使用药理操纵和高精度无线电遥测研究空间认知中自由放养的动物

本文介绍了结合内存和无线电遥测的药理操作记录和量化导航认知的作用新颖的协议。

动物的感知和了解其环境的能力起着许多行为过程，包括导航，迁移，扩散和觅食了关键作用。然而，认知的导航策略和这些策略背后的机制发展中的作用的认识是通过参与监督的方法上的困难限制，操纵的认知和跟踪野生动物。这项研究描述为解决认知导航，它结合了高精度无线电遥测行为药理操纵角色的协议。该方法使用东莨菪碱，毒蕈碱乙酰胆碱受体拮抗剂，操纵认知空间能力。处理的动物中，然后用高频率和通过远程三角高空间分辨率监测。该协议是一个人口的东锦龟（Chrysemys PICTA）内的应用已经有人居住季节性短暂的水源〜100年间，采用精确的（±3.5米）远源之间移动，复杂的（ 即具有较高的曲折经过多个栖息地非线性），且可预测的路线前4岁学会了。这项研究表明，由这些龟所使用的过程是与空间记忆形成和召回一致。总之，这些结果与空间认知的复杂的导航作用是一致的，突出的生态和药理学技术认知和导航的研究的整合。

认知（本文中定义为"涉及采集，存储，并使用从环境信息的所有进程^"1）是中央的复杂的导航任务²的阵列。例如，沙丘鹤（ 丹顶鹤加拿大一枝黄花 ），显示精度迁徙对他们的本命的海滩幼体有明显改善与经验; ^3，和海龟物种的印记，并返回作为成年人^4-6。同样，成功的迁移，扩散和觅食的动物的能力，铰链，以收集有关其空间环境^7,8的信息。有些动物出现学习就具体的景观特色⁹航行路线和筑巢和觅食区¹⁰之间移动时，可以使用空间认知。在东部锦龟最近的工作（Chrysemys PICTA）建议在航海，其中成人高地栖息地的成功导航尤文铰链的关键时期一个狭窄的年龄范围（<4岁^11-13）内Nile体验。虽然这些一起研究表明，在了解航海^4-6，14-16学习的作用所取得的进展，背后这些行为的机制和认知导航的充分作用仍然是谜一般的，尤其是在脊椎动物^{8，17 18。}

实地调查认知导航的作用是罕见的^{2，8，18，}这主要是由于参与监督的方法上的困难，处理和跟踪野生动物。例如，大空间和时间尺度上许多动物进行导航往往妨碍调查两种类型的信息，这些动物可能学习和信息是如何获得的。实验者经常面对的检测和监控行为在如此大面积和时间框架时定位的动物，从而限制了类型的后勤困难的，可以被收集的数据，并且可以得出的结论。虽然使用动物安装全球定位系统（GPS）的记录器可以提高检测广泛范围的动物的概率，通过这些装置收集的空间数据一般都非常粗分辨率的和缺乏详细的行为的组件。因此，能在这种情况下要收集的数据是用于在行为检查不同的组或实验组之间微妙的变化价值有限。同样地，目标行为的直接受控操纵通常是由典型的导航行为，以及由实地研究的固有后勤限制的空间和时间尺度禁止。发现动物的自然栖息地，捕捉和操纵它们，然后收集行为数据，而无需在不经意间产生的寄生行为在外地工作动物的重大挑战。因此，对FR实验设计EE-不等的动物往往是制约和对认知的导航作用进行严格，控制现场实验的能力是有限的。

本研究绕过许多用在野外条件下的新的药理学处理和自由导航动物高分辨率跟踪的组合调查在该领域认知和导航之间的关系的先前困难。东莨菪碱，毒蕈碱乙酰胆碱受体（mAchR的）拮抗剂，已显示在多种脊椎动物类群^18-24的脑中阻断胆碱能活性阻断空间记忆形成和召回。东莨菪碱能有效地对自由放养动物的野外条件下^11，18下使用并有标记，但暂时的效果（ 例如 ，6 -爬行动物8小时）。甲基东，即不穿过血脑屏障^19-21一个mAchR的拮抗剂，可用于控制东莨菪碱和行为¹¹的非认知方面的可能外周作用。药理学允许认知的精确操纵通过直接影响受体，和高精度的无线电遥测允许的对行为所得效果的观察。 通过远程三角同时具有高的空间（±2.5米）和时间（15分钟）的分辨率进行的测量允许精确记录和相对动物行为的量化，以认知的实验操作。

这项研究¹¹切萨皮克农场，在肯特公司，MD一个3300英亩野生动物管理和农业研究领域，美国（39.194°N，76.187°W）五月和2013年8月和2014年间进行的。该协议包括五个主要步骤:（1）捕捉和处理的动物（2）固定用无线电发射机（3）制备的药理学试剂（4）监测和操纵动物的动作，和（5）ANAlyzing空间数据。本文所述集中在东部的研究锦龟（Chrysemys PICTA）。在重点人群海龟参与其中，他们离开自己的家的池塘，然后导航到使用四种非常精确的（±3.5米）的，复杂的，高度可预测的路线^11，12替代水生境的年度陆上运动。在动物药理操纵该系统具有高分辨率无线电遥测配对揭示认知的自由航行野生动物的角色光芒。

所有涉及动物对象的程序是由富兰克林和马歇尔和华盛顿学院的机构动物护理和使用委员会批准，并遵循所有当地，州和联邦法规。

1.捕获和处理

1. 放置箍陷阱的该已知含有龟水目标体。确定水深确保4 - 陷阱5英寸仍高于水，让被困的海龟浮出水面呼吸。可以肯定，扩大和保护圈陷阱，其最大长度与横梁，防止陷阱崩溃。桩陷阱入水体的床，以防止漂移。
2. 诱饵的陷阱与一些死鱼，鸡肝，或鸡脖子，猫粮罐头，和/或蔬菜²⁵即可。
3. 检查陷阱，每天两次，并删除海龟。当从陷阱取出乌龟，由边抱动，谨慎使用，以避免爪子或喙伤害。
   1. 副渔获物的释放。回覆若继续俘获需要设置陷阱。评估诱饵的状态。如果诱饵已被消耗，增加更多。拉陷阱，如果附加诱捕不希望到岸边。
4. 如果需要^26，27决定龟的性别和年龄。
5. 将龟在保持袋，并测量体重用弹簧秤到最近的克
6. 运输龟在气候受控运输箱在实验室用的少量水。房子单独的动物中，与未处理池塘水水族馆在25℃左右举行，深足只盖住头部。

2.粘贴无线发射机

1. 为了最大限度地提高发射机寿命和输出，选择最大的无线电发射机可能不超过该动物的体重²⁸的5％。
2. 大约一半确定发射器放置的位置上背甲背甲中线和横向边缘之间大约升1/3从背甲的后缘ength起来。
3. 用干布去除淤泥，杂物和藻类生长准备区。用70％异丙醇拭区。
4. 用5分钟环氧树脂少量附加发射机。定向发射机以最大化与甲壳的表面接触。使得它落后平行于主体的长轴动物后面的天线的位置。
5. 一旦适当地定位，覆盖整个发射器，并用5分钟环氧约为1厘米甲壳周围的表面。
6. 返回龟水族馆，让环氧树脂固化过夜。

3.药理准备

注意:氢溴酸东莨菪碱和东莨菪碱甲基溴是强效的乙酰胆碱受体拮抗剂。当使用这些药物的工作，请查阅材料安全数据表，使用适当的个人防护装备（ 如手套，通风橱），并遵守实验室的安全协议，以避免accidenTAL接触。

1. 使用无菌和antipyrogenic用品，化合物氢溴酸东莨菪碱的储备溶液。称出药物的所需量在分析天平上。混合用注射盐水的东莨菪碱在锥形管的1毫克/毫升的浓度。涡旋溶液直至溶解。确保基的化学品是化学纯度符合或超过美国药典（USP）制剂时可能^11。
2. 重复步骤3.1与东莨菪碱甲基溴化物。
3. 通过0.22微米孔径的尼龙或混合纤维素酯处理溶液注射器过滤器进入无菌密封的血清小瓶中。
4. 室温保存。 24小时内使用。

4.追踪海龟运动使用无线电遥测^11，12

1. 移动到目标动物的大致位置，从动物其余至少25米使用定向八木天线和设置在中等接收机增益，扫描卧式上，以确定动物的粗方向和位置。当接收干扰或弱信号，找到了新的位置。增加抬高或持有八木高空时，可以提高信号。
2. 一旦一个合适的位置被发现采取轴承，记录与GPS你的立场。
3. 使用空/峰值方法^28，确定左和右的空值的轴承。
   1. 识别最强信号的方向。转动增益向下尽可能同时仍接收可检测信号。在接收器上使用衰减开关，如果这样装备。移动天线向左侧并记录在该信号丢失的罗盘方位。
   2. 重复正确的轴承上一步。
4. 重复步骤4.3从同一动物的至少两个附加位置。
   注:这些附加分应该采取这样的方式，以包围所述动物。
   1. 当一组轴承是从格雷亚取ŧ距离或不可避免的干扰，至少需要两个额外的轴承，以提高准确性。收集套用于尽可能快地估算一个位置，特别是如果动物移动的轴承。
      注:此外，多个人员可以协调就可以同时在同一动物的多个独立的轴承。
5. 使用上述步骤15分钟 - 数字或手工每10动物的记录位置。
6. 认知过程的操纵
   1. 一旦未经处理动物的路径记录（一个主体内的控制），提供了一个既剂量的东莨菪碱或甲基东的。使用在步骤1.5中收集的质量，计算药物的量给予动物以达到6.4毫克/千克东莨菪碱或6.8毫克/千克甲基东^19,20的一个特定的爬行动物的最终剂量。
   2. 通过使用1.0M的尾腹膜窦直接递送药物进入腹膜升注射器用22号针头。确保输送的总体积不超过1毫升
   3. 在捕获其网站上尽快释放动物。
   4. 继续监测动物的运动，每10 - 15分钟，直到它到达其预期目的地。

5.空间分析

1. 计算动物的位置的估计。
   1. 对于每一组的空轴承，平分角（用手或通过软件），以找到所得发射机轴承。重复在给定时间点的所有轴承。
   2. 根据制造商的协议使用三角测量软件，估计动物的与多个发射机的轴承位置和相关联的错误。转换位置估计为x / y坐标，如果软件提供不同的输出。
2. 重复步骤5.1轴承所有集合。
3. 计算运动的空间精度。
   1. 计算累积的几何平均值未经处理的动物（阴性对照），因为他们对自己的目标¹²移动（ 即平均路径）。
   2. 用于治疗和阳性对照组，每组个体，计算直到所有的点的100％已列入^11,12重叠来自5个米的间隔的几何平均线依次较大幅点的累积数目。
   3. 计算的平均值和标准误差在每个组中的所有个体的每个分割行的距离。
   4. 统计分析的数据时，治疗组的时间间隔中任一用于比较在给定的时间间隔，以容纳点或重叠点的100％，这取决于问题。

采用上述方案，认知导航的作用，东部人口进行评估锦龟（Chrysemys PICTA）已经经历了〜百年的季节性短暂的水源。这一人群栖息的短暂的混合（每年并迅速排出-在几个小时）和永久水生生境（ 图1）。先前的研究表明，它们的池塘排水后，居民龟导航到以高精度（±3.5米）在使用前4岁^11-13（ 图1）了解到复杂的，可预测的路线的替代水源。

这项研究表明，由这些龟所使用的过程是与空间记忆的形成一致和召回^11。东莨菪碱在动物的大脑（包括空间记忆的形成受阻胆碱能活性和回忆^19-21 ）导航过程中。用东莨菪碱而幼稚幼体缺乏经验（因而存储器）从它们的精确历史路线改道处理经验的成人为东莨菪碱影响，这表明在感性或非空间认知过程¹¹无东莨菪碱的效果（ 图1和2）。此外，无论是成人还是少年导航被受甲基东控制。成年动物（ 即，那些与在现场以前的经验）东莨菪碱注入失去了按照不穿过血脑屏障是历史性的路径和使用本地线索来导航少年和与药物注入与成人能力不受影响。因此，在本系统中的成人导航似乎是在自然认知。总之，这些结果与龟具有在此期间它们必须学会路径和使用胆碱依赖性认知系统的关键时期的想法是一致S（空间记忆）导航作为成年人^11-13。

图1.导航是在成年海龟认知加工基础 （一）有经验的成年人和（b）天真少年的代表运动-从临时（T）（1 3年）为永久（P）的池塘，而不是用东莨菪碱或治疗甲基东。所有接受东茛菪碱的成人（一，黄色，N = 9），从传统的路线（红，P <0.001）显着渐行渐远（200米），而所有幼稚少年用药物处理过的（B，黄色，N = 7）正是保持传统路线（p <0.999）内运动。所有控制的成年人（一，白色，N = 9）和控制天真幼体（B，白色，N = 6），随后传统路线（P> 0.999）。点中的每行代表一个个体。来自所有组海龟事先注射（P <0.999）保持高精度。从罗斯和科罗赫马尔¹¹的数据。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.导航的精度是认知加工在成年海龟一个函数 ）所有海龟证明治疗（东莨菪碱）或控制的注射前高精密机芯（甲基东; P <0.999）B）注射后，在东莨菪碱治疗成人显著偏离其传统路线（p <0.001）。与此相反，所有其他组持续以高精确度（±3.5米; P> 0.999）进行导航。插入显示0.5重叠的细节 - 3.5米宝int为手段±SEM。从罗斯和科罗赫马尔¹¹的数据。 请点击此处查看该图的放大版本。

这里介绍的协议允许实验者记录和量化在导航认知的作用。在现场操作的认知已经证明是困难的，因为多数的方法发表实验者无法知道哪些动物的行为的具体方面是被操纵。然而，这里提出的协议允许实验者准确操纵，从而评估在导航认知的作用。该技术还允许实验者监测实时动物导航与异常高的空间和时间分辨率，由此赋予研究者清楚地记录在野生动物的认知实验操作的行为后果。

在此背景下，无线电遥测提供准确监测远距离动物动作的能力，产生了高品质的空间和行为数据。虽然本申请遥测的决不是新^28，大多数研究使用这种技术来解决生态和行为（ 例如 ，栖息地利用，家庭范围大小等 ）粗的问题。动物位置的频繁的监测（4 - 每小时5次）描述这里结合精细尺度空间分析提供更详细的行为成分对在空间中的动物的位置。注意，最优跟踪距离将是的发射机强度和设备灵敏度的功能。通常它是从动物保持至少25米的距离，以避免干扰它，虽然当动物位于开放植被，为了避免这种干扰所需的距离可能是更大的最佳做法。

在当前的应用中，高精度的无线电遥测对使用动物装的GPS记录器提供了独特的优势。发射机可以更小，更便宜，并且具有比GPS装置²⁸更长的电池寿命。此外，第t经由无线电遥测远程三角emporal分辨率远远优于动物安装GPS功能。时间，动物安装的GPS单元由电池寿命有限（ 即测量有限数量可以采取，从而制约了它们的频率）。带GPS的高精度跟踪，需要一个大的电池，以获得以上的很长一段时间的高频率位置。这些电池的实质性包块在小动物安装GPS装置²⁸使用排除它们。此外，高精度的无线电遥测不昂贵的数据检索成本的制约，或通过在板上存储器存储限制。然而，无线电遥测是不是最佳的特别大的运动范围（ 例如 ，长距离迁移过程中），在深水或掘地种，或那些在陡峭的山地栖息地追踪动物。另外，高精度的无线电跟踪可能是非常耗费时间，并需要相对大的现场工作人员，特别是F或快速移动的品种;因此，这种方法可能不适合于所有的问题。

用东莨菪碱和甲基东药理操纵提供了具体的垫款认知在自然环境中学习。行为是很难解释，尤其是在野外条件，从而限制了潜在的调查的范围。东莨菪碱允许影响认知过程的特定受体的操作，使研究者提问具体地约认知的操纵。此外，如东莨菪碱容易穿越血 - 脑屏障和甲基东没有，研究人员可以控制东莨菪碱的外周作用，从而解离认知基于从非认知行为。药理学处理的这些优点允许生成和明确行为的预测的随后的测试和得到现场条件下使用复杂的实验设计。然而，SCopolamine是一个非常普遍的乙酰胆碱受体拮抗剂，可以对其他的行为，感觉和认知系统^21-24意想不到的效果。因此，有可能的是，使用东莨菪碱的能产生可与复杂行为的解释干扰影响（ 例如 ，瞳孔扩张，热灵敏度^{21-24，29，30）;}在这个或以前的研究^{11-13，19，20}没有检测到这样的混杂影响。

而无线电跟踪包括弱信号，信号丢失和干扰遇到的常见问题。为了解决信号弱，提高增益，变化天线方向靠拢动物（小心以避免扰乱灵气），以及提升天线^28。如果信号被完全丢失，搜索在限制搜索²⁸的向外螺旋区域中的增益和天线尽可能高。干扰可以通过减小增益予以打击，使用attenuatoR或噪声消除过滤器（如果配备），并改变天线的方向。如果干扰无法通过这些手段来克服，在研究网站今后的工作应该集中在不受干涉的带宽。

总体而言，具有高精度遥感相结合的药理操纵提供了独特的洞察认知的起源和导航的表现中扮演的角色。这种独特的方法的新颖之处使研究人员能够更好地理解导致认知在导航潜在的神经机制。此外，这些技术可与特别适用于空间明晰行为（ 例如 ，导航，迁移，觅食，和分散^{）11-13 33}野生用于认知额外的研究，认知^1,7，和养护的演变（ 例如 ，易位，放归^{）31，32，}这个技术是一个大范围地使用有用在广泛的栖息地类群的e和将是认知理解系统发育模式至关重要。

The authors have nothing to disclose.

This research was funded by Washington College's Provost's Office, Middendorf Fund, Hodson Trust, and Franklin and Marshall's Hackman Fund and College of Grants. We thank E. Counihan, S. Giordano, F. Rauh, and A. Roth for assistance in the field. We thank M. Conner, R. Fleegle, and D. Startt at Chesapeake Farms, and Chino Farms for permission and access. The Washington College GIS Program helped with the preparation of maps.