Un ripetitivo Concussive trauma cranico Modello nei topi

Concussion presents the most common type of traumatic brain injury. Therefore, a repetitive concussive animal model, which replicates the important features of an injury in patients, may provide a means to study concussion in a rigorous, controlled, and efficient manner.

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of knowledge on the injury and its effects. To develop a better understanding of concussions, animals are often used because they provide a controlled, rigorous, and efficient model. Studies have adapted traditional animal models to perform mTBI to stimulate mild injury severity by changing the injury parameters. These models have been used because they can produce morphologically similar brain injuries to the clinical condition and provide a spectrum of injury severities. However, they are limited in their ability to present the identical features of injuries in patients. Using a traditional impact system, a repetitive concussive injury (rCHI) model can induce mild to moderate human-like concussion. The injury degree can be determined by measuring the period of loss of consciousness (LOC) with a sign of a transient termination of breathing. The rCHI model is beneficial to use for its accuracy and simplicity in determining mTBI effects and potential treatments.

Commozione cerebrale, chiamata anche lievi lesioni cerebrali traumatiche (mTBI), è la presenza più frequente di lesione cerebrale traumatica (TBI) e colpisce milioni di persone in Stati Uniti. Commozioni può essere difficile da diagnosticare e non esiste una cura specifica per commozione cerebrale. Vi è un crescente riconoscimento e alcune prove che lievi traumi meccanici derivanti da infortuni sportivi, combattimento militare, e altre attività fisicamente coinvolgenti può avere conseguenze cumulativi e croniche neurologiche ^1,2. Tuttavia, vi è ancora una mancanza di conoscenza per quanto riguarda traumi e dei loro effetti. metodologia attuale limita gli studi di patologia e trattamento negli esseri umani dal momento che solo la valutazione neurologica e la valutazione di imaging sono disponibili per la diagnosi clinica. Modelli animali forniscono un mezzo per studiare traumi in modo efficiente, rigorosa e controllata con la speranza di ulteriori diagnosi e il trattamento di mTBI.

Gli studi hanno adattato tradizionale TBImodelli come impatto corticale controllata (CCI), l'impatto del fluido-percussioni (FPI), lesioni calo di peso, e lesioni colpo di vento per eseguire mTBI e stimolare gravità bassi lesioni cambiando i parametri di lesioni. Questi modelli sono utili da usare grazie alla loro capacità di replicare trauma cerebrale morfologicamente simile alla condizione clinica; tuttavia, hanno anche i propri limiti. La gravità del danno indotto da un infortunio di accelerazione (calo di peso) è spesso molto variabile. I due risultati della CCI mite - emorragia subaracnoidea e contusione focale - non sono confrontabili con traumi tipici umani. ICC e FPI richiedono una craniotomia, che non è clinicamente rilevante, mentre la ferita esplosione è un modello più controverso per quanto riguarda i differenti misure di posizione di esposizione e di pressione di picco, così come danno secondario variabile durante l'esposizione ^_3-6. Un modello animale concussive aggiornato in grado di tradurre la ricerca pre-clinica in Setti clinicang è necessario nella ricerca.

La questione chiave nel modellare lieve trauma cranico è quello di definire la gravità delle lesioni sperimentale, che replica più strettamente l'infortunio in un ambiente clinico. Recentemente, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato il trauma cranico chiuso o trauma cranico concussive (CHI) Modello ^7-10. CHI è una modifica di CCI senza craniotomia, ma utilizza ancora un urto magnetico elettronico tradizionale per generare un impatto della testa. Un CHI può indurre un trauma cranico che vanno da lieve a moderata, regolando i parametri di impatto. Perdita di coscienza (LOC) può essere osservato immediatamente dopo un impatto rilevando una diminuzione del tasso di respirazione o la cessazione transitoria della respirazione. Il periodo di LOC è utilizzato per determinare la gravità delle lesioni. Questo documento comprende una versione leggermente migliorata e aggiornata di un modello ripetitivo CHI (rCHI) nei topi, insieme ad una dettagliata protocollo passo-passo e risultati rappresentativi. Il rCHI strategie di ricerca del modello dire utile nel determinare effetti mTBI e potenziali trattamenti, soprattutto dal momento che non esiste un modello singolo animale in grado di imitare tutti i concussione indotta cambiamenti patologici.

Tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli # 201.207.692 approvato dal comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della University of Florida e secondo il National Institutes of Health Guide per la Cura e l'Utilizzo di animali da laboratorio.

1. Animal Care

1. Utilizzare 3-4 mesi di età maschi 6J / C57BL. Fornire biancheria, materiale di nidificazione, cibo e acqua ad libitum. Mantenere i topi in temperatura ambiente controllata a 20 - 22 ° C con la luce / 12-hr cicli scuri 12 hr costanti.

2. Pre-compressione Preparazione

1. Collegare un silicone gommato punta in metallo su misura per un dispositivo elettromagnetico impatto stereotassico. Assicurarsi che il fondo piatto della punta è parallelo alla superficie della punta della sonda (Figura 1A).
2. Anestetizzare il mouse con il 4% isoflurano seguita da anestesia di mantenimento del 2,5% isoflurano. Controllare l'anestesia con flussimetro. Monitor livello anestesia finché l'animale raggiunge un livello chirurgica di anestesia mostrando perdita del pedale recesso reflex.
3. Mettere il mouse in posizione prona su una piastra elettrica. Utilizzare un cono a forma di imbuto per mantenere il mouse in anestesia. Completamente radersi la testa con un trimmer. Utilizzare vaselina pomata oftalmica sugli occhi del topo per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.

3. I parametri di impatto Impostazione

NOTA: Il sistema di impatto comprende una scatola di controllo per impostare i parametri di impatto, un attuatore per eseguire l'occlusione, e una cornice stereotassico digitale con 3 assi di movimento.

1. Pre-impostare la velocità del dispositivo di impatto a 4 m / sec e tempi a 240 msec sulla scatola di controllo.

4. Posizionamento del Centro Impact

1. Mettere una piastra elettrica morbido sotto il corpo dell'animale per mantenere la temperatura corporea vicino a 39 ° C. Montare il mouse in una cornice stereotassica in una prone posizione con le barre orecchio smussato-end.
2. Abbassare la punta impatto vicino alla testa del mouse spostando il Z-driver. Regolare la punta piatta impatto (diametro 9 mm) spostando il X e Y piloti a metà strada per le coordinate di destinazione al di sopra della sutura sagittale.
3. Assicurarsi che un bordo della punta impatto verticalmente parallela a una linea orizzontale immaginaria tracciata tra le due orecchie (Figura 1C). Il centro di impatto corrisponde alla metà sutura sagittale centrale tra suture interfrontal e lambdoid (interaurali 9 mm a Interaural 0 millimetri, 4,5 millimetri laterale).

5. Impatto Profondità Impostazione

1. Per impostare correttamente la profondità dell'impatto, utilizzare ulteriore punta della sonda per sostituire la gomma rivestita punta impatto silicone isolamento.
2. Per assicurarsi che non vi è alcun spostamento del centro impatto dopo punte di commutazione, impostare il X e il canale Y sul pannello di controllo stereotassico digitale a zero prima di passare le punte.
3. Spostare il probe punta al centro della zona di impatto spostando manualmente i-drive Y X-e.
4. sonda a contatto clip di coda del mouse.
5. Spostare il dispositivo di simulazione (unità Z) verso il basso fino a quando la punta della sonda tocca la superficie del sito di impatto.
6. Impostare il canale Z sul pannello di controllo stereotassico a zero.
7. Spostare la punta impatto di nuovo alla zona di impatto regolando manualmente X e Y-driver (non il pulsanti a zero sul pannello di controllo stereotassico digitale) fino a quando X e Y driver sono pari a zero (dove la punta impatto è stato posizionato in precedenza).
8. Ritrarre l'attuatore spostando l'interruttore di ritrazione sulla scatola di controllo. Spostare manualmente il dispositivo di simulazione verso il basso (driver Z) da 4 mm.

6. Impatto

1. Innescare l'impatto cliccando l'interruttore impatto sulla scatola di controllo e di raggiungere una profondità di deformazione di 4 mm.

7. Post-occlusione

1. Misurare il tempo per l'impatto fino primo respiro del mouse utilizzando un timer.
2. Rimuovere l'animale dallo strumento e metterli su un pad caldo per mantenere la loro temperatura corporea. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale.
3. Consentire il recupero prima di tornare l'animale di nuovo in una gabbia pulita. Non restituire un animale alla compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
4. Osservare e pesare i topi quotidiano. Se i topi mostrano segni di dolore, per via intraperitoneale li iniettare con Meloxicam a 1-2 mg / kg ogni 12 - 24 ore.

8. Impaction ripetitivo

1. Dare i topi lesioni aggiuntive nei giorni 4, 7, e 10 dopo la lesione iniziale (intervallo di 72 ore tra impatti).

9. immunoistochimica (IHC)

1. perfusione transcardial
   1. Anestetizzare i topi tramite iniezione intraperitoneale con 200 m / pentobarbital kg.
   2. Valutare e garantire chirurgica piano anestesia da un pizzico dito del piede. secondoure il mouse in posizione supina con nastro adesivo delicatamente le zampe anteriori e le zampe posteriori per una superficie di lavoro di polistirolo all'interno di una cappa.
   3. Fare un'incisione attraverso la pelle lungo la linea mediana del torace da appena sotto il processo xifoideo alla clavicola. Fare due incisioni cutanee aggiuntivi al processo xifoideo e procedere lungo la base della gabbia toracica ventrale laterale.
   4. Aprire la cavità toracica e esporre il cuore tagliando attraverso la muscolatura del torace e costole.
   5. Fissare il cuore pulsante con una pinza smussato e fare un 1 - mm incisione 2 nel ventricolo sinistro.
   6. Inserire immediatamente un ago a farfalla nell'atrio destro. Iniziare l'infusione di 20 ml di soluzione salina spingendo la siringa lentamente.
   7. Passare dalla soluzione salina al 4% paraformaldeide. Continuare perfusione con 20 ml di paraformaldeide.
   8. Decapitare il mouse e togliere la pelle con le forbici. Isolare il cervello dal cranio con un cutter osso.
2. Cryostat sezionamento
   1. tessuti cerebrali Incorpora in temperatura di taglio (OCT) formulazione e congelamento ottimale a -80 ° C. Posizionare il cervello nel criostato in un orientamento sagittale. sezioni di cervello Cut 5 micron di spessore.
3. colorazione
   1. Asciugare le sezioni congelate a temperatura ambiente per 1 ora.
   2. Incubare i vetrini con 100 ml di 2% siero di capra e 0,1% Triton X-100 in tampone fosfato salino (PBS) per 1 ora a temperatura ambiente.
   3. Lavare i vetrini 3 volte con 300 ml di PBS. Poi incubare i vetrini con anti-GFAP (1: 200) o anticorpo anti-ferritina (1: 200) separatamente per una notte a 4 ° C.
   4. Lavare i vetrini 3 volte con 300 ml di PBS. Poi incubare i vetrini per 2 ore a temperatura ambiente con anticorpo secondario biotina-coniugato.
   5. Lavare i vetrini 3 volte con 300 ml di PBS. Poi incubare i vetrini con soluzione avidina-biotina complesso (ABC) (1:50) a temperatura ambiente per 30 min.
   6. Lavare i vetrini 3 volte con 300 ml di PBS. Poi incubare in 3,3'-diaminobenzidina soluzione (DAB) substrato (50 ml PBS, 10 microlitri H ₂ O _2, 10 mg DAB pillola, filtro prima dell'uso) per 5 - 8 min. Osservare i vetrini al microscopio fino a quando compaiono le cellule positive.
   7. Sciacquare i vetrini in acqua di rubinetto corsa lenta per 5 min. diapositive pulite con un laboratorio-wipe. Quindi montare le sezioni con mezzo di montaggio e vetrino.

In questo modello (Figura 1 AC), ci sono stati brevi periodi di boccheggiare e respirazioni profonde. Una perdita di coscienza (inconscia) è definita come una diminuzione del tasso di respirazione o la cessazione della respirazione transitoria prima di riprendere una normale respirazione. Un impatto sul centro della testa ha causato perdita di coscienza di breve durata (7.5 ± 4.7, 7.8 ± 5.5, 10.2 ± 8.8, 9.5 ± 8.0 sec a ogni impatto separatamente, Figura 1D). Cervelli di topo hanno mostrato normale morfologia da H & E colorazione istologica, che ha indicato alcuna ovvia lesioni strutturali o di tessuto danni derivanti dall'impatto (Figura 2A). In risposta a TBI, astrociti sono noti per subire alcune modifiche tra cui attivazione, la proliferazione, o gliosi reattiva ^11,12. Aumento fibrillare gliale acidi proteina (GFAP) cellule positive con grandi corpi cellulari e sinapsi spesse sono le astrociti attivati. il corpus calloso da rCHI cervelli di topo ha mostrato evidenti segni di attivazione astrociti a 7 giorni dopo l'ultima impatto (Figura 2B).

Microsanguinamenti nel tessuto sono comuni in mTBI e può portare al rilascio di ferro da emoglobina ^13. Il sovraccarico di ferro nel siero può essere rilevato da test di ferritina in ambito clinico ^13. Le cellule immunopositive ferritina nella corteccia del mouse sono stati trovati un giorno dopo l'ultimo impatto ed è durato almeno sette giorni, il che suggerisce che più inclusioni possono causare microsanguinamenti corticali (Figura 2C).

Figura 1. un modello murino di ripetitivo Concussive trauma cranico. (A) 1 mm di spessore silicone punta rivestita in gomma su misura misura 9 mm di diametro con una punta della sonda. (B) Un mouse è mounted in un telaio stereotassico in posizione prona con una piastra elettrica morbida sotto il corpo. (C) Il posizionamento centrale impatto. Il bordo della punta impatto è verticale parallelo ad una linea orizzontale immaginaria tracciata tra le due orecchie. Il centro impatto corrisponde al punto medio tra suture interfrontal e lambdoid (interaurali 9 mm a Interaural 0 millimetri, 4,5 millimetri laterale). (D) Apnea è definito come brevi periodi di interruzione transitoria di respirazione. La media e la deviazione standard sono mostrati nel pannello inferiore. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Istologia per ripetitivo Concussive trauma cranico. (A, sinistra) Un cervello di topo è stato rimosso dopo perfusione con 4% paraformaldeide. Nessun danno ai tessuti è stata trovata. (A, a destra) colorazione H & E è stata eseguita su un topo un giorno dopo l'ultimo infortunio. Barra di scala = 1,5 mm. (B) Aumento del marcatore biochimico per gliosi (GFAP) nel corpo calloso 7 giorni dopo l'ultimo infortunio. Barra di scala = 200 micron. (C) mediante immunoistochimica, la ferritina-H-chain è stato trovato per essere espresso nella corteccia cerebrale dopo l'infortunio. Le immagini ingrandite inserto rappresentano cellule positive. Scala bar = 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Per simulare le lesioni cerebrali morfologicamente simili alle condizioni cliniche, sono attesi i sintomi post-commozione cerebrale. sintomi post-commozione cerebrale generalmente includono mal di testa, capogiri, vertigini, stanchezza, problemi di memoria e di sonno, difficoltà di concentrazione così come ansia e umore depresso. Dal momento che i sintomi somatici non possono ancora essere misurabile in modelli animali, i cambiamenti del motore e la funzione cognitiva e il comportamento emotivo sono utilizzati come criteri per valutare razionalmente commozione cerebrale in modelli animali. In uno studio riportato precedente, è stato dimostrato che il modello di topo rCHI induce deficit nell'apprendimento spaziale, la memoria, e l'ansia ^8. Ancora più importante, il modello rCHI utilizzato in questo protocollo rappresenta il contesto clinico, senza lesioni cerebrali invasivi o frattura struttura del cervello, entrambi i quali possono provocare sanguinamento, emorragia, edema, o la perdita di cellule morte / tessuto acuta.

I seguenti sono consigli chiave per modellare con successo concussio coerenten / mTBI utilizzando un urto magnete elettronico:

Evitare una seconda lesione cerebrale direttamente dopo la prima lesione cerebrale che può essere causato dal movimento durante l'urto. La testa del mouse può spostarsi leggermente verso il basso durante l'impatto. Per evitare una contusione cerebrale causato da un rapido movimento contro la terra dura o la testa di stretching, una piastra elettrica morbido deve essere messo sotto il corpo del mouse. La testa e il corpo devono essere tenuti orizzontale. Inoltre, usare barre orecchio smussato-end per fissare la testa del mouse nella cornice stereotassica, e non li inserite all'interno del canale uditivo. Ciò protegge il mouse da lesioni causate dalle estremità taglienti durante il movimento.

Posizionare correttamente il centro impatto e stabilire lo zero. A differenza di trauma cranico aperto, il posizionamento punta impatto è relativamente difficile. La dimensione della punta impatto e il centro impatto incide sulla gravità delle ferite e delle lesioni. Basato sul mouse anatomia del cervello, il centro impatto è progettata per corrispondere al punto mediotra i punti di sutura e interfrontal lambdoid (interaurali 9 mm a Interaural 0 millimetri, 4,5 millimetri laterale). Quindi, è necessario un ottimizzato punta 9 mm. La punta impatto deve essere adattato al target coordinate sopra la metà sutura sagittale, e un bordo della punta impatto deve essere verticale parallelo ad una linea orizzontale immaginaria tracciata tra le due orecchie (Figura 1C). La punta impatto isolato con blocchi di rivestimento di gomma siliconica il sensore di contatto e impedisce l'impostazione della profondità impatto. Una punta della sonda è necessario e deve essere parallelo alla superficie del pulsante sulla punta impatto. Il centro di impatto viene regolata al sito toccare sonda agendo strumento stereotassico. Lavare la testa con soluzione salina aumenta la elettro-sensibilità. Inoltre, la sonda è rimovibile o progettata per non danneggiare il cervello durante l'impatto. Un modo alternativo è quello di costruire due punte con la stessa lunghezza; una punta rivestita in gomma di silicone e l'altra punta sarebbe di metallo, che saràutilizzato come punta della sonda. Le due punte dovrebbero essere commutati tra posizionamento e impattante.

Monitorare i sintomi inconsci brevi del topo subito dopo un impatto. Come discusso in precedenza, la maggior parte dei sintomi post-sbattimento sono difficili da osservare immediatamente in un modello animale di laboratorio mouse. pazienti mTBI possono sperimentare una breve perdita di coscienza dopo l'infortunio. Per stabilire i parametri di lesioni visibili, una breve perdita di coscienza è stato un sintomo utilizzato per valutare la validità di questo modello TBI concussive. Perdita di coscienza (LOC) è normalmente usato come criteri per classificare la gravità delle lesioni in pazienti con trauma cranico. Nella maggior parte dei traumi sport legati, la durata del LOC è a meno di un minuto ^14. Ottimizzando le condizioni sperimentali, quali la velocità di impatto e tempi, la LOC è inferiore a 10 secondi dopo un impatto. La condizione di impatto ottimale è una profondità impatto 4 millimetri, 240 msec tempo di permanenza, e 4 m / s di velocità di impatto. Aumento della velocità di impatto e dimoraretempo può causare un aumento della pressione intracranica acuta su una grande quantità di tempo, che può causare lesioni cerebrali gravi o morte immediatamente da depressione respiratoria. I topi perderanno peso corporeo dopo ogni impatto, ma potranno aumentare di peso dopo 72 ore di recupero. intervalli ripetitivi 72 ore vengono scelti per simulare un periodo di recupero per gli atleti infortunati prima di tornare al loro sport.

Accanto a perdita di problemi di coscienza e respiratori, i sintomi clinici di una commozione cerebrale possono includere convulsioni, mal di testa, vertigini, nausea e vomito. Nel modello, dolore cervello può essere la maggioranza sintomo disagio agli animali. Corpo punteggio di condizione e dolore descrizione di categoria devono essere utilizzati come endpoint umane. Inoltre, altri endpoint neurologici specifici, come il sequestro incontrollata, comportamento circuitazione spontanea, perdita di equilibrio e incapace di camminare o stare in piedi devono essere considerati come rCHI-specifici endpoint umane. Poiché questo è un modello di lesione lieve, di norma, non signisegni signifi- di dolore sono stati osservati dopo ogni impatto. Gli analgesici sono in genere inutile a questo livello di lesione cerebrale. Questo protocollo prevede passaggi chiave dettagliati per la modellazione di una ripetitiva trauma cranico lieve concussive. La velocità e la profondità di ogni impatto possono essere regolate a seconda della gravità del danno desiderata. Questo modello utilizza un sistema elettronico impatto magnete per consegnare gli impatti. È stabile con una velocità controllata con precisione, tempo di sosta, e la profondità di deformazione. Tuttavia, perché è un trauma cranico chiuso senza craniotomia, è impossibile posizionare con precisione l'impatto cervello di topo usando coordinate stereotassica. Anche il passaggio delle punte impatto / sonda potrebbe provocare uno spostamento del sito di impatto, che è la principale causa di lesioni incoerenti. Considerando il danno diffuso e concussione si è rivelato come previsto, questo modello rimane preciso e facile da controllare.

Questo modello è vantaggioso utilizzare la precisione e semplicità nel determinare gli effetti di impatto-related lieve lesione cerebrale, in particolare legate allo sport commozione cerebrale. Esso funge da piattaforma per gli studi preclinici, come esplorare biomarcatori diagnostici e prognostici e testare dispositivi medici, farmaci e la terapia genica soluzione. Questo modello può essere utilizzato anche per gli studi di encefalopatia traumatica cronica (CTE), che attualmente è diagnosticabile solo attraverso l'esame neuropatologico post-mortem.

The authors have no financial interest to disclose.

This works was supported by funding from a Florida Health grant (Brain and spinal cord injury research fund) (KKW).