重复震荡颅脑损伤模型小鼠

Concussion presents the most common type of traumatic brain injury. Therefore, a repetitive concussive animal model, which replicates the important features of an injury in patients, may provide a means to study concussion in a rigorous, controlled, and efficient manner.

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of knowledge on the injury and its effects. To develop a better understanding of concussions, animals are often used because they provide a controlled, rigorous, and efficient model. Studies have adapted traditional animal models to perform mTBI to stimulate mild injury severity by changing the injury parameters. These models have been used because they can produce morphologically similar brain injuries to the clinical condition and provide a spectrum of injury severities. However, they are limited in their ability to present the identical features of injuries in patients. Using a traditional impact system, a repetitive concussive injury (rCHI) model can induce mild to moderate human-like concussion. The injury degree can be determined by measuring the period of loss of consciousness (LOC) with a sign of a transient termination of breathing. The rCHI model is beneficial to use for its accuracy and simplicity in determining mTBI effects and potential treatments.

脑震荡，也被称为轻度颅脑损伤（MTBI），是创伤性脑损伤（TBI）的最频繁发生，影响数百万人在美国。震荡可能会非常棘手的诊断并没有为脑震荡没有具体的治疗。有越来越多的认可和一些证据表明，运动损伤，军事打击，以及其他物理引人入胜的追求导致轻微的机械性损伤可能有累积性，慢性神经后果^1,2。然而，仍然有关于脑震荡及其影响的认识不足。现行方法限制病理和治疗的人类研究的，因为只有神经评估和成像评估可用于临床诊断。动物模型提供了学习的脑震荡与进一步的诊断和治疗MTBI的希望高效，严谨，可控的方式的一种手段。

有研究适应传统的TBI车型如控制皮质影响（CCI），液压冲击影响（FPI），体重下降损伤，爆炸伤执行MTBI通过改变参数的伤害低刺激伤害的严重性。这些模型，由于其复制脑外伤形态上类似于临床状况的能力是有益的使用;不过，他们也有自己的局限性。由加速度损伤（重量滴）诱导损伤的严重程度常常是高度可变的。轻度CCI的两种结果 - 蛛网膜下腔出血和挫伤焦点 - 不典型的脑震荡的人可比的。 CCI和FPI需要开颅手术，这不是临床相关，而爆伤是曝光^3-6期间关于不同的曝光位置和峰值压力测量一个比较有争议的模型，以及可变继发性损伤_。一个更新的震荡动物模型可以转化临床前研究的临床settiNG是必要的研究。

在模拟轻度TBI的关键问题是确定实验损伤严重，其中最密切复制在临床受伤。最近，不同的研究小组开发出闭合性颅脑损伤或震荡头部损伤（CHI）模型^7-10。 CHI是CCI的不开颅的修改，但它依然采用的是传统的电子磁场影响系统产生头部撞击。阴气可以通过调节参数的影响引起了脑震荡，从轻度到中度。意识（LOC）的损失可立即通过检测呼吸速率或呼吸的瞬时终止的降低的冲击之后观察到。 LOC的期间被用于确定损伤的严重程度。本文包括小鼠重复CHI（rCHI）模型略有改善和更新版本，以及一个详细的一步一步的协议和代表的搜索结果。该rCHI模型研究战略重新确定MTBI效应和潜在的治疗有益的，特别是因为有能够模仿所有的脑震荡引起的病理变化没有个体动物模型。

根据协议＃201207692由佛罗里达大学的机构动物护理和使用委员会，并按照卫生指南实验动物的护理和使用国家认可的机构进行所有的程序。

1.动物护理

1. 使用3-4个月大的雄性C57BL / 6J小鼠。提供床上用品，排料，食品， 自由采食和饮水 。保持小鼠控制在20环境温度 - 22℃，恒定的12小时光照/ 12小时黑暗的周期。

2.预嵌塞准备

1. 安装一个特制的硅橡胶涂层的金属尖的电磁影响立体设备。确保尖端的平底平行于探头尖端（ 图1A）的表面上。
2. 麻醉，用4％的异氟醚后2.5％异氟烷维持麻醉的小鼠。检查经由流量计的麻醉。 MonitoR中的麻醉水平，直至达到动物展示踏板撤回反射消失手术水平的麻醉。
3. 把鼠标在一个加热垫俯卧。使用一个漏斗形鼻锥保持鼠标麻醉下。使用微调完全剃光头。使用鼠标的眼睛凡士林眼药膏，以防止干燥时的麻醉下。

3.影响参数设置

注:冲击系统包括控制箱设置冲击参数，以执行嵌塞的致动器，并用3-运动轴的数字立体定位框架。

1. 冲击装置的速度预先设定为4米/秒和停留时间，以在控制箱240毫秒。

4.定位影响中心

1. 把动物的身下软加热垫，以保持身体的温度接近39℃。安装鼠标立体定位框架中PRON用钝头耳条E的位置。
2. 降低的影响，通过尖端移动Z驱动器靠近鼠标的头部。通过向目标坐标矢状缝上述中途移动所述X和Y驱动调整平面冲击尖端（9毫米直径的）。
3. 确保冲击尖端的一个边缘被垂直地平行于两个耳朵（ 图 1C）之间画的假想水平线。冲击的中心对应于interfrontal和人字缝之间的中心矢状缝中途（耳间9毫米到耳间0毫米，横向4.5毫米）。

5.影响深度设定

1. 要正确设置的影响深度，使用额外的探头尖端更换绝缘硅橡胶涂层的影响一角。
2. 为了确保有切换提示后无冲击中心的转变，切换提示前，数字立体控制面板上的X和Y通道设置为零。
3. 移动概率E喷嘴的冲击区域的中心手动移动X和Y驱动器。
4. 夹子接触式传感器鼠标的尾巴。
5. 移动至冲击（Z驱动），直到探针尖端接触的冲击部位的表面上。
6. 立体定位控制面板上的Z通道设置为零。
7. 通过手动调节X轴和Y驱动器（未在数字立体控制面板上的零的按钮），直到X和Y驱动移动至冲击尖端回到冲击面积是零（其中冲击尖端先前定位）。
8. 由控制箱移动收缩开关缩回致动器。手动4 mm将撞击向下（Z驱动器）。

6.影响

1. 通过点击在控制箱的冲击开关触发的影响，并实现4mm的变形深度。

7.后嵌塞

1. 直到使用定时器鼠标的第一次呼吸测量从影响的时间。
2. 从仪器上取下动物，并将其放置在一个温暖的垫来维持自己的体温。不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。
3. 返回动物放回一个干净的笼子前，允许进行恢复。不要动物重返公司其他动物，直到完全康复。
4. 观察并每天称重小鼠。如果小鼠显示疼痛的迹象，腹膜内以1美洛昔康注射他们 - 2毫克/公斤，每12 - 24小时。

8.重复嵌塞

1. 给老鼠额外伤害7日4，和10最初的损伤（影响之间72小时间隔）之后。

9.免疫组织化学（IHC）

1. 穿心灌注
   1. 麻醉经由腹膜内注射的小鼠的200米/公斤戊巴比妥。
   2. 评估并通过脚趾捏保证手术面麻醉。二段URE在仰卧位鼠标的前爪和后爪轻轻的录音，以聚苯乙烯泡沫塑料工作表面化学通风柜内。
   3. 通过沿着刚刚剑突至锁骨下胸腔中线的皮肤做一个切口。使两个附加的皮肤切口在剑突和沿腹胸腔横向的底部进行。
   4. 打开胸腔，并通过胸部肌肉和胸腔切割暴露心脏。
   5. 固定跳动的心脏钝钳，并进行1 - 左心室2毫米切口。
   6. 立即插入一个蝴蝶针入右心房。通过推动注射器缓慢开始20毫升盐水的输注。
   7. 从切换到生理盐水4％多聚甲醛。继续与多聚甲醛20ml的灌注。
   8. 斩首鼠标并用剪刀去除皮肤。使用骨刀头骨隔离大脑。
2. Cryostat切片
   1. 在最佳切削温度（OCT）制定和冻结嵌入脑组织在-80℃。放置在低温恒温器的大脑矢状方向。切脑切片5微米厚。
3. 染色
   1. 干燥在常温下的冷冻切片1小时。
   2. 用100μl2％山羊血清和0.1％的Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水（PBS），在室温1小时孵育的幻灯片。
   3. 用300微升PBS洗幻灯片的3倍。在4℃下:（200 1）分别过夜:然后孵育用抗GFAP（1 200）的幻灯片或抗铁蛋白抗体。
   4. 用300微升PBS洗幻灯片的3倍。然后孵育载玻片在室温下与生物素缀合的二级抗体2小时。
   5. 用300微升PBS洗幻灯片的3倍。然后孵育与抗生物素蛋白 - 生物素复合物（ABC）溶液（1:50）在室温下30分钟的幻灯片。
   6. 用300微升PBS洗幻灯片的3倍。 8分钟-然后在3,3'-二氨基联苯胺为5（DAB）底物溶液（50毫升的PBS，10微升_的 H ₂ O _2，10毫克的DAB丸，在使用前过滤器）孵育。观察载玻片，在显微镜下，直到阳性细胞出现。
   7. 冲洗在缓慢的流动自来水将载玻片5分钟。干净的玻片用实验室擦拭。然后装入带安装介质和盖玻片的章节。

在这个模型中（ 图1 AC），有喘息和呼吸浅的短暂。意识（无意识）的损耗被定义为呼吸率或恢复正常的呼吸呼吸之前短暂终止下降。在头部的中心的冲击造成的短期无意识（7.5±4.7，7.8±5.5，10.2±8.8，在每个冲击9.5±8.0秒分开， 图1D）。小鼠的大脑表现出通过H＆E染色的组织学，这表明来自冲击（ 图2A）产生没有明显的结构损害或组织损伤正常形态。响应于TBI，星形细胞已知经历某些变化，包括活化，增殖，或反应性神经胶质增生^11,12。增加胶质纤维酸性蛋白（GFAP）与大胞体和突触厚阳性细胞的星形胶质细胞被激活。该corpu从rCHI老鼠大脑胼胝体小号的最后影响（ 图2B）后显示的星形胶质细胞的活化迹象明显在7天。

在组织微出血中MTBI是常见的，并可能导致铁从血红蛋白¹³的释放。血清中铁超负荷可由铁蛋白测试在临床环境¹³来检测。被发现在小鼠皮质铁蛋白免疫阳性细胞一天最后冲击后，历时至少7天，这表明多impactions可能导致皮质微出血（ 图2C）。

图1.反复震荡颅脑损伤的小鼠模型 。 （A）定制了1毫米厚的硅橡胶涂覆尖尺寸为9毫米直径探针尖。（B）鼠标为mounted在与身体下一个软加热垫俯卧位置的立体定位框架（C）的冲击中心的定位。冲击尖的边缘是垂直平行于两耳之间画的假想水平线。冲击中心对应interfrontal和人字缝线之间中途（耳间9毫米到耳间0毫米，横向4.5毫米）。（D）的呼吸暂停定义为呼吸短暂终止短暂。平均和SD是在较低的面板中显示， 请点击这里查看该图的放大版本。

图2.组织学为重复震荡颅脑损伤。 （A，左）与4％多聚甲醛灌流后取出鼠脑。无组织损伤被发现。 （A，右）H＆E染色。比例尺= 1.5mm左右。（B）中的生化标志物中的胼胝体为胶质增生（GFAP）增加最后损伤后7天。比例尺= 200微米。（℃）通过免疫组化，发现了铁蛋白- H链在大脑皮质损伤后表达。插入图片代表放大阳性细胞。比例尺= 200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

模仿脑损伤形态相似的临床病症，预期脑震荡后症状。脑震荡的症状后一般包括头痛，头晕，眼花，乏力，记忆力和睡眠障碍，注意力无法集中以及焦虑，情绪低落。由于躯体症状可能还不是在动物模型衡量，运动和认知功能和情感行为的变化作为标准，在动物模型中合理评估脑震荡。在先前的报道的研究中，它表明，在rCHI小鼠模型诱导缺陷在空间学习，记忆和焦虑^8。更重要的是，在此协议中使用的rCHI模型代表未经侵入性脑损伤或脑结构断裂，这两者都可能导致出血，出血，水肿或急性细胞死亡/组织损失的临床环境。

以下是成功造型一致concussio按键提示N / MTBI使用电子磁铁影响系统:

避免第二脑损伤第一脑损伤可以由运动的影响时引起的直接以下。鼠标头部可能产生的影响时略有下移。为了避免造成对坚硬的地面或头部伸展快速运动的脑挫伤，软加热垫必须在鼠标身下付诸表决。头部和身体也必须保持水平。此外，使用平端耳棒固定在立体框架鼠标的头部，不要将其插入耳道内。这可以防止所引起的运动过程中的尖锐端部损伤的小鼠。

正确定位的影响，中心，建立零。不同于开放颅脑损伤，影响尖端的定位是比较困难的。冲击尖端和冲击中心的规模影响损伤严重性和病变。根据小鼠大脑解剖，冲击中心被设计成对应于中途interfrontal和人字缝线之间（耳间9毫米到耳间0毫米，横向4.5毫米）。因此，需要一种优化9毫米小费。冲击尖端必须调节到目标坐标矢状缝中途的上方，并且冲击尖端的一个边缘必须垂直平行于两个耳朵（ 图1C）之间画的假想水平线。绝缘冲击尖端与硅橡胶涂层块接触的传感器，并防止冲击深度设置。探针针尖需要并应平行于冲击尖端按钮的表面上。的冲击中心通过操作立体定位仪调节到探针尖端接触部位。用生理盐水擦洗头增加了电子灵敏度。此外，探针是可移动的或设计成不影响在伤害大脑。另一种方法是建立具有相同长度的两个提示;涂覆用硅橡胶和其他尖端一个提示将是金属，这将是用作探针尖端。两个提示应该定位和冲击之间切换。

立即监控鼠标的短暂昏迷症状撞击后。如上所述，大多数脑震荡后症状是难以立即观察在实验室小鼠动物模型。 MTBI患者可在受伤后经历短暂的意识丧失。建立可见损伤的参数，意识的简短的损失是用来评价本震荡TBI模型的有效性的症状。意识（LOC）的损失，通常被用作标准的TBI患者的损伤程度进行分类。在大多数体育相关的脑震荡，LOC的持续时间少于一分钟^14。通过优化实验条件下，例如冲击速度和停留时间，所述LOC是冲击后不到10秒。最佳冲击条件是4毫米的冲击深度，240毫秒的停留时间，和4米/秒的冲击速度。增加的冲击速度和停留时间可能会造成过大量的时间，这可能会导致严重的脑损伤或死亡立即从呼吸抑制急性颅内压增高。每一次撞击后，老鼠会失去体重，但恢复后的72小时将恢复体重。 72小时重复间隔选择回到自己的运动前，模仿受伤的运动员恢复期。

除了意识和呼吸问题的损失，脑震荡的临床症状包括抽搐，头痛，头晕，恶心和呕吐。在模型中，大脑疼痛可能是多数不舒服的症状的动物。体况评分和疼痛类的描述应作为人性化的端点。此外，其他具体的神经终端，如不加控制癫痫发作，自发的行为盘旋，失去平衡，无法行走或站立应视为rCHI特定人性化的端点。由于这是一个轻微的损伤模型，一般不显疼痛ficant迹象观察后每次冲击。止痛药通常是在这个水平的脑损伤的不必要的。该协议提供了模拟重复震荡温和TBI详细的关键步骤。每个冲击速度和深度可根据损伤的所需程度进行调整。这款机型采用了电子磁铁影响系统交付的影响。它是稳定的具有精确控制的速度，停留时间和变形深度。然而，因为这是一个封闭的头部损伤未经开颅，就不可能精确地定位使用立体坐标小鼠脑的影响。也切换冲击/探针尖端可能会导致冲击现场移，这是不一致的损伤的主要原因。考虑到弥漫性损伤，脑震荡原来预期，这种模式依然精确，容易控制。

这个模型是有益的确定冲击的影响，以用于其准确性和简单- 相关轻度脑损伤，尤其是与体育有关的脑震荡。它用作用于临床前研究，如探索的诊断和预后的生物标志物以及测试医疗设备，药物和基因治疗溶液的平台。这种模式也可以被用于慢性创伤性脑病（CTE），目前只能通过验尸神经病理学检查可诊断的研究。

The authors have no financial interest to disclose.

This works was supported by funding from a Florida Health grant (Brain and spinal cord injury research fund) (KKW).