Модель Серийное Concussive Травмы головы у мышей

Concussion presents the most common type of traumatic brain injury. Therefore, a repetitive concussive animal model, which replicates the important features of an injury in patients, may provide a means to study concussion in a rigorous, controlled, and efficient manner.

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of knowledge on the injury and its effects. To develop a better understanding of concussions, animals are often used because they provide a controlled, rigorous, and efficient model. Studies have adapted traditional animal models to perform mTBI to stimulate mild injury severity by changing the injury parameters. These models have been used because they can produce morphologically similar brain injuries to the clinical condition and provide a spectrum of injury severities. However, they are limited in their ability to present the identical features of injuries in patients. Using a traditional impact system, a repetitive concussive injury (rCHI) model can induce mild to moderate human-like concussion. The injury degree can be determined by measuring the period of loss of consciousness (LOC) with a sign of a transient termination of breathing. The rCHI model is beneficial to use for its accuracy and simplicity in determining mTBI effects and potential treatments.

Сотрясение, называемый также легкой черепно-мозговая травма (mTBI), является наиболее частое возникновение черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и затрагивает миллионы людей в Соединенных Штатах. Сотрясения может быть сложно диагностировать и не существует какого-либо конкретного лекарства от сотрясения мозга. Существует растущее признание и некоторые доказательства того, что мягкая механическая травма в результате спортивных травм, боевые действия , и других физически привлекательных занятий может иметь кумулятивные и хронические неврологические последствия ^1,2. Тем не менее, все еще существует недостаток знаний о сотрясений и их последствий. Текущая методология ограничивает исследования патологии и лечения у людей, так как только неврологическое оценки и анализа изображений доступны для клинического диагноза. Животные модели обеспечивают средства для изучения сотрясений эффективным, строгим, и контролируемым образом с надеждой дальнейшей диагностики и лечения mTBI.

Исследования адаптировали традиционные TBIмодели, такие как контролируемые корковой воздействия (CCI), воздействие жидкости перкуссии (ИПИ), вес травмы падение и травмы взрыв, чтобы выполнить mTBI и стимулировать низкие уровни серьезности травмы путем изменения параметров травмы. Эти модели являются полезными для использования из-за их способности реплицировать травмы головного мозга морфологически сходны с клиническим состоянием; Тем не менее, они также имеют свои собственные ограничения. Тяжесть травмы, вызванной травмы ускорение (падение веса) часто сильно варьирует. Два результаты мягкого CCI - субарахноидальное кровоизлияние и фокусного - ушиб не сравнимы с типичными человеческими сотрясений. ТПП и ИПИ требуют краниотомии, которая не является клинически значимым, в то время как травмы взрыва является более спорной модели в отношении различных измерений положения экспозиции и пик давления, а также переменная вторичное повреждение во время экспозиции ^_3-6. Обновленный Шокирующий животную модель что может перевести доклинических исследований в клиническую Settiнг необходимо в научных исследованиях.

Ключевым вопросом при моделировании мягкий TBI является определение экспериментальной травмы тяжести, которая наиболее близко повторяет травмы в клинических условиях. В последнее время различные исследовательские группы разработали закрытую черепно - мозговую травму или Шокирующий травмы головы (CHI) Модель ^7-10. CHI является модификацией CCI без трепанации, но он по-прежнему использует традиционную электронную систему магнитного воздействия для формирования удара головой. Хи может вызвать сотрясение мозга в диапазоне от легкой до умеренной путем регулирования параметров воздействия. Потеря сознания (ЛОК) можно наблюдать сразу же после удара путем обнаружения уменьшения частоты дыхания или переходного прекращения дыхания. Период LOC используется для определения степени тяжести травмы. Эта статья включает в себя немного улучшенный и обновленный вариант повторяющейся CHI (rCHI) модели у мышей, наряду с подробным протоколом шаг за шагом и репрезентативных результатов. RCHI модель исследования СТРАТЕГИИповторно полезны при определении mTBI эффектов и возможных методов лечения, тем более, что нет индивидуальная модель животного способен подражать все сотрясением индуцированных патологических изменений.

Все процедуры были выполнены в соответствии с протоколами # 201207692 утвержденным Institutional Animal Care и использование комитета Университета Флориды по и в соответствии с национальными институтами здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Уход за животными

1. Используйте 3-4-месячных мышей C57BL 6J мужчина /. Обеспечить постельные принадлежности, гнездовой материал, пищу и воду в неограниченном количестве . Держите мышей при температуре окружающей среды, контролируемых при температуре 20 - 22 ° C с постоянными 12 ч свет / 12-часовых темных циклов.

2. Предварительная подготовка сдавление

1. Приложить на заказ силиконовой резины с покрытием металлический наконечник к электромагнитному стереотаксической ударного устройства. Убедитесь , что плоское дно наконечника параллельна поверхности наконечника зонда (Рис . 1А)
2. Обезболить мышь с 4% изофлуран с последующей поддерживающей анестезии 2,5% изофлуран. Проверьте анестезию с помощью расходомера. Monitoг уровень анестезии до животного достигает хирургического уровня анестезии, показывая потерю снятия педали рефлекса.
3. Поместите мышь в положении лежа на грелку. Используйте воронкообразную носовой обтекатель держать мышь под наркозом. Полностью брить голову с помощью триммера. Используйте вазелин глазной мази на глазах мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом.

3. Влияние Параметры настройки

Примечание: Система воздействия включает блок управления для установки параметров удара, исполнительный механизм для выполнения сдавление и цифровой стереотаксической рамы с осями 3-движения.

1. Заданная скорость ударного устройства до 4 м / сек и времени выдержки до 240 мс на блоке управления.

4. Позиционирование Impact центр

1. Поместите мягкую грелку под тела животного, чтобы поддерживать температуру тела около 39 ° С. Установите мышь в стереотаксической рамы в Pronе положение с решеткой с тупым концом уха.
2. Опустите кончик воздействия близко к голове мыши, перемещая Z-драйвер. Отрегулируйте плоский наконечник удара (диаметром 9 мм) путем перемещения х и у водителей на полпути к целевой координаты над стреловидного шва.
3. Убедитесь , что один край наконечника удара вертикально , параллельно воображаемой горизонтальной линии , проведенной между двумя ушами (Рисунок 1C). Центр воздействия соответствует центральному стреловидного шва на полпути между interfrontal и ламбдовидного швов (Interaural 9 мм до Interaural 0 мм, боковые 4,5 мм).

5. Влияние глубины установки

1. Для того, чтобы правильно установить глубину воздействия, используйте дополнительный наконечник зонда для замены изолированный силиконовой резины покрытием наконечник удара.
2. Для того, чтобы убедиться, что нет никакого смещения центра удара после включения подсказок, установите X и Y канала на цифровой стереотаксической панели управления до нуля перед переключением подсказки.
3. Перемещение Probе наконечник к центру зоны воздействия вручную перемещая X-и Y-дисков.
4. Зажим контактный датчик к хвосту мыши.
5. Перемещение дробилку (Z диск) вниз, пока наконечник зонда не соприкасается с поверхностью участка воздействия.
6. Установите Z-канала на панели управления стереотаксической нулю.
7. Переместить наконечник удара обратно в зону воздействия вручную регулируя х и у водителей (не нулевые кнопки на цифровой стереотаксической панели управления) до Х- и Y-водителей равны нулю (где наконечник удара был ранее расположен).
8. Отвести привод, передвинув переключатель втягивания на блоке управления. Вручную переместите дробилку вниз (драйвер Z) на 4 мм.

6. Воздействие

1. Trigger влияние, нажав на выключатель воздействия на блоке управления и достичь глубины деформации 4 мм.

7. Пост-сдавление

1. Измерьте время от воздействия до первого дыхание мыши не с помощью таймера.
2. Удалить животное от прибора и поместить их на теплую подушку, чтобы поддерживать температуру тела. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее.
3. Разрешить для восстановления перед возвращением животное обратно в чистую клетку. Не вернуть животное в компании других животных, пока полностью не выздоровел.
4. Обратите внимание и взвесить мышей ежедневно. Если мыши обнаруживают признаки боли, внутрибрюшинно вводят их с Мелоксикама на 1 - 2 мг / кг каждые 12 - 24 ч.

8. Повторные Impaction

1. Дайте Мышей дополнительные травмы на дни 4, 7 и 10 после первоначальной травмы (72 ч интервал между ударами).

9. Иммуногистохимия (IHC)

1. Transcardial перфузия
   1. Обезболить мышей через внутрибрюшинной инъекции 200 м / кг фенобарбитала.
   2. Оценка и обеспечить хирургической плоскости анестезии с помощью пальца щепоткой. SecЮр мышь в положении лежа на спине, аккуратно записывая на пленку передние лапы и задние лапы к поверхности Пенополистирол работы внутри химической вытяжкой.
   3. Сделайте надрез через кожу вдоль средней линии грудной клетки от чуть ниже мечевидного отростка до ключицы. Сделайте два дополнительных разрезов кожи на мечевидного отростка и продолжить вдоль основания брюшной ребрам с боков.
   4. Откройте грудной полости и обнажить сердце путем разрезания через грудную мускулатуру и ребрам.
   5. Закрепить бьющееся сердце с тупыми щипцами и сделать 1 - мм разрез 2 в левом желудочке.
   6. Немедленно вставить бабочки иглу в правое предсердие. Начните вливание 20 мл физиологического раствора медленно толкая шприц.
   7. Переход от физиологического раствора до 4% параформальдегидом. Продолжить перфузии с 20 мл параформальдегида.
   8. Обезглавьте мыши и снимите кожу с помощью ножниц. Изолировать мозг из черепа с помощью резака кости.
2. Сryostat секционирования
   1. Код для вставки в ткани мозга оптимальной температуры резания (ОКТ) состава и заморозить при температуре -80 ° C. Поместите мозг в криостата в сагиттальной ориентации. Срезанные срезы головного мозга толщиной 5 мкм.
3. Окрашивание
   1. Сухие замороженные срезы при комнатной температуре в течение 1 часа.
   2. Инкубируйте слайды с 100 мкл 2% козьей сывороткой и 0,1% Тритон Х-100 в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре.
   3. Вымойте слайды 3 раза 300 мкл PBS. Затем инкубировать слайды с анти-GFAP (1: 200) или анти-ферритин антитело (1: 200), отдельно в течение ночи при температуре 4 ° С.
   4. Вымойте слайды 3 раза 300 мкл PBS. Затем инкубировать слайды в течение 2 ч при комнатной температуре с биотин-конъюгированными вторичными антителами.
   5. Вымойте слайды 3 раза 300 мкл PBS. Затем инкубировать слайды с раствором авидинбиотиновом комплекс (ABC) (1:50) при комнатной температуре в течение 30 мин.
   6. Вымойте слайды 3 раза 300 мкл PBS. Затем инкубировать в 3,3'-диаминобензидино растворе (DAB) субстрата (50 мл PBS, 10 мкл H ₂ O _2, 10 мг ДАБ таблетки, фильтра перед использованием) в течение 5 - 8 мин. Обратите внимание на слайды под микроскопом, пока не появятся позитивные клетки.
   7. Промыть слайды в медленном проточной водопроводной водой в течение 5 мин. Чистые слайды с лабораторией-вытирать. Затем установите секции с монтажной средой и покровное.

В этой модели (рис 1 AC), были короткие периоды задыхаясь и мелких дыханий. Потеря сознания (бессознательного) определяется как уменьшение частоты дыхания или транзиторной прекращение дыхания перед возобновлением нормального дыхания. Влияние на центр головы вызвало кратковременное бессознательное состояние (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 сек при каждом ударе по отдельности, рис 1D). Мозг мышей показали нормальную морфологию Н & Е гистологического окрашивания, что указывает на отсутствие очевидного структурных повреждений или повреждение тканей в результате воздействия (рис 2А). В ответ на ЧМТ, астроциты , как известно, претерпеть определенные изменения , включая активацию, пролиферацию, или реактивного глиоз ^11,12. Повышенные глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) положительных клеток с большими клеточными телами и толстыми синапсов являются активированные астроциты. corpus мозолистого из rCHI мозга мыши показали явные признаки активации астроцитов через 7 дней после последнего удара (рис 2B).

Микрокровоточит в ткани распространены в mTBI и может привести к высвобождению железа из гемоглобина ^13. Избыток железа в сыворотке крови могут быть обнаружены с помощью ферритина тестов в клинических условиях ^13. Ферритина иммунопозитивных клетки в коре головного мозга мыши были найдены через один день после последнего удара и длилась , по крайней мере за семь дней, предполагая , что несколько impactions может привести к корковых микрокровоточит (фиг.2с).

Рисунок 1. Мышь Модель Repetitive Шокирующий травмы головы. (A) выполненный на заказ толщиной 1 мм силиконовой резины с покрытием наконечник размером 9 мм в диаметре с наконечником зонда. (B) Мышь мounted в стереотаксической раме в положении лежа на животе с мягким грелку под днищем кузова. (C) Воздействие центра позиционирования. Край наконечника прицельного вертикально параллельно воображаемой горизонтальной линии, проведенной между двумя ушами. Воздействие центр соответствует на полпути между interfrontal и ламбдовидного швов (Interaural 9 мм до Interaural 0 мм, боковые 4,5 мм). (D) Апноэ определяется как короткие периоды переходного прекращения дыхания. Среднее и SD показаны в нижней панели. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Гистология для повторяющегося Шокирующий травмы головы. (А, слева) Мозг мыши был удален после перфузии 4% параформальдегида. Никаких повреждений ткани обнаружено не было. (A, справа) H & E окрашивание проводили на мыши один день после последней травмы. Шкала бар = 1,5 мм. (Б) увеличение биохимического маркера для глиоз (GFAP) в мозолистого через 7 дней после последнего травмы. Шкала бар = 200 мкм. (С) с помощью иммуногистохимии, ферритина-Н-цепи было обнаружено , что выражается в коре головного мозга после травмы. На вставки картины представляют собой возвеличил положительных клеток. Шкала бар = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Для того, чтобы имитировать мозговые травмы морфологически сходны с клиническим состоянием, симптомы после сотрясения ожидаются. симптомы после сотрясения обычно включают в себя головную боль, головокружение, головокружение, усталость, проблемы с памятью и сна, проблемы с концентрацией внимания, а также беспокойство и подавленное настроение. Поскольку соматические симптомы могут быть еще не измеримы на животных моделях, изменения двигательных и когнитивных функций и эмоционального поведения используются в качестве критериев для оценки рационально сотрясение мозга на животных моделях. В ранее опубликованном исследовании было показано , что модель мыши rCHI вызывает дефициты пространственное обучение, память и тревоги ^8. Что еще более важно, модель rCHI используется в данном протоколе представляет клиническую установку без применения инвазивного черепно-мозговой травмой или структуры мозга перелома, оба из которых могут привести к кровотечению, кровоизлияния, отек или острой потери гибель клеток / ткани.

Ниже приведены основные советы для успешного моделирования последовательного concussioн / mTBI с использованием электронной системы ударного магнита:

Избегайте второй черепно-мозговую травму непосредственно после первого черепно-мозговой травмы, которые могут быть вызваны движением во время удара. Головка мыши может немного двигаться вниз во время удара. Для того, чтобы избежать ушиба мозга, вызванную быстрым движением против твердой земле или головы растяжения, мягкой грелку необходимо поставить под корпусе мыши. Голова и тело также должны храниться в горизонтальном положении. Кроме того, используйте тупым концом полосы уха, чтобы зафиксировать голову мыши в стереотаксической рамы, а не вставлять их в ушной канал. Это защищает мышь от повреждений, вызванных острыми концами во время движения.

Правильно расположите центр удара и установить ноль. В отличие от открытой черепно-мозговой травмой, позиционирование наконечника воздействие относительно трудно. Размер наконечника удара и центра удара влияют на степень тяжести ранения и повреждения. На основе мыши анатомии мозга, центр удара предназначен, чтобы соответствовать на полпутимежду interfrontal и ламбдовидного швами (Interaural 9 мм до Interaural 0 мм, боковые 4,5 мм). Таким образом, требуется оптимизированная наконечник 9 мм. Кончик воздействие должно быть отрегулировано на координаты цели выше стреловидного шва на полпути, и один край наконечника удара должна быть вертикально , параллельно воображаемой горизонтальной линии , проведенной между двумя ушами (фиг.1С). Изолированный наконечник удара с силиконовой резины блоков покрытия контактного датчика и предотвращает увеличение глубины воздействия. Наконечник зонда необходимо, и должна быть параллельна поверхности кнопки на кончике удара. Центр удара настраивается на трогательном месте наконечника зонда, управляя стереотаксической инструментом. Scrubbing голову физиологическим раствором увеличивает электрогидравлического чувствительность. Кроме того, зонд является съемным или спроектировано, чтобы не повредить мозг во время удара. Альтернативный способ заключается в создании двух советов с одинаковой длины; один наконечник покрыт силиконовой резиной, а другой наконечник был бы металл, который будетиспользовали в качестве зонда. Два советы должны переключаться между позиционированием и сжимать.

Монитор краткие бессознательные симптомы мышки сразу после удара. Как обсуждалось выше, большинство симптомов после сотрясения трудно сразу наблюдать в модели лабораторных мышей животных. mTBI пациенты могут испытывать кратковременная потеря сознания после травмы. Для того, чтобы установить видимые параметры травмы, краткая потеря сознания был симптом используется для оценки достоверности этой модели Шокирующий TBI. Потеря сознания (LOC), как правило, используется в качестве критерия для классификации тяжести травмы у пациентов с ТПМ. В большинстве видов спорта , связанных с сотрясениями, длительность LOC составляет менее одной минуты ^14. За счет оптимизации условий эксперимента, таких как скорость удара и время выдержки, ЛОК составляет менее 10 секунд после удара. Оптимальное состояние воздействие глубина воздействия 4 мм, 240 мс время выдержки, и 4 м / с скорость удара. Повышена скорость удара и живитевремя может вызвать острое повышение внутричерепного давления в течение большого количества времени, которое может привести к тяжелой черепно-мозговой травмы или смерти немедленно от угнетения дыхания. Мыши будут терять вес тела после каждого удара, но восстановить вес после 72 часов восстановления. 72 ч повторяющиеся интервалы выбираются так, чтобы имитировать восстановительный период для травмированных спортсменов, прежде чем вернуться к своему виду спорта.

Помимо потери сознания и дыхательных проблем, клиника симптомы сотрясения могут включать судороги, головная боль, головокружение, тошнота и рвота. В модели, боль мозг может быть большинство неудобным симптом для животных. Тело оценка состояния и описание категории боли следует использовать в качестве гуманного конечных точек. Кроме того, другие специфические неврологические конечные точки, такие как бесконтрольного изъятия, спонтанном кружили поведение, потеря равновесия и не в состоянии ходить или стоять следует рассматривать как rCHI-гуманных конкретных конечных точек. Так как это не является легкой моделью травмы, как правило, не СИГВВПficant признаки боли наблюдаются сообщению каждый удар. Анальгетики, как правило, нет необходимости на этом уровне черепно-мозговой травмой. Этот протокол содержит подробные основные этапы моделирования повторяющихся Шокирующий мягкий TBI. Скорость и глубина каждого удара можно регулировать в зависимости от желаемой степени серьезности травмы. Эта модель использует электронную систему воздействия на магнит наносить удары. Он устойчив с точно контролируемой скоростью, времени выдержки и глубины деформации. Тем не менее, поскольку она является закрытой черепно-мозговая травма без краниотомии, невозможно точно позиционировать влияние мозга мыши с помощью стереотаксических координат. Кроме того, переключение советы воздействия / зонд может привести к сдвигу воздействие сайта, который является основной причиной непоследовательных травм. Учитывая диффузное травму и сотрясение мозга оказалось, как и следовало ожидать, эта модель остается точной и легко контролировать.

Эта модель выгодно использовать для своей точности и простоты в определении последствий воздействиялегкой травмы о связанных головного мозга, особенно связанных со спортивными состязаниями сотрясение мозга. Он служит платформой для проведения доклинических исследований, таких, как изучение диагностических и прогностических биомаркеров, а также тестирование изделий медицинского назначения, лекарственных средств и решение генной терапии. Эта модель также может быть использована для изучения хронической травматической энцефалопатии (КТР), которая в настоящее время является диагностируется только через посмертного нейропатологического экзамен.

The authors have no financial interest to disclose.

This works was supported by funding from a Florida Health grant (Brain and spinal cord injury research fund) (KKW).