (± 2,5 м) и временной (15 мин) разрешением позволяют точной документации и количественной оценке поведения животных по отношению к экспериментальным манипулированием познания.

Это исследование было проведено ¹¹ в период с мая по август 2013 года и 2014 года Чесапик Farms, в 3300 акров дикой природы и управления сельского хозяйства области исследований в Кент Co., штат Мэриленд, США (39,194 ° с.ш., 76,187 ° W). Протокол включает в себя пять основных этапов: (1) захват и обработку животных (2) проставление радиопередатчики (3) подготовка фармакологических агентов (4) мониторинг и манипулирования движениями животных, и (5) ANAлизирующего пространственных данных. Исследование описано здесь сосредоточено на Восточной окрашенные черепаха (Chrysemys ПИКТА). Черепахи в фокальной населения участвуют в ежегодных сухопутным движений , в которых они покидают свои дома пруды и перейти к альтернативным водной среды обитания , используя один из четырех очень точные (± 3,5 м), сложный и весьма предсказуемые маршрутизирует ^{11, 12.} Фармакологическая манипулирование животных в эта система в сочетании с высокой разрешающей способностью радиотелеметрии проливает свет на роль познания в свободном плавании диких животных.

Все процедуры, связанные предметы животных были утверждены Институциональный животных по уходу и использованию комитетов Франклина и Маршалла и Вашингтон колледжей и последовали все местные, государственные и федеральные правила.

1. Захват и обработка

1. Поместите обруча ловушки в целевом теле воды, которая, как известно, содержат черепах. Определить глубину воды гарантируя, что 4 - 5 дюймов ловушки остается над водой, чтобы позволить запертые черепах на поверхность и дышать. Будьте уверены, чтобы расширить и закрепить обручем ловушки, чтобы их максимальной длины с поперечными балками, чтобы предотвратить коллапс ловушки. Разбивка ловушки в слой тела воды, чтобы предотвратить дрейф.
2. Bait ловушки с несколькими мертвой рыбы, куриной печенью, или куриные шеи, банку кошачьего корма, и / или банку овощей ^25.
3. Проверьте ловушки два раза в день и удалить черепах. При удалении черепах из ловушки, держать животное на бок и соблюдать осторожность, чтобы избежать повреждения от когтей или клювом.
   1. Выпуск прилова. реустановить ловушки, если продолжали отлов желательно. Оценка состояния приманки. Если приманка был израсходован, добавить больше. Потяните ловушки на берег, если дополнительный отлов не требуется.
4. Определить пол и возраст черепах , если желательно ^{26, 27.}
5. Поместите черепаху в мешок удержания и измеряют массу тела с пружинной шкалой до ближайшего г.
6. Транспорт черепах в лабораторию в климат-контроля транспортных боксов с небольшим количеством воды. Дом животных одиночно в аквариумах с необработанной прудовой воды выдерживают при приблизительно 25 ° С и достаточно глубоко, чтобы покрыть только голову.

2. Проставление радио передатчик

1. Для увеличения срока службы и выходной сигнал датчика, выбрать самый большой радиопередатчик возможно , что не превышает 5% от массы тела ²⁸ животного.
2. Определить местоположение размещения передатчика на панцирь примерно на полпути между средней линией и бокового края панциря около 1/3 лength вверх от заднего края панциря.
3. Готовят область путем удаления грязи, мусора, а также рост водорослей сухой тканью. Тампон район с 70% изопропилового спирта.
4. Приложить передатчик с небольшим количеством 5 мин эпоксидной смолы. Сориентируйте передатчик для максимального контакта с поверхностью панциря. Установите антенну таким образом, чтобы она тащит за животное параллельно длинной оси тела.
5. После того, как соответствующим образом позиционируется, охватывают весь передатчик и приблизительно 1 см от окружающей поверхности панциря с 5 мин эпоксидной смолы.
6. Возвращение черепахи в аквариуме и позволить эпоксидной вылечить в течение ночи.

3. Лекарственный препарат

Внимание: скополамин гидробромид и скополамин метилбромид являются мощными антагонистами ацетилхолина. При работе с этими препаратами, обратитесь к паспорту безопасности материалов, использовать надлежащие средства индивидуальной защиты (например, перчатки, вытяжной шкаф), и последующие протоколы лаборатории безопасности , чтобы избежать accidenтал контакт.

1. Использование стерильных и antipyrogenic поставок, соединение маточный раствор скополамина гидробромида. Взвесить необходимое количество препарата на аналитических весах. Смешайте скополамин с инъекционной физиологического раствора в конической трубе с концентрацией 1 мг / мл. Вихревой раствор до тех пор, пока не растворится. Убедитесь в том, что химическая чистота базовых химических веществ соответствует или превышает Фармакопеи США (USP) формулировку , если это возможно ^11.
2. Повторите шаг 3.1 с скополамин метилбромид.
3. Процесс раствор через 0,22 мкм пор найлона или смешанных эфиров целлюлозы шприцевой фильтр в стерильный флакон запечатанной сыворотки.
4. Хранить при комнатной температуре. Использовать в течение 24 часов.

4. Движения дорожки Черепаха Использование Радиотелеметрия ^{11, 12}

1. Переместить в общее расположение целевого животного, оставаясь не менее 25 м от животного. Использование направленной антенны Яги и установки коэффициента усиления приемника на средних, сканирование горизна, чтобы определить примерное направление и расположение животного. При приеме помехи или слабый сигнал, найти новую позицию. Увеличение высоты или держать Яги вверх, когда это возможно для усиления сигнала.
2. После того, как подходящее место находится взять подшипник, запишите свою позицию с GPS.
3. Использование нулевой / пиковое метод ^28, определяют подшипники левого и правого провалов.
   1. Определить направление самого сильного сигнала. Установите усиление вниз, насколько это возможно, все еще получая обнаруживаемый сигнал. С помощью переключателя аттенюатора на приемнике, если так есть. Переместите антенну влево и зафиксировать азимут, при котором теряется сигнал.
   2. Повторите предыдущий шаг для правого подшипника.
4. Повторите шаг 4.3 из по меньшей мере двух дополнительных местах для того же самого животного.
   Примечание: Эти дополнительные точки должны быть выбраны таким образом, чтобы окружать животное.
   1. Когда набор подшипников берется из Greaт расстояния или с неизбежным вмешательством, принять по крайней мере, два дополнительных подшипников для повышения точности. Собирают наборы подшипников, используемых для оценки в одном месте, как можно быстрее, особенно, если движется животное.
      Примечание: В качестве альтернативы, несколько сотрудников могут координировать принимать несколько независимых подшипников на одном животном одновременно.
5. Места записи животных в цифровой форме или вручную через каждые 10 - 15 мин, используя вышеуказанные шаги.
6. Манипуляция когнитивной обработки
   1. После того, как путь в unmanipulated животного документально (в пределах субъектов-контроль), обеспечивают дозу либо скополамин или метилскополамин. Используя массу , собранную на стадии 1.5, вычислить количество лекарственного средства , которое следует придавать животному для достижения рептилии конкретной конечной дозы 6,4 мг / кг скополамина или 6,8 мг / кг метилскополамин ^{19, 20.}
   2. Доставлять лекарственное средство непосредственно в брюшину через хвостовую перитонеального пазухи с использованием 1,0Мл шприц с иглой 22 калибра. Убедитесь в том, что общий объем поставляется не превышает 1 мл.
   3. Освободить животное как можно скорее на его месте захвата.
   4. Продолжить мониторинг движения животного через каждые 10 - 15 мин, пока он не достигнет прогнозируемого назначения.

5. Пространственный анализ

1. Вычислить оценки местоположения животных.
   1. Для каждого набора нулевых подшипников, рассекают угол (вручную или с помощью программного обеспечения) , чтобы найти результирующую подшипник передатчика. Повторите эти действия для всех подшипников в данный момент времени.
   2. Использование ПО триангуляции в соответствии с протоколом производителя, оценить положение животного и связанного с ним ошибка с несколькими подшипниками передатчика. Преобразование оценок позиции в х / у координаты, если программное обеспечение предоставляет другой вывод.
2. Повторите шаги 5.1 для всех наборов подшипников.
3. Вычислить пространственную точность движений.
   1. Вычислитькумулятивное среднее геометрическое (т.е. средний путь) unmanipulated животных (отрицательный контроль) , поскольку они двигаются к своей цели ^12.
   2. Для каждого человека в лечении и положительной контрольной групп, рассчитать общее число точек , которые перекрывают друг друга последовательно больших валков от средней геометрической линии в 5 м интервалами до 100% всех точек не были включены ^{11, 12.}
   3. Вычислить среднее значение и стандартное отклонение в каждой полосы обзора расстояния для всех особей в каждой группе.
   4. Статистически анализ данных, сравнение между группами лечения либо в течение интервала, чтобы разместить 100% точек или точек перекрытия на заданном интервале, в зависимости от вопроса.

Используя вышеупомянутый протокол, роль познания в навигации была оценена в популяции Восточной окрашены черепах (Chrysemys ПИКТА) , который испытал сезонные эфемерные источники воды в течение ~ 100 лет. Эта популяция обитает смесь эфемерным (осушенной в год и быстро - в несколько часов) и постоянных водной среды обитания (Рисунок 1). Предыдущие исследования показали, что после того, как их пруды осушены, черепахи резиденты перейти к альтернативным источникам воды с высокой точностью (± 3,5 м) с использованием сложных, предсказуемые маршруты , полученные ранее 4 -х лет ^11-13 (рисунок 1).

Это исследование показало , что процессы , используемые этими черепахами согласуются с формированием пространственной памяти и вспомнить ^11. Скополамин блокировали холинергическую активность в мозге животных ( в том числе формирования пространственной памяти и вспомнить ^19-21 ) Во время навигации. Опытные взрослые относились с скополамин отводимой от их точных исторических маршрутов в то время как наивные подростки не хватает опыта (и , следовательно , память) не были затронуты скополамин, не предполагая никакого эффекта скополамина на перцептивных или непространственных когнитивных процессов ¹¹ (фиг.1 и 2). Кроме того, ни для взрослых, ни для несовершеннолетних навигации была затронута контролем метилскополамин. Взрослые животные (т.е. те , с опытом работы на площадке) вводили скополамин потеряли свою способность следовать исторические пути и молодых особей , которые используют локальные сигналы для навигации и тех взрослых , которым инъецируют препарат , который не пересекает гематоэнцефалический барьер были незатронутыми. Таким образом, навигация у взрослых в этой системе, как представляется, когнитивный характер. В совокупности эти результаты согласуются с идеей, что черепахи имеют критический период, в течение которого они должны изучить пути и использовать холинергической-зависимой когнитивной системыs (пространственная память) для навигации , как взрослых ^11-13.

Рисунок 1. навигация на основе когнитивных процессов у взрослых черепах Типичные движения (а) опытных взрослых и (б) наивные молодь. (1 - 3 года) от временного (Т) для постоянных (P) в то время как пруды обрабатывали либо скополамин или метилскополамин. Все взрослые, получающие скополамин (а, желтый, п = 9) резко отдалилась (более 200 м) от традиционных маршрутов (красный, р <0,001), тогда как все наивные молодь лечение с препаратом (b, желтый, п = 7) поддерживается движение точно в рамках традиционных маршрутов (р> 0,999). Все взрослые управления (а, белый, п = 9) и управления наивные молодь (б, белый, п = 6), а затем традиционные маршруты (р> 0,999). Каждая линия точек представляет собой одного человека. Все черепахи из всей группыs поддерживается высокая точность перед инъекцией (р> 0,999). Данные из Рот и Krochmal ^11. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Точность навигации является функцией когнитивных процессов у взрослых Черепахи а) Все черепахи продемонстрировали высокую точность движения перед инъекцией лечения (скополамин) или контролем (метилскополамин;.. Р> 0,999) б) после инъекции, взрослых в лечении скополамин значительно отклонилась (р <0,001) от своих традиционных маршрутов. В отличие от этого , все остальные группы продолжали перемещаться с высокой точностью (± 3,5 м; р> 0,999). Вставки показать деталь перекрытия от 0,5 - 3,5 м. PoИнтс являются средние значения ± SEM. Данные из Рот и Krochmal ^11. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Протокол, представленные здесь, позволяет экспериментатору документировать и количественной оценки роли познания в навигации. Манипулирование познания в области оказалось трудным, так как большинство подходов оставить экспериментаторы не в состоянии знать, какие конкретные аспекты поведения животного манипулируют. Тем не менее, протокол, представленный здесь позволяет экспериментатор точно манипулировать и таким образом оценить роль познания в навигации. Методика позволяет дополнительно экспериментаторы контролировать животных навигации в режиме реального времени с исключительно высоким пространственным и временным разрешением, таким образом, расширение прав и возможностей исследователей четко документировать поведенческие последствия экспериментальных манипуляций познания у диких животных.

В этом контексте, радиотелеметрия предоставляет возможность точно отслеживать перемещения животных на большие расстояния, что дает как высокое качество пространственных и поведенческих данных. Хотя это применение телеметрических никоим образом неНовый ^28, большинство исследований используют эту технику для решения грубые вопросы в области экологии и поведения (например, использование среды обитания, размер домашнего диапазона и т.д.). Частый мониторинг местоположения животных (4 - 5 раз в час), описанные здесь, в сочетании с малоразмерные пространственного анализа обеспечивают более точный поведенческий компонент в местоположение животного в пространстве. Обратите внимание, что оптимальное расстояние слежения будет функцией силы передатчика и чувствительности аппаратуры. Как правило, это лучшая практика, чтобы оставаться не менее 25 м от животного, чтобы не беспокоить его, хотя, когда животное находится в открытой растительности, расстояние необходимо, чтобы избежать такого нарушения может быть больше.

В текущем приложении, высокоточный радиотелеметрия предлагает уникальные преимущества по сравнению с использованием GPS-рекордеров животных монтажа. Передатчики могут быть меньше, являются менее дорогостоящими, и имеют более длительный срок службы батареи , чем GPS устройств ^28. Кроме того, тemporal разрешение удаленного триангуляции по радиоканалу телеметрией намного превосходит животных монтажа GPS. Мирского, блоки GPS животных монтажа ограничены автономной работы (т.е. конечное число измерений могут быть приняты, тем самым ограничивая их частоту). Высокая точность слежения с GPS требует большой батареи, чтобы получить высокую позицию частотного в течение длительного периода времени. Значительная масса этих батарей исключает их от использования в небольших GPS единиц животных монтажа ^28. Кроме того, высокая точность радиотелеметрия не ограничена дорогостоящих затрат извлечения данных, или ограничены хранением памяти на борту. Однако радиотелеметрия не является оптимальным для отслеживания животных с особенно большими диапазонами движения (например, при междугородней миграции), в глубокой воде или роющий видов, или те , в крутых местах обитания гористых. Кроме того, высокая точность слежения радио может быть очень много времени интенсивно и требует относительно большого экипажа поля, в частности, еили быстро движущихся видов; Таким образом, этот подход не может подходит для всех вопросов.

Фармакологические манипуляции с скополамин и метилскополамин предлагает конкретные достижения для изучения познания в естественной обстановке. Поведение может быть трудно интерпретировать, особенно в полевых условиях, тем самым ограничивая объем потенциального запроса. Скополамин позволяет манипулировать специфическими рецепторами, которые влияют на когнитивные процессы, что позволяет исследователям задавать вопросы конкретно о манипулировании познания. Кроме того, как скополамин легко пересекает гематоэнцефалический барьер и метилскополамин не делает, исследователи могут контролировать для периферических эффектов скополамина, тем самым отделяя когнитивный основе из некогнитивных поведения. Эти преимущества позволяют фармакологической манипуляции для создания и последующего тестирования четких поведенческих предсказаний и позволить себе использование сложных экспериментальных конструкций в полевых условиях. Тем не менее, подкожноopolamine очень общий ацетилхолин антагонист , который может иметь непредсказуемые последствия для других поведенческих, сенсорных и когнитивных систем ^21-24. Поэтому, возможно , что применение скополамина может создавать эффекты , которые могут помешать интерпретации сложного поведения (например, расширение зрачков, тепловая чувствительность ^{21-24, 29, 30);} нет таких искажающие эффекты не были обнаружены в этом или предыдущих исследованиях ^{11-13, 19, 20.}

Общие проблемы, возникающие во время отслеживания радио включают слабый сигнал, потеря сигнала и помехи. Для борьбы слабого сигнала, увеличение этого коэффициента, ориентации антенны изменение, перемещение ближе к животному (будьте осторожны , чтобы не мешать анима), и поднять антенну ^28. Если сигнал потерян полностью, поиск с усилением и антенны как можно выше в внешне спиралевидной области ограниченного поиска ^28. Помехи можно бороться путем уменьшения усиления, используя attenuatoг или шумоподавления фильтр (если таковой имеется), а также изменение ориентации антенны. Если такие помехи не могут быть преодолены с помощью этих средств, будущая работа на объекте исследования должны быть направлены на пропускной способности, которые не влияют помехи.

В целом, фармакологические манипуляции в сочетании с высокоточной телеметрией обеспечивает уникальное понимание той роли, которую играет в познании происхождения и проявления навигации. Новизна этого уникального метода позволяет исследователям лучше понять основные механизмы неврологических, которые приводят к познанию в навигации. Кроме того, эти методы могут быть использованы для дополнительных исследований познания в дикой природе с конкретной применимости к пространственно явных моделей поведения (например, навигация, миграция, нагула и рассредоточения) ^{11-13, 33,} эволюция познания ^{1, 7} и охрана окружающей среды (например, транслокации, реинтродукции) ^{31, 32.} Этот метод полезен для широкого звенеле таксонов в широком диапазоне сред обитания и будет иметь жизненно важное значение для понимания филогенетических моделей в познании.

The authors have nothing to disclose.

This research was funded by Washington College's Provost's Office, Middendorf Fund, Hodson Trust, and Franklin and Marshall's Hackman Fund and College of Grants. We thank E. Counihan, S. Giordano, F. Rauh, and A. Roth for assistance in the field. We thank M. Conner, R. Fleegle, and D. Startt at Chesapeake Farms, and Chino Farms for permission and access. The Washington College GIS Program helped with the preparation of maps.