Визуализация miniSOG меткой репарации ДНК белков в сочетании с электронной спектроскопии изображений (ESI)

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Пределы оптическим разрешением и вызов определения конкретных групп населения белка в просвечивающей электронной микроскопии было препятствий в клеточной биологии. Многие явления не может быть объяснено с помощью анализа ин витро, в упрощенных системах и необходимость дополнительной структурной информации на месте, в частности, в диапазоне от 1 нм до 0,1 мкм, для того, чтобы полностью понять. Здесь электронной спектроскопии изображений, техника микроскопия электрона передачи, который позволяет одновременное отображение распределения белков и нуклеиновых кислот, а тег выражение, miniSOG, объединяются, чтобы изучить структуру и организацию ДНК двухцепочечной ремонта перерыв очагов.

Несмотря на значительные достижения в световой микроскопии за последние годы ^1, сотовые биологи до сих пор страдают от разрыва в резолюции. Это ограничивает понимание структурно-функциональных отношений в основных клеточных процессах, которые связаны согласованное взаимодействие между макромолекулярных комплексов (например, в хроматина, репарации ДНК, транскрипции РНК и ДНК) репликации. Хотя электронные микроскопы передачи (ТЕА) S обеспечивает требуемое разрешение, он был сложным определить эти процессы структурно из-за невозможности обозначения специфических белков в то же время быть в состоянии определить биохимический состав визуализированных структур. В отсутствие внутренних мембран, чтобы помочь дифференцировать ядерные структуры, ядро ​​было особенно сложным. Электронной спектроскопии томография (ESI) решает некоторые из этих ограничений, позволяя одновременно регистрировать и дифференцировку ДНК, РНК и протЭйн-основе ядерных структур ^2-5.

Электронной спектроскопии изображений:

Для отображения элементарных распределений при высокой чувствительности и разрешения в электронном микроскопе, можно использовать изображения спектрометр, который выбирает электроны, которые были неупругорассеянных через взаимодействие с внутренними электронами оболочки элемента в образце ^6. Из-за специфичной для элемента количества энергии теряется вследствие ионизации атомов в образце, эти электроны могут быть разделены и визуализированы с помощью спектрометра, который прикреплен к электронным микроскопом. Таким образом, анализ спектра электронов, взаимодействовали с образца показывает качественную и количественную информацию о химическом составе образца ^7. Электроны, которые не теряют энергию при прохождении через образец можно найти в "пик нулевых потерь" потери энергии электроновспектра. Избыток этих электронов связано с массовой плотностью, и толщины образца и состоит из электронов, проходящих через образец, не сталкиваясь с образцом или потери энергии при прохождении через образец. Эта информация может быть полезна для количественного определения абсолютного числа атомов определенного элемента настоящее в образце ^8.

Так биологические образцы состоят главным образом из легких элементов, которые плохо отклонить электроны в падающем пучке ТЕА окрашивание методов с использованием соли тяжелых металлов должны быть применены для того, чтобы генерировать контраст в образце. Отсутствие специфичности большинства этих контрастных агентов и неспособности визуализировать более одного пятна, где специфичность можно ограничивает величину обычной электронной микроскопии при исследовании ядра. ESI имеет значительные преимущества по сравнению с обычными ТЭМ, в частности, для изучения структур клеточного ядра.Можно использовать фосфора богатых природу ДНК- и РНК-содержащих макромолекулярных комплексов, чтобы отличить нуклеопротеидных комплексов из белковых комплексов и решить различные нуклеопротеидных комплексы на основе их плотности нуклеиновых кислот. Остальные биологический материал могут быть отображены на основе его избытке азота. Сопоставление только этих двух элементов и анализ их распределения и относительной численности в рамках различных анатомических структур дает нам много информации о ядре. Например, это легко определить хроматин и рибосом в карте, представляющих изобилие фосфора. Интерхроматиновых пространство, ядерные поровые комплексы, и ядерные тельца, с другой стороны, могут быть легко обнаружены в карте азота изображения.

Мини система синглет генератор кислорода (miniSOG)

В то время как ESI представляет собой мощную технику для изучения на месте структуры хроматина, потому что это займетс преимуществом характерных показателей в элементного состава между фосфором и азотом, элементный состав обычно не могут быть использованы для различения разных популяций белковых комплексов. Антител, меченных с мелкими частицами золота в нанометровом диапазоне были широко используется для отображения местоположения отдельных молекул. Поскольку частиц золота, как правило, прилагается к вторичным антителом, оно появится в окружности примерно 20 нм вокруг эпитопа, обнаруженного с первичным антителом. В пост-вложение образцов, антитела могут обнаруживать только эпитопы, которые подвергаются на поверхности секций. В то время как это можно доказать наличие антигена и связать его с определенной анатомической структуры клетки, в информацию, полученную является неполной, так как большинство из эпитопов затемняется смолы. Предварительно вложение методы, которые используют протоколы подобные тем, которые используются для флуоресцентной микроскопии, разрешить доступ к антигенам всейна всю глубину образца, но шаги проницаемости, которые необходимы, чтобы позволить антителу проникают в клетку, как правило, требуют удаления липидные мембраны и удаления компонентов, которые не могут быть решены путем альдегидов. Кроме того, предпочтительным альдегидом фиксатор для сохранения ультраструктуру, глутаральдегида, обычно уничтожает эпитопы и, следовательно, параформальдегид, как правило, требуется. Это менее эффективно белок-белкового сшивки. Другим недостатком антител, которые помечены наночастиц золота в том, что золото является очень электронно-плотного материала, что создает резкий контраст, который может затенить интересные конструктивные детали образца, который имеет слабую контрастность.

Появление зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве выраженной тега белка превратил использование флуоресцентной микроскопии, чтобы ответить на вопросы в клеточной биологии. Пометка белок с небольшим флуоресцентного домена позволяет отображение его распределения в естественных условиях без необходимости процедуры проницаемости, которые могут изменить структуру. Для того, чтобы перевести элегантный принцип использования белковых теги для отображения распределения белка в клетке электронной микроскопией, система была необходима, что способна производить сигнал близка к структуре интересов и создания контраста в ПЭМ. Полимеризованный диаминобензидин это пятно, которое часто используется в гистологии, чтобы обнаружить антитела обязательными. Этот краситель, как правило, наносят при помощи пероксидазы хрена (HRP), конъюгированный с вторичным антителом. Хотя реакция производит надежный результат, ПХ не каталитически активным в цитозоле клеток ^9. Продукты реакции HRP может также диффундировать от места производства таким образом, чтобы их разрешение хуже, чем методом нанозолотом ^10. Для того, чтобы обойти эти проблемы, флэш-система / ReAsH был разработан ^11. Он состоит из рекомбинантных слитых белков, которые обладают tetracysteine ​​мотив. Этот мотив позволяет связываниеbiarsenic флюорофор. При возбуждении, связанный со вспышкой или ReAsH способен генерировать активные формы кислорода весьма синглетный и, таким образом, photoconvert диаминобензидина (DAB) в полимер, который выпадает в осадок сразу на месте меченых белков. Полимер DAB могут быть окрашены осмия, который электронно плотной и, таким образом, может быть использован для отображения распределение рекомбинантного слитого белка в ПЭМ.

В 2011 году Shu др. ¹⁰ представлены системы miniSOG, который состоит из небольшого 106 аминокислот слитого тега, полученной из флавопротеида из Arabidopsis, который флуоресцентные и способны создать много радикалов синглетный кислород при возбуждении 448 нм синим светом. Эти синглетных кислородные радикалы могут быть использованы для фото-окисления диаминобензидино с образованием полимеров на и вблизи поверхности меченый белок, который значительно ближе, чем immunogold меченых антител ^11. В то время как система Flash / ReAsH требует чего фторхром и диаминобензидин в клетки, прежде чем делать фотоконверсии, система требует только miniSOG диаминобензидина и свет, и в дополнение примерно так эффективны дважды полимеризации диаминобензидина. Здесь miniSOG используется в сочетании с ESI с целью картирования ультраструктуры репарации ДНК фокусов.

Репарации ДНК очаги (ФПИ)

Неотремонтированного ДНК двойные разрывы ДНК представляют собой серьезную угрозу для клетки, так как они могут привести к потере транслокаций и генетической информации. В свою очередь, это может привести к старения, рака и смерти клеток. Многие белки, участвующие в ДНК двойной ремонта прядь перерыв накапливаются в очагах, что собрать вокруг ДНК двойной нити сломать ^12-14. Хотя их функция не известна, они представляют собой сайт в ядре, который содержит ДНК двойной разрыв нити и этот участок ДНК двухцепочечной ремонта разрыва.

Репарации ДНК ВОКя (ФПИ) были охарактеризованы с помощью флуоресцентной микроскопии, и они служат в качестве биомаркеров для повреждения ДНК ^12,15. Они массивны по сравнению с размером двухцепочечной перерыва и считались относительно однородным до недавнего микроскопия сверхвысокого разрешения не показали некоторые признаки суб-компартментализацией молекул внутри каждого ^рынка 16. Для того, чтобы понять, как эти сайты организованы, необходимо визуализировать все исходные биологических структур относительно друг друга. Это не может быть достигнуто с помощью флуоресцентной микроскопии, но возможно через электронную микроскопию ^17,18. Здесь описан способ, который сочетает спектроскопического изображений электронов с методом miniSOG, чтобы проиллюстрировать потенциал Этот комбинированный подход, чтобы исследовать ультраструктуру репарации двухцепочечной перерыва.

1. Генерация miniSOG клеточных линий

1. Выращивают U2OS (остеосаркомы человека) клетки в 35 мм чашку, содержащую 2 мл низкий уровень глюкозы в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), который с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с _5% CO 2 Атмосфера.
2. Трансфекции клеток, когда они 80% сливной липофекцией с очищенной качества трансфекции (A269 / 280 Коэффициент 1,8-2,0) плазмидные конструкции, содержащие последовательности для miniSOG и mCherry меченых белков ремонт в соответствии с протоколом производителя реагента для трансфекции ^19. Выражение плазмиды miniSOG можно заказать в Цяня-Lab: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
3. Сортировать клетки, экспрессирующие рекомбинантный белок с тегом miniSOG и mCherry флуоресцентной активированный сортировки клеток двух дней после трансфекции. Сбор клетокс промежуточной интенсивности флуоресценции во избежание клетки, которые с гиперэкспрессией ^20.
4. Культура положительных клеток на 10 см чашку в 10 мл DMEM среде, которая с добавлением 10% FBS и 0,6 мкг / мл G418 селективного агента (Geneticin).
5. После видимые колонии появились на пластинах, экран для mCherry положительных колоний с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа и рисовать круги вокруг них (на нижней части пластины) с маркером. Используйте малом увеличении воздуха объектива (например, 10x) и выбрать клонов с использованием стерильной техники, тщательно царапин колонии от и медленно сосать их в стерильной 1000 мкл кончика пипетки.
6. Expand отобранные колонии и заморозить их части вниз с помощью питательной среды, описанные в шаге 1.1, дополненной 10% диметилсульфоксида. Проверьте клетки для формирования ФПИ путем выращивания их на стерильных 18 х 18 ^мм 2 покровные стекла и подвергая их2 Гр излучения. Облученные клетки стабильно экспрессирующие miniSOG mCherry помечены ремонт белок должен показать типичный образец фокусное характеристику ДР, когда визуализируется с помощью флуоресцентного микроскопа фильтр-набор для визуализации mCherry.

2. Культура клеток

1. Культура U2OS клетки стабильно выражения miniSOG и mCherry помечены ремонт белки в условиях, изложенных в пункте 1.1. Рост клеток до 80% слияния в 35 мм Диаметр стеклянным дном чашке, содержащей 2 мл DMEM. Убедитесь, что клей, который придает покровное к пластику и используемого пластика устойчив к водных и спиртовых растворов и устойчив к используемой смолы!
2. Перед проведением эксперимента, наметить небольшую площадь около 1 мм ^2, который содержит клетки, экспрессирующие эктопические белки от царапин с помощью стерильного алмазной ручкой с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы определить область интереса. Можно также использовать стекло снизу блюдо тшляпа содержит покровное с заранее протравленной системы сетки, построенной в покровное.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании высокого качества корреляционный микроскопии сочетая ESI и флуоресценции микроскопических ^{фотографий:} 21, убедитесь, что толщина покровного стекла совместима с целями масло погружения. Следует иметь толщину No. 1.5 (0.16-0.18 мм). Выберите область, недалеко от центра тарелки для региона рассмотрены в ТЕА во избежание проблем с полимеризации смолы, которые могут возникнуть у краев (см пункт 4.10-4.13).

3. Повреждения ДНК Индукция

1. Облучать клетки с гамма-излучением, использовать радиомиметических препарат, или индуцировать повреждение под действием лазерного излучения на микро конфокальной микроскопии (например, как описано в ^{18,22 или} 23).
2. В этом примере, облучать клетки с 2 до 6 Гр гамма-облучением в цезий-137 источника излучения или лазерного microirradiate использованием 405 нм зольтвердотельного лазера идентификатор конфокальной микроскопии после сенсибилизации клеток в течение 20 мин с 0,5 мкг / мл Hoechst.

4. Подготовка проб

1. Зафиксировать клетки с 1 мл 4% параформальдегида в буфер ОСТОРОЖНО какодилатном 0,1 М натрий или в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4 в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
   ВНИМАНИЕ: Параформальдегид и какодилат натрия токсичны! Надевайте перчатки и распоряжаться токсичных веществ адекватно.
2. Промыть клетки дважды 4 мл буфера рН какодилат 0,1 М натрий 7,4 или фосфатного буфера, рН 7,4.
3. Treat фиксированные клетки с 2 мл 50 мМ глицина, 5 мМ аминотриазол и 10 мМ цианид калия осторожностью в буфере какодилатном 0,1 М натрий или 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) (проверить рН!) В течение 30 мин для того, чтобы блокировать непрореагировавший альдегидные группы и подавить активные формы кислорода, генерируемых гема групп, которые могут увеличить фон.
   ВНИМАНИЕ: Калий цианистый является чрезвычайно токсичным! Втуха, перчатки, работать под капюшоном и распоряжаться токсичных веществ адекватно. Реакция очень чувствительны к рН, поэтому важно, чтобы рН проверены и точны.
4. Запишите площадь, которая была выбрана в шаге 2.2 в 2D или 3D на перевернутой флуоресцентного микроскопа, если корреляционная микроскопия желательно.
5. Подготовка 1 мг / мл раствора гидрохлорида диаминобензидина ВНИМАНИЕ путем размещения 10 мг гидрохлорида диаминобензидина планшет в 2 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 980 мкл дистиллированной _H 2 O и 20 мкл концентрированной соляной кислоты (11,65 м) и перемешать до тех пор, пока раствор не станет светло-коричневого и прозрачным. Развести этот раствор в 0,1 М фосфатном или 0,1 буфере какодилатном М натрий до конечной концентрации 1 мг / мл, а доведение рН гидроксидом натрия до рН от 7,0 до 7,6 (рН 7,4 рекомендуется).
   ВНИМАНИЕ: диаминобензидин токсичен! Надевайте перчатки и распоряжаться токсичных веществ адекватно.
6. Для фотоокисления, гeplace буфер с 2 мл 1 мг / мл раствора гидрохлорида диаминобензидина в буфере 0,1 М какодилата натрия или фосфатным буфером. Защита это решение от света и охладить его на льду до 4 ^{° С} для того, чтобы увеличить растворимость кислорода. Насыщения раствора кислородом барботированием кислорода через раствор (использовать шланг, который вставляется в раствор и соединенный с бутылкой кислорода). Проверьте рН снова и при необходимости отрегулируйте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно для реакции фотоокисления, что рН находится между рН 7,0 и рН 7,6.
7. Установите блюдо с фиксированными клетками тщательно на перевернутой флуоресцентного микроскопа, снабженного 40x иммерсионным объектива и переместить его в интересующей области. Excite тег miniSOG с синим светом с помощью кубиков фильтра для GFP или CFP. MiniSOG имеет максимум возбуждения при 448 нм с плечом при 473 нм ^10.
8. Продолжить с подсветкой даже после зеленой флуоресценции miniSOG гаS полностью исчезли и до коричневого фото-продукт окисления полимеризованном диаминобензидина возникает в проходящем свете канала. Когда продукт окисления видна в большинстве клеток, выключите освещение флуоресценции, чтобы остановить фото-окисления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фото-окисление может занять до нескольких минут в зависимости от объектива, длин волн передачи фильтра и эффективности, и источником освещения.
9. Постфикс клетки с 1 мл 2% глутарового альдегида в 0,1 рН какодилатном М натрий 7,4 буферных или фосфатный буфер с рН 7,4 в течение 30 мин.
10. Закрепить мембраны клеток с 0,1% -0,5% осмия в течение 20 мин в какодилатном буфере, рН 0,1 М натрий 7,4 или в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4.
    Примечание: Рекомендуется использовать минимально возможную концентрацию осмия, необходимого для стабилизации мембран. Так полимеризованные осадки DAB имеют высокую плотность азота, который может быть обнаружен непосредственно ESI, сильныйОкрашивание осмий не нужно определить miniSOG-меченый белок в и может быть пагубным для ESI. Осмий осмия очень токсичен! Работа в вытяжном шкафу и распоряжаться токсичных отходов адекватно.
11. Высушить, клетки через серию этанола с использованием 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% этанола шаги (каждая 5 мин). Впоследствии, инкубировать клеток в соотношении 1: 1 смеси 100% этанола и акриловой смолы (LR White) и поставить блюдо на шейкере в течение 4 ч, чтобы облегчить проникновение в клетки, прежде чем инкубации клеток в течение по крайней мере еще 4 ч в 100 % акриловой смолы (LR белый).
12. Для того, чтобы полимеризации смолы, отрезать крышку меченого 2 мл микроцентрифужных трубки с лезвием и пальто обода с ускорителя акриловой смолы. Убедитесь, что ускоритель охватывает только обод и не впадают в трубы. Впоследствии, внимательно заполните трубку примерно две трети с LR Белый смолы с помощью пипетки Пастера. Позаботьтесь, чтобы смола не войти в контакт остроумиемч ускоритель на ободе!
13. Удаления смолы, которые проникли в клетки в чашке и поместите блюдо вверх дном на вертикальной трубе стоячей микроцентрифужных таким образом, что ширина трубы почти полностью заполняет стекло, покрытое наблюдения окно тарелки.
14. Подождите 1 до 2 мин в течение ускорителя для герметизации трубки и покровное, затем инвертировать трубку таким образом, чтобы смола в трубе теперь покрывает клетки.
15. Поместите блюдо с трубкой в ​​печи при 60 ° C и вылечить его в течение 12 часов.
16. Когда блок вылечить, удалить блюдо с прилагаемой смолы заполненные трубки микроцентрифужных из духовки и отделить микроцентрифужную трубку от тарелки. Содействие разделение по циклов замораживания-оттаивания в жидком азоте и горячей воды.
17. Отменить стеклянным дном тарелку и тщательно разрезать микроцентрифужную пробирку с лезвием бритвы, чтобы удалить блок.
18. Добавьте блок с маркером.
19. Используйте лезвие в третьем блок так, чтобы ничего, кроме 1 мм ² области, которая содержит область, ранее отмеченные алмазной или вольфрама пера (или содержит область с клетками интересов) не остается.
20. Установите блок в ультрамикротоме, отделка блок с обрезки ножом и вырезать ультра-тонкие слои примерно 50 нм с использованием алмазного ножа.
21. Возьмите разделы по высокой передачи 300 сетчатых решеток. Эти сетки имеют очень маленькие бары сетки и, таким образом покрыть меньше клеток в интересующей области.
22. Пальто разделы на сетках с о 0,2-0,4 нм углерода с использованием углерода для нанесения покрытий, чтобы помочь стабилизировать их под электронным пучком ТЕА.

5. Электронная микроскопия

1. Загрузите сетки в ПЭМ, который оснащен энергетической фильтра. После настройки микроскопа и энергии фильтр в соответствии с инструкциями завода-изготовителя, проверять клетки на участках в режиме низкой кратности (нормальная передача) и сравнитеих флуоресценции данных при необходимости (полученный на стадии 4.4).
2. После того, как ядра с интересными особенностями (повреждения ДНК или ДНК трек ремонт очагов) найдено, переключатель в режим фильтрации энергии и записать толщину карту.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура включает в себя запись нулевого потерь и нефильтрованного изображения. Толщиной до 0,3 длины свободного пробега (30% электронов падающего пучка рассеивается образцом) достаточно тонким, чтобы генерировать хорошие элементарные карты.
3. Соотношение Запись карты фосфора элементов и азота с помощью программного обеспечения, который управляет энергетической фильтр микроскопа, используемого. Запишите на карте фосфора после край изображения на 175 эВ потери энергии с шириной щели 20 эВ и предкраевого изображений при 120 эВ потери энергии, а также с шириной щели 20 эВ. Для карт азота, запись после краевых изображений в 447 эВ при ширине щели 35 эВ и предкраевого изображений в 358 эВ, а также с шириной щели 35 эВ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку содержание отображаемого элементов (phosphOrus и азота) является относительно низким (прибл. 1%), выберите "Формат кадра" (качественный элементный карту) по "методу 3 окна" (количественного элементного карту) для того, чтобы генерировать изображения с более сигнала к шуму.

Обработка изображения 6.

1. Откройте элементные карты соотношение в программное обеспечение для обработки изображений, которые могут обрабатывать формат файла приобретенных изображений (например, цифровой микрофотографии). Скопируйте карту азота в красном канале и фосфора в карте зеленом канале образа RGB, то наложить и выровнять карты.
2. Экспорт составное изображение в виде файла размеченный формат файла изображения (TIFF). Откройте изображение в программное обеспечение для обработки изображений, которые могут использовать слои (например, Photoshop).
3. Настройка динамического диапазона каждого канала путем масштабирования минимальных и максимальных значений в изображении, чтобы 8-битом (от 0 до 255) данных.
4. Вычтите содержание фосфора с карты азота (используяОкно "Слои"), чтобы генерировать качественный карту, которая показывает распределение белка.
5. Преобразование карты нуклеиновой кислоты (фосфора) и белка (азота), созданный на предыдущем шаге в "индексированные цвета" и создать желтый таблицы поиска в CMYK цвета пространства для карты, показывающей распределение нуклеиновой кислоты и стол голубой подстановки показать без нуклеопротеидную карту. Цвета выбраны, чтобы генерировать максимальную контрастность между двумя элементарных карт.
6. Создайте новое изображение и импортировать карты, показывающие распределения фосфора и белка в разных слоях. Используйте "экран" режим прозрачности для того, чтобы увидеть как слои накладываются друг на друга.
7. Откройте изображение с нулевым потери, полученной на этапе 5.2. Это изображение представляет собой изображение записанной области, который выглядит как обычный ТЕМ изображение, но содержит только электроны, которые прошли через образец, не сталкиваясь с образцом. Экспортэто изображение как TIFF изображения.
8. Откройте экспортированный нулю потери изображения в графическом редакторе и скопировать его в верхнем слое изображение, показывающее элементарную карту. Совместите изображение с помощью "Экран" режим прозрачности.
9. При желании пороговое изображение нулевой потери сегмента сигнала, который происходит от miniSOG. Добавить полученное изображение как отдельный слой, как описано выше.

ESI

Сравнивая изображения УНИ ядра (рисунок 1) с обычными ТЭМ изображений (например, 7-1) показывает резкое увеличение анатомических структур, которые могут быть легко отличить. Хроматиновые хребты появляются в желтый и это довольно легко определить хромоцентров в клетках мыши. Ядрышки можно легко отличить от хроматина их круглой структуры и разного цвета, так как предварительно собранные рибосомы уже содержат большое количество белка, богатого азотом, в дополнение к РНК, которая богата фосфором. Периферический хроматин находится в виде тонкого слоя на границе ядра и ядерные поры можно рассматривать как обогащенных азотом структур, которые прерывают периферийное хроматина. Часто пластинка может рассматриваться как очень тонкого слоя внешнего голубого периферической хроматина. В цитоплазме много мелких частиц, богатых фосфором можетбыть увиденным. Они могут быть определены как рибосомы на основе их размера, численности и местоположения вне ядра. Интерхроматиновых пространство можно рассматривать как области богатой белком, расположенной между хроматина. Этот документ содержит ядерное органы и районы, богатые в малых желтых сигналов, таких как частицы рибонуклеопротеидных и кластеров рибонуклеопротеидных гранул (рисунок 2). Последние называют интерхроматиновых гранул кластеров и характерным обогащенный белков, необходимых для предварительного сплайсинга мРНК. 1В, С и D. проиллюстрировать появление других известных конструкций, такие как митотических хромосом, центросомах, митохондрии и центромеры. На рисунке 2, шаги, используемые для получения композитных цветные фотографии из сырья элементарных карт отношение суммируются. Слияние карту фосфора (зеленый) и карту азота (красный) в RGB цветового пространства (верхний ряд) позволяет лучше оценить сумм этих элементов в образце. Howeveг, вычитания сигнала фосфора истощать вклад кислотно-содержащих структур нуклеиновых с карты азота с получением карту белка (голубой) и слияния его с карты фосфора (желтый) в CYMK цветового пространства обеспечивает более четкое визуальное представление нуклеопротеина и не нуклеопротеин (нижний ряд). Это позволяет данные, которые будут более легко интерпретировать лицами, не знакомых с этой технологией.

Лазерные microirradiated клетки, экспрессирующие MDC1, 53BP1 и RAD52

Благодаря пользовательского размера, формы и расположения дорожек лазерного разрушения, область осаждения DAB в лазерных microirradiated клеток очень легко найти в ТЕА при использовании системы miniSOG. Снимки, сделанные в режиме низкой передачи увеличение (то есть, обычный светлое ПЭМ) выявить следы, характерные повреждения и может быть по сравнению с данными, который был записан с флуоресцентным микроскопом до внедрения.Это особенно полезно, если корреляционная микроскопия предназначен, так как он позволяет легко идентифицировать и переселение отдельных ядер. (Рисунок 2-4).

Первый пример (фигура 3) показывает линию клеток U2OS стабильно экспрессирующих MDC1 miniSOG-mCherry. В эксперименте лазерный microirradiation, набор из MDC1 содержащего метки miniSOG и mChrerry была очень похожа на GFP-меченый версий этого белка (данные не показаны). Крепление клеткам через 1 час после индукции повреждения ДНК и подготовки пробы для ТЕА, следы повреждения MDC1 были легко идентифицированы в ультра-тонких секций в нормальном режиме ТЕМ как темные полосы по всей ядер, которые соответствовали очень хорошо с данными флуоресценции ( Рисунок 3-5). При взгляде на распределение белка, явное увеличение сигнала азота можно было наблюдать на лазерных поврежденных участков. Он должен быть направлен сюда, что это в первую очередь вызвано полимеризованном diami nobenzidine, который богат азотом и усиливает сигнал в miniSOG помечены ремонта белок, а не только за счет накопления ремонтных белков на дорожке повреждений. Сравнение структуры хроматина в остальной части ядра со структурой в треках повреждений показывает четкое различие. Поврежденный хроматина (что показано в пунктирными линиями на рисунке 3) представляется более деконденсированных в отличие от необлученных хроматина, который происходит в толстых хребтов нуклеоплазме. В треках повреждения, также может наблюдаться ядерные тельца (200-300 нм) (выделенные стрелками на рисунке 3 П2, IIb, IIc и IIIa), которые богаты MDC1-miniSOG белка, но свободной от нуклеиновой кислоты. Это было бы очень сложно определить эти ядерные органы как хроматина без структур без этой техники. Это также предполагает, дополнительный уровень сложности для сайтов ущерб, который не предсказанных известной биохимии MDC1.

Из экспериментов с Rad52-GFP конструкций, известно, что Rad52 образуют небольшие яркие microcompartements ²⁴ вдоль дорожки повреждения лазерным полем. Из-за предела разрешения обычных световых микроскопов, было неясно, насколько большой эти структуры на самом деле и как они относятся к поврежденной ДНК. Глядя на ТЕМ изображение лазерного воздействия U2OS ядер конструктивно, выражающих Rad52-miniSOG-mCherry, размер этих органов были измерены, чтобы быть в среднем 150-250 нм (). этоеще более удивительно смотреть на эти фокусы с ESI. В отличие от предыдущих примеров, очаги Rad52-miniSOG-mCherry, кажется, быть организованы совсем по-другому по трассе повреждения и, кажется, компактные ядерные тела, как структуры, которые состоят из белка и не имеют обнаруживаемых нуклеиновых кислот в пределах своей интерьера. На основании глядя на отношения / белка нуклеиновой кислоты-в поврежденных областей, полученных с нашей объединенной miniSOG и ESI подхода, мы полагаем, что восстановление ДНК может происходить на поверхности очагов, а не в салоне.

Нижнее изображение на рисунке 5 показаны результаты, аналогичные Рисунок 3-III. Хроматина в поврежденной области, кажется, более деконденсированных по сравнению с хроматина в необлученных областях (см площадь описанной красными штрихами).

Гамма облученные клетки

В то время как лазерная микро-облучение является удобным инструментом для quicklу тестовые белки, которые содержат флуоресцентной метки для набора на сайты повреждений ДНК, это создает большие объемы сложных повреждений (разрывов двойной нити, одиночные нити, перерывов базовый урон и cyclopyrimidine димеров) ^25. Для того, чтобы изучить отсеков, которые образуют вокруг ДНК двухцепочечной перерывов более непосредственно, мы исследовали DRFs, которые образуют вокруг отдельных DSBs подвергая клетки гамма-облучения.

U2OS клетки, которые стабильно экспрессируют 53BP1-miniSOG-mCherry подвергались 2 Гр гамма-облучения и фиксированной полчаса после облучения. Характерной образец большого очагов распространены по всему нуклеоплазме можно наблюдать (рис 6Ia). После фото-окисления диаминобензидина, темные пятна развивающиеся на позициях, где флуоресцентных сигналов mCherry были расположены в флуоресценции микрофотографии можно увидеть в электронных микрофотографиях (рис 6Ib и С). Эти пятна могут быть соотнесены с ПЭМчто были приняты при малом увеличении (рис 6Id и е). В ESI образы этих очагов, которые, казалось, были около 1-1,5 мкм в диаметре, показали интересную структуру. Тонкие нити хроматина, казалось, чередовались с 53BP1 белка приблизительно удвоенной толщине.

В других экспериментах клетки подвергали воздействию большего количества радиации и фиксируется на поздних временных точках (после 3 ч и 6 ч соответственно) в целях получения большего очаги и облегчения размещения их в ультратонкие срезы (фиг.7). Поскольку мы можем отдельно карту нуклеопротеин и белок, ESI показывает, что структура очагов появляются реорганизовать в течение долгого времени. Относительное количество белка 53BP1 в центре по-видимому, возрастать, а хроматин занимает более периферическое положение.

Так 53BP1 очаги также появится в необлученных клеток, как «загадочной очагов" в G1 клеток в участках под-репликацииd ДНК ^26,27, эти очаги были отображены. Эти зашифрованные очаги, похоже, питают большое количество белка по отношению к индуцированной облучением очагов и показать интересные регулярную структуру хроматина.

Таким образом, визуализируя репарации ДНК фокусы компонентов, используя метод miniSOG помогает определить регионы повреждения ДНК и карту распределения меченых белков ремонт по отношению к хроматина.

Рисунок 1. Обзор конструкций, которые можно наблюдать в ESI изображения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

(А) ESI изображение мышиных эмбриональных фибробластов. Хроматина хребты (желтый) окружены нуклеоплазме (голубой) заполняя интерхроматиновых зртуз. Ядро окружено периферийной гетерохроматина и хромоцентров (внизу слева), которые прервали ядерных поровых комплексов (Cyan). Ядрышки могут быть четко отделены от их цвета. Это связано с тем, что количество белка по отношению к нуклеиновой кислоте выше, в структуре ядрышек, чем в хроматина. Вне ядра, митохондрии и рибосомы (богатые нуклеиновой кислоты) могут быть легко идентифицированы.

(Б) Изображение ядра и центросомы (см стрелки), который можно рассматривать как полых частиц богатых белком в левом верхнем углу изображения.

Раздел (С) Крест через метафазы пластины. В очень сжатом метафазных хромосом присоединились к диску, который охватывает от верхнего левого угла в нижний левый угол. Высокие концентрации азота видны на поверхности некоторых хромосом. Эти районы являются кинетохоры (см стрелки).

D: Части митохондрий (см верхние стрелки) в цитоплазме, окруженных рибосомами (небольшие желтые пятна - см ниже, стрелки). Внутренняя мембрана митохондрий с его типичными инвагинации (крист) видна.

Рисунок 2. Создание многоцветной ESI картинке

(Верхний ряд) Первые две фотографии в строке показывают соотношение карт фосфора и азота. Последняя картина в верхнем ряду показаны эти элементарные карты накладываются в цветовом пространстве RGB. Желтые структуры представляют нуклеопротеидов, что свидетельствует о наличии двух фосфора и азота.

(Нижний ряд) Первое изображение показывает карту фосфор, которые в первую очередь выявляет распределение нуклеиновой кислоты в образце. Средний рисунок показывает распределение нуклеиновых кислот обедненного / отрицательного STRU ать задание буквально. Было рассчитано, вычитая карту фосфора с карты азота. Нижняя правая картинка показывает слияние карте нуклеиновых кислот и белков карте в субтрактивного цветового пространства. Этот цвет композитного должны быть использованы для оказания помощи в идентификации отдельных структур и классифицировать их как нуклеопротеина или не нуклеопротеин. Количественный информация о фосфора и азота изобилии должны быть собраны визуально из чистой фосфора и азота в оттенках серого чистая карты или из композитов, полученных с помощью присадок цвета, такие как в верхнем ряду.

Рисунок 3. Лазерная микро облучение клеток U2OS стабильно экспрессирующих MDC1-miniSOG-mCherry. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

(II) площадь, подсвечивается зеленым квадратом в Ic был увеличен и показано в нормальном режиме передачи (IIa) и ESI (IIb). IIc показывает наложение на изображение ESI с сигналом трека повреждений. Сигнал повреждения трек был получен пороговой верхнюю изображение.

(III), примеры структуры лазерного микрооблученных хроматина и хроматина за пределами области лазерной повреждены.

Рисунок 4. Лазерная микро облучение клеток, стабильно экспрессирующих 53BP1-miniSOG-mCherry. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Левый столбец: (А) флуоресценции, (б) условная ТЕА и (С) ESI изображение того же лазера микро облученных ядро.

Правая колонка: (D) Обычные ТЕМ, (Е) ESI и (F) Наложение изображения ESI с сигналом, который был miniSOG Географическая порога из (D) (см шаг 6.10)

Рисунок 5. U2OS клеточной линии, стабильно экспрессирующие Rad52-miniSOG-mCherry и поврежденные лазерной микро-облучения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

(А) Наложение флуоресценции изображение с низким увеличением ПЭМ изображение, показывающее лазер microirradiated U2OS ядро с ущербом трассе в левом нижнем углу.

(B), представитель флуоресценции конфокальной микроскопии изображение лазерного микро облучении Hoechst-окрашенных ядро (синий), выражающее Rad52-miniSOG-mCherry показывая характерный рисунок из небольших очагов вдоль повреждения дорожки (красный сигнал).

(С) Обычные ТЕМ, (D) ESI, (Е) на карте фосфора (Р) и ESI сегментированный сигнал от (С) Высокая увеличении ядра, показанного в верхнем левом углу.

(G) ESI изображение другого U2OS ядра, стабильно экспрессирующих Rad52-miniSOG-mCherry показывающий лазерного повреждения дорожки в контексте всей ядра.

Рисунок 6. U2OS клетки, стабильно экспрессирующие 53BP1-miniSOG-mCherry облучают 2 Гр и фиксированной после 30 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

(I), а) флуоресценции изображение, показывающее гамма облучения индуцированный 53BP1 очаги. б) в проходящем свете изображение после фотополимеризации. в) Overlay флуоресценции с проходящем свете изображения. г) Низкая увеличением ПЭМ-изображение (черная полоса является ТЕМ сетки бар). е) Наложение флуоресцентного изображения с низким увеличением ПЭМ изображение.

(II), повреждения внимание помечены звездочкой в проходящем свете изображения, записанного в нормальном ТЕА и в режиме ESI. а) нулевой потери, б) ESI, в) Фосфор, г) белка Е) Наложение ESI и сегментированный сигнал с изображения нулевых потерь.

(III), повреждения внимание помечены крестом в флуоресцентного изображения, записанного в нормальном ТЕА и в режиме ESI. а) нулевой потери, б) ESI, в) Фосфор, г) белка Е) Наложение ESI и сегментированный сигнал с изображения нулевых потерь.

Рисунок 7. Изменения в структуре очагов между фокусами после различных времен облучения. < / STRONG> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

U2OS 53BP1 miniSOG mCherry клетки подвергаются 6 Гр фиксированной после 3 часов (1A-E, FJ) и 6 часов (2A-E, FJ) соответственно гамма-облучения. 3 показан необлученному U2OS 53BP1 miniSOG mCherry ядро, показывая загадочный фокус (AE). ESI изображения представлены в порядке ESI (нуклеиновых кислот и белков), нуклеиновых кислот (одна), белок (одна), ЭРИ (нуклеиновых кислот и белков) + сегментирован сигнал miniSOG.

Рисунок 8. репарации ДНК очаги до сих пор видны в обычном режиме передачи, когда после фиксации осмия опускается. arge.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Ультратонкие секция (50 нм) из U2OS ядра показаны два 53BP1 очаги из образца, который не обрабатывали тетроксидом осми. (А) В обычном режиме ТЕМ, можно увидеть сайты окрашивали полимера DAB даже без повышения контрастности с тяжелых металлов пятно. (B) контрастность очагов может быть расширена путем принятия изображения нулевой потери (фильтрация от всех электронов, происхождение от множественных актов рассеяния).

Рисунок 9. Определение оптимальных настроек окна энергии для отображения фосфора

(А) Elemental соотношение карту, записанную для фосфора с последующей края на 155 эВ и предварительной края на 120 эВ.

(С) Расчет карты фосфор от постоянного окна предкраевого при 120 эВ потери энергии и переменной окна после кромки в пределах от 140-200eV потери энергии для того, чтобы определить комбинацию, которая лучше всего в отличие. Разница Интенсивность из самых ярких и dimmestpixel в линии сканирования, охватывающей более же фосфора богатых и бедных фосфором региона показывает высокие значения контрастности (динамический диапазон), когда после край картина 175 эВ потери энергии был выбран.

ESI может служить отличным инструментом для изучения различных состояний хроматина и рибонуклеопротеинов в ядре, потому что он способен специфически карту области, которые богаты фосфором. Это глубоко увеличивает количество деталей, которые могут быть получены с помощью электронного микроскопа и не зависит от неспецифических методов контрастными. Одним из недостатков ESI, что это требует более тонких секций, чем обычные ПЭМ в то же ускоряющего напряжения. Эту проблему можно решить путем работы с серийных срезов или с использованием методов, томографических ^28.

Хотя много информации можно получить, глядя на распределений фосфора и азота, представляет интерес, чтобы иметь возможность также карты распределения определенных белков. С помощью метода приведены в данном документе, было показано, что ESI могут быть объединены с методами, основанными на сайт-специфического полимеризации диаминобензидино. Хотя этот метод не добавляет фуLL новый цвет для ESI, это, безусловно, полезна для картирования распределения белка. Это относится, в частности, белков, которые взаимодействуют с хроматином. Если исследование необходимо визуализировать более одного белка население, методы, использующие маркировки immunogold еще можно использовать, когда применяется в качестве предварительно встраивания окрашивания, до фотоокислению ^9. По сравнению с стабильных клеточных линий, временной трансфекции имеют тот недостаток, что уровни экспрессии могут значительно различаться между клетками и, следовательно, сделать его трудно найти несколько клеток, экспрессирующих одинаковое количество белка меченых. Таким образом, создание стабильных клеточных линий рекомендуется. Тем не менее, можно судить относительное количество белка с использованием выражения флуоресценции и отобрать клетки с промежуточным выражения следующие временной трансфекции.

Хотя слияние тег miniSOG является флуоресцентный себя, его квантовый выход значительно хуже, чем GFP (0,37 против 0,6) ^10. Для Purpоперационную среду из корреляционного микроскопии, добавление дополнительного флуоресцентной метки белков, как mCherry позволяет изображений в живых клетках без производства синглетного кислорода, который происходит при возбуждении miniSOG. Уровень экспрессии miniSOG-меченых белков, количество кислорода в DAB-содержащий буфер и рН также может влиять на скорость фотоокисления. Иногда это может быть весьма проблематично достичь гомогенного фотоокисление в области, представляющей интерес, из-за света зависимости реакции фотоокисления. Продолжительное фотоокисление может привести к неспецифической окрашивания и осаждения слишком много тяжелого металла в пробе, которые могут осложнить обнаружение сигналов, специфичной для элемента с ESI. Процесс фотоокисление довольно много времени, так что, как правило, лишь очень небольшое область, содержащая несколько клеток на покровное обычно окрашенных.

Мы показали, сочетание miniSOG тегами белки с ESI с использованием монослоя приверженец хуЧеловек линию клеток рака. В принципе, этот способ также может быть применен к любой другой образец (дрожжевой бактерии, ткани, эмбрион), пока можно выразить miniSOG-меченый белок на приемлемом уровне и до тех пор полупрозрачности и диффузию кислорода и DAB это достаточно высокой, чтобы обеспечить правильную фотоокисление и, таким образом, гомогенный окрашивание. Для клеток суспензии, было бы выгодно, чтобы исправить положение клеток на покровное стекло с помощью клея, такие как поли-L-лизина. Для более толстых образцов, цели с более низкой числовой апертурой будет добиться более равномерная освещенность, но занимает больше времени, чтобы фото-окисляются.

Мы представили использование белков miniSOG-тегами синтеза как можно ближе к оригинальной протокола, опубликованного Шу и др ^10, как это возможно -. В том числе с использованием осмия. Там можно было наблюдать, что, помимо преимущественно сдачи на DAB-полимеров и мембран, осмий осмия показывает некоторые реактивность иосаждение на большей части биологического материала в образце ⁽¹⁰ рисунок 3). Осмий осмия имеет элементарного край на 45 эВ. Этот сигнал и его плазмонов могут быть наложены на потери энергетический спектр электронов в толщине образца увеличивается и одиночных электронов пройти несколько событий потери энергии при прохождении через образец. Это может ограничить качество фосфора элементарных карт, если высокие концентрации OsO ₄ используются в пробоподготовки. Концентрации, которые мы использовали здесь, которые значительно ниже, чем то, что был использован ранее, разрешено ¹⁰ генерации хороших карт качество фосфора. В эксперименте с использованием miniSOG тегами белки, которые требует более высоких концентраций OsO _4, наилучшая концентрация, которая все еще ​​позволяет хорошее фосфора создание карту придется определяться опытным путем.

Мы обнаружили, что полимер DAB, который образует в репарации ДНК фокусов sufficiently плотной, чтобы увидеть в обычном режиме ПЭМ (или в режиме нулевых потерь даже с лучшей контрастностью), даже когда после фиксации осмия опущен (рисунок 8). Сегментация сигналов, которые были записаны таким образом был так надежен, как с помощью образцов, которые были обработаны с осмия. В зависимости от ядерного белка, который должен быть визуализирован, размер структур образует и необходимость визуализировать мембранных систем, использование осмия может не быть необходимым и ее отсутствие приведет к удалению потенциал маскировки элементный подпись фосфора.

По сравнению с другими публикаций с использованием ESI ^18,29,30 мы использовали разные настройки для пред- и пост-края фотографии для того, чтобы генерировать элементарные карты соотношении с наименьшим количеством шума. Мы эмпирически определены параметры, представленные в рукописи (см рисунок 9). Выбранные настройки по краям должно привести к коррекции Eleментальные карты, если окна сбора перекрываются с другими элементами, которые присутствуют в образце. В нашем случае, серы может быть такой элемент. Поскольку концентрация серы (которое происходит в метионин аминокислот и цистеина) является очень низкой, и вносит свой вклад в расчетной карты только в незначительной количества, мы считаем, что лучшее соотношение сигнал / шум, что полученный с использованием параметров, используемые здесь, перевешивает недостатки которые могут возникнуть от следов серы в образце.

Мы показали, ультраструктуры DRFs на нанометровых резолюций с использованием ДНК белки ремонт MDC1, 53BP1 и RAD52 в сочетании с ESI и ТЕА методов. Организация хроматина и локализации индивидуального ремонт белка DSB была решена с помощью этого подхода. Их локализация в областях, богатых повреждений ДНК после лазерного облучения микро-ДНК и тенденцию к ремонту белков заполнить пространство между гребнями хроматина было показано. В случае Rad52, который плаYS роль в гомологичной рекомбинации, формирование ядерного тела, как сферических структур вдоль лазерного поврежденной дорожке можно было наблюдать, и это было в отличие от двух других протестированных белков. Когда ущерб наносится с помощью гамма-облучения, 53BP1 формируется очаги вокруг поврежденного хроматина. Относительный состав и положение хроматина и белков в очагах, кажется, изменяется с течением времени. Отношения между этими белками и поврежденных хроматина, а также изменения в организации хроматина и состав ядерного органов могут быть все легко получается с использованием метода ESI в то время как обычный светлого микроскопии с использованием урана и свинца, контрастные агенты не могут непосредственно оценить эти свойства. Таким образом, этот метод показывает высокий потенциал для изучения структурно-функциональных отношений, в частности, для процессов, действующих на ДНК.

The authors have nothing to disclose.

We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.