Альтернативные Культуры для человека плюрипотентных стволовых клеток производство, техобслуживание, и генетический анализ

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Емкость hPSCs дифференцировать к мультилинейной взрослых тканей открывает новые возможности для лечения пациентов, страдающих от тяжелых заболеваний, которые связаны с сердечно-сосудистой, печени, поджелудочной железы, и неврологические системы ^1-4. Различные типы клеток, полученные из hPSCs также обеспечит надежные сотовые платформы для моделирования заболевания, генной инженерии, скрининга лекарственных средств и токсикологические испытания ^1,4. Ключевой вопрос, который обеспечивает их будущие клинические и фармакологические приложений является генерация большого числа клинико-класса hPSCs через в пробирке культуре клеток. Тем не менее, в настоящее время системы культуры либо недостаточны, либо по своей сути переменная, с участием различных фидерных и фидерных без культуры hPSCs как колоний ^5,6.

Рост колоний тип hPSCs акций многие структурные особенности внутренней клеточной массы (ICM) ранних эмбрионов млекопитающих. ICM склонна к дифференцировке в трех зародышевых слоевв многоклеточного среды из-за существования гетерогенных градиентов сигнализации. Таким образом, приобретение неоднородности в начале эмбрионального развития рассматривается как необходимого процесса дифференциации, но нежелательный особенностью HPSC культуры. Неоднородность в HPSC культуры часто бывают вызваны чрезмерным апоптотических сигналов и спонтанной дифференцировки из-за неоптимальных условий роста. Таким образом, в колонии типа культуры, гетерогенные клетки часто наблюдаются на периферии колоний ^7,8. Было также показано, что клетки человеческого эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) колонии экспонат дифференциальные ответы на сигнальные молекулы, такие как BMP-4 ^9. Более того, методы колония культуры производят низкие урожаи клеток, а также темпы восстановления очень низкая клеток от криоконсервации из-за неконтролируемых темпов роста и апоптоза сигнальных путей ^6,9. В последние годы в различных суспензионных культур были разработаны для культивирования hPSCs, particulарли для расширения больших количеств hPSCs в фидерной и матричных без условий ^6,10-13. Очевидно, разные системы культуры имеют свои преимущества и недостатки. В общем, гетерогенный характер hPSCs представляет собой один из основных недостатков в колонии типа и агрегированный культуры методов, которые субоптимальным для доставки ДНК и РНК материалов в hPSCs для генной инженерии ^6.

Очевидно, что существует настоятельная необходимость в разработке новых систем, которые обойти некоторые недостатки существующих методов культивирования. Открытия низкомолекулярные ингибиторы (например, ROCK ингибитор Y-27632 и JAK ингибитора 1), которые улучшают выживаемость одноклеточные проложить путь к диссоциирован-HPSC культуры ^14,15. С использованием этих малых молекул, мы недавно разработали метод культуры, основанной на не-колонии типа (NCM) рост диссоциированных-hPSCs ^9. Этот новый метод культура сочетает в себе пассирование одноклеточные и высокой плотностиПокрытие методы, что позволяет нам производить большое количество однородных hPSCs под последовательных циклов роста без серьезных хромосомных аномалий ^9. Кроме того, NCM культура может быть реализована с различными малых молекул и определенных матриц (например, ламининами), чтобы оптимизировать способ культивирования для широкого применения. Здесь мы представляем несколько подробных протоколов на основе NCM культуры и разграничить подробные процедуры для генной инженерии. Чтобы продемонстрировать универсальность протоколов NCM, мы также протестировали NCM культуру с разнообразными ингибиторов ROCK и с одной ламинином изоформы 521 (то есть, LN-521).

Одноклеточный основе не-колония Тип монослой (NCM) культура hPSCs.

1. Подготовка

1. Сделать 500 мл среды для культуры мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs): DMEM среде, содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина и 0,1 мМ заменимых аминокислот (NEAA).
2. Изолировать мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) клетки, полученные из штамма CF1 после обычного протокола ¹⁶ и культуры MEFs на 0,1% желатин покрытием клеточной культуральной пластины 6-луночный в DMEM среде. Кроме того, приобрести акции MEF при прохождении 3 из коммерческих ресурсов.
3. Подготовка Матригель пластины.
   1. Развести 5 мл чЭСК квалифицированных Матригель складе с 5 мл среды DMEM/F12 (охлажденный при ~ 4 ° С) и хранить в виде 50% в аликвотах -20 ° C морозильник. Разморозить замороженный Matrigel запас в холодильнике (~ 4 ° С) O / N и далее разбавить Матригель в холодной среде DMEM/F12 (рождать рабочей концентрации 2,5%).
   Пальто 6-луночные планшеты для культивирования клеток с 1,5 мл 2,5% Матригель на лунку, хранить покрытых пластин в холодильник O / N (Примечание: используйте пластину на Матригель покрытием в течение 2 недель).
   2. Снимите Matrigel тарелку из холодильника, дайте пластины, чтобы нагреть при комнатной температуре в капот культуре клеток для 10 до 30 мин (Примечание: не согреть пластину в инкубаторе для клеточных культур) и аспирации DMEM среде перед покрытием hPSCs.
4. Сделать 500 мл чЭСК среды: 80% среде DMEM/F12, 20% КСР, 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, и 4 нг / мл FGF-2.
5. Подготовка 10 мл 2X HPSC морозильной среды: 60% FBS, 20% DMSO, 20 мкМ и Y-27632 в mTeSR1 среды, стерилизуют фильтрацией и используют среду в течение 1 недели.

. 2 Протокол 1 (Начальный): Расти HPSC колонии на Кормушки

1. Используйте MEF номера проход с 5 или 6 (обозначен p5 и p6) для HPSC культуры для того, чтобы получить последовательную РЕЗУЛЬТАТОВц. Митотически инактивировать MEFs обработкой клеток с 10 мкг / мл митомицина С в течение 3 часов при 37 ° С, промыть клетки 3x с 1X Дульбекко забуференном фосфатом физиологическом растворе (D-PBS), а затем отделить MEFs с 0,05% трипсина в 0,53 мМ EDTA. С другой стороны, облучать MEFs в дозе 8000 рад с рентгеновской излучателем.
2. Количество чисел клеток с помощью метода Трипановый синевы исключения под микроскопом. Кроме того, использование автоматического счетчика клеток.
3. Пластинчатые облученные MEFs на полистироловых планшетах 6-луночные покрытые с 0,1% желатина при плотности 1,88 × 10 ⁵ клеток на лунку (т.е. 1,96 × 10 ⁴ клеток / см ^2). Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 24 часов.
4. Снимите MEF культуральной среды путем аспирации с помощью пипетки Пастера (Примечание: никаких шагов мытья необходимые в это время).
5. Triturate HPSC колонии от предыдущей культуры в небольшие пряди, изучить глыбы под микроскопом, чтобы обеспечить их размеры, начиная фром 50 до 100 мкм в диаметрах, и пластины HPSC глыбы на верхней части MEF фидерных слоев в один хорошо, содержащих 2 мл HPSC среды.
6. Изменение чЭСК среднего ежедневно в течение 3 до 5 дней, роста колоний записи на фотографии и не отмечают никаких морфологически измененных или дифференцированные колонии (~ 5%), так и вручную удалить отмеченные колонии, осторожно стремление с помощью пипетки Пастера.
7. Промойте оставшиеся колонии на MEFs два раза (2 мин каждый с D-PBS), и инкубировать колонии с 2 мл 1 мг / мл коллагеназы IV в HPSC среды для 10 до 30 мин), и изучить отряд HPSC колоний от поверхность MEF покрытием (Примечание: используйте скребок, чтобы помочь отряд процесс, только если колонии плотно прикреплена к пластине).
8. Добавить 5 мл HPSC среды в каждую лунку, чтобы минимизировать ферментативных реакций, колонии перевода к 15 мл трубки, позволяют HPSC колонии для осаждения для 3 до 5 минут при комнатной температуре, а также обеспечить осаждение колоний прямой визуализации слоктей в нижней части трубки (примечание: не центрифуге трубки на этом этапе).
9. Удалить надосадочную жидкость, содержащую остаточные MEFs и диссоциированных отдельные клетки, ресуспендируйте колонии 5 мл чЭСК среды, и повторите шаг оседания дважды.
10. Удалить среды, растирают колонии HPSC на мелкие сгустки, магазин в 1X HPSC замерзания среды (или CryoStore CS10 замерзания среды) для криоконсервации (1 сливная хорошо за замороженной флакона) или пластины на 6-луночный планшет для сотового пассажей.

3 Протокол 2:. Преобразование HPSC колонии от Кормушки для NCM

1. Промыть HPSC гранул в D-PBS один раз, инкубировать гранул с 1 мл 1X Accutase в течение 10 мин, и изучить ферментативную реакцию под микроскопом, чтобы обеспечить одно-клеточной диссоциации.
2. Прекратить ферментативных реакций, осторожно ресуспендирования клеток в 5 мл mTeSR1 среде, содержащей 10 мкМ Y-27632 с последующим центрифугированием при 200 х г при комнатной температуре в течение 5 мин(Примечание, не используйте слишком центрифугирования силы, которые вызывают повреждения клеток).
3. Добавить 5 мл mTeSR1 среды к осадку, ресуспендируют осадок в виде отдельных клеток, и фильтр в отрыве клеток через клеточный фильтр (для удаления любых остаточных агрегаты клеток) 40 мкм.
4. Семенной 1.3-2 х 10 ⁶ hPSCs в одну лунку (1,4-2,1 х 10 ⁵ клеток / см ²⁾ 6-луночный планшет, покрытый 2,5% чЭСК квалифицированных Матригель, добавить mTeSR1 среды до 2,5 мл, и включают в себя 10 мкм Y-27632 в среде (для облегчения начального 24 часами покрытие с одной ячейкой). Кроме того, использовать следующие малые молекулы, чтобы заменить 10 мкм Y-27632 для повышения обшивки одноклеточных: 1 мкм Y-39983 (РОК я ингибитора), 1 мкМ phenylbenzodioxane (ингибитор ROCK II), 1 мкМ thiazovivin (новый ингибитор ROCK) , и ЯК ингибитор 2 мкМ 1.
5. Замените среду с без наркотиков mTeSR1 среды на следующий день (в течение 24 часов), отделить клетки от одного дополнительногону, и считать количество клеток для определения эффективности посева с одной ячейкой (Примечание: примерно, от 50 до 90% от одноклеточного эффективности нанесения покрытия, что может быть достигнуто на данном этапе).
6. Разрешить клетки расти как одноклеточные сформированный монослой в течение нескольких дней с 3 мл mTeSR1 среды. Изменение средней ежедневно.
7. Эмпирически определить график пассажей, выполненный с NCM в зависимости от плотности клеток. Прохождение когда рост клеток достигает слияния в день 3 или 4 дня, или в момент времени 4 часа после исчезновения клетки к клетке границ. Диссоциируют клеток в 1 мл Accutase, использовать от 1 до 3 соотношение расщепления (т.е. 1 Конфлюэнтные хорошо клеток высевали в 3 лунки 6-луночный планшет) для клеток пассажей, и стабилизировать адаптированный NCM на 5 проходов.
8. Сотовый замерзания
   1. Используйте один сливающийся хорошо (~ 5-6 x10 ⁶ клеток) в течение одного замороженного флаконе: отделить клетки от одной сливной хорошо с 1 мл Accutase в течение 10 мин.
   2. Развести жIth 5 мл mTeSR1 средних и центрифуги клеток, как описано выше.
   3. Ресуспендируют осадок в 500 мкл среды mTeSR1, а затем медленно добавить 500 мкл 2X HPSC морозильной среде (содержащей 20 мкм Y-27632) в криоконсервации флаконе. Кроме того, ресуспендирования клеток в 1X HPSC морозильной среде, содержащей 2 мкМ ингибитор JAK 1 или 1x CryoStor CS10 среды в присутствии либо 10 мкМ Y-27632 или 2 мкМ ингибитор JAK 1.
   4. Поместите замороженные флаконы в охлажденного льдом Криорезервуар (снизу заполнены isopranol) и немедленно передать Криорезервуар к -80 ° C морозильник.
   5. Передача клетки из -80 ° C морозильник в баке жидкого азота (на следующий день) для долгосрочного криоконсервации.
9. Сотовый оттаивания
   1. Используйте один криоконсервации флакон для посева 1 колодец 6-луночный планшет.
   2. Предварительно тепло mTeSR1 среда в ванну с водой 37 ° C в течение 10 мин оттаивания клеток в той же водяной бане в течение 2 мин,каплям добавляют клетки в 5 мл подогретого mTeSR1 среде, содержащей 10 мкМ Y-27632, и центрифуга как описано выше.
   3. Аккуратно ресуспендирования осадка клеток с 2 мл mTeSR1 среде, содержащей 10 мкМ Y-27632 и медленно передавать клетки хорошо предварительно покрывают Матригель (Примечание: избежать получения пузырьков воздуха).
   4. Изменение средней ежедневно и ожидаем, что рост HPSC достичь слияния в день 3 или 4.

4 Протокол 3:. Преобразование HPSC колонии на Матригель к NCM культуры

1. Удалить пластину с Матригель покрытием из холодильника, поместите пластину в капот культуры ткани от 10 до 30 мин, удалить среды из каждой лунки пластины, и добавить 2 мл подогретого mTeSR1 среды в каждую лунку.
2. Передача растирают HPSC комки из питателя культуры (этап 2.10 базового протокола) к вышеуказанному Matrigel пластины. Добавить mTeSR1 среды до 2,5 мл конечного объема в каждую лунку.
3. Изменение средней в день в течение 3 до 4 дняс до колоний достичь от 80 до 90% слияния.
4. Для клеток пассажей: промыть колонии с D-PBS в два раза, лечить клетки с 1 мл 2 мг / мл диспаза при 37 ° С в течение от 15 до 20 мин, и донного осадка и прохождение клетки как сгустки.
5. Для NCM культуры: повторите шаги 3,1 до 3,9 описано в Протоколе 2.

5 Протокол 4:. NCM Культура hPSCs на LN-521

1. Разморозить рекомбинантный LN-521 раствор при 4 ° С до дня применения и сделать раствор ламинин покрытия (ЖК) путем разбавления талой ламинин с 1X D-PBS (содержащий Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +)} в конечной концентрации 10 мкг / мл.
2. Добавьте 1 мл ЛСК в одной скважины в 6-луночный планшет (примечание: избежать сухого во время процесса нанесения покрытия).
3. Закройте покрытием тарелку с парафильмом для предотвращения испарения и хранить пластинку в холодильнике (4 ° С) O / N (примечание: использовать пластину в течение 1 недели).
4. Аккуратно удалите LCS с пипетки Пастера без чтобыuching поверхность, покрытую и добавить 2 мл mTeSR1 среде одной яме.
5. Теплый все культуры растворы (в том числе D-PBS) в ванну с водой 37 ° C в течение 25 мин.
6. Преобразование HPSC колонии в NCM
   1. Диссоциируют клеточных агрегатов в одиночных камерах с Accutase, как описано в Протоколе 2.
   2. Семенной 1.3-2 х 10 ⁶ hPSCs в один LN-521-лунке (1,4-2,1 х 10 ⁵ клеток / см ^2), не присутствии ингибиторов ROCK.
   3. Изменение средней в день в течение 3-х до 4 дней.
   4. Диссоциации клеток в 1 мл Accutase в день 3 или 4 для следующего пассирования клеток с соотношением сторон 1 до 3 расщепления.

. 6 Протокол 5: NCM Культура для плазмиды ДНК трансфекции

1. Адаптация HPSC колонии NCM культуры, как описано в Протоколах 2 до 4.
2. Тарелка диссоциирован hPSCs в 12-луночный планшет с клеточной плотности 7,5 х 10 ⁵ клеток / лунку в mTeSR1 среде в присутствии 10 мкМ Y-27632.
3. Заменить mTeSR1 среду с без наркотиков mTeSR1 среды между 4-8 ч после посева клеток.
4. Для каждой трансфекции, развести 2,5 мкг плазмид экспрессии (например, pmaxGFP) и 5 мкл Lipofectamine 2000 в отдельных пробирки Эппендорф в 125 мкл каждого из Opti-MEM Снижение сыворотки Средний.
5. Через 5 мин, смешать разбавленных реагентов и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре (для формирования трансфекции комплексов).
6. Добавьте 250 мкл трансфекции комплексов в каждую лунку, содержащую hPSCs в 1 мл mTeSR1 среды и инкубируют клетки при 37 ° С в СО _{2-инкубаторе} в течение 24 часов.
7. Изучите эффективность трансфекции под флуоресцентным микроскопом и фотографии случайно для расчета фактической эффективности трансфекции.

. 7 Протокол 6: NCM Культура для трансфекции микроРНК

1. Диссоциируют полуконфлюентного hPSCs на 2-й день в условиях NCM добавлением 1 мл Accutase на лунку в 6 Лунками.
2. Добавьте 10 мл mTeSR1 среды, чтобы разбавить ферментативных реакций и центрифуги при 200 х г в течение 5 мин.
3. Ресуспендируют клеточный осадок с mTeSR1 среды, семян клетки при плотности 7,5 х 10 ⁵ клеток на лунку в 12-луночный планшет в mTeSR1 среде, содержащей 10 мкм Y-27632, и пусть клетки приложить в течение 4 часов.
4. Замените среду с Y27632 без mTeSR1 среды.
5. Используйте имеющийся в продаже микроРНК (например, не-таргетинга miRIDIAN микроРНК трансфекции управления меченного Dy547). Titrate концентрациях от 0-160 нМ, используя предоставленные реагенты и следуйте инструкциям производителя.
6. Оптимизация эффективность трансфекции для каждой концентрации в HPSC линий на визуализации флуоресценции Dy547 живых клеток под микроскопом через 24 часа после трансфекции.
7. Вычислить эффективности трансфекции на основе процента положительных клеток Dy547 над всеми отображаемого клеток.

1. Повторите шаги 7,1 до 7,4 Протокола 6.
2. Рассчитайте количество вирусных частиц, которые будут использоваться для трансдукции: Используйте следующую формулу: ТУ = (МВД х CN) / VT, а ТУ обозначает общее количество преобразования единиц, МВД равна заданной множественности заражения в скважине (МВД или ТУ / элемент), CN определяет количество клеток в каждой лунке, и VT указывает на акции вирусные титры (ТУ / мл). Например, учитывая, что фондовые вирусные титры для SMART-shRNA вектора равна 1 х 10 ⁹ ТУ / мл (трансформирующие единиц на мл), 7,5 х 10 ⁵ клеток на лунку в момент трансдукции и ожидаемый МВД от 20: использовать 15 мкл из вирусных частиц фондовых для каждой скважины (обратите внимание: это условие рекомендуется для переходного индукции лентивирусным).
3. Предварительно теплые 300 мкл mTeSR1 среде с 10 мг / мл полибрена течение 30 мин.
4. Добавить 15 мкл фондовых вирусных частиц вподогретого mTeSR1 среду, содержащую полибрен и аккуратно перемешать раствор.
5. Заменить клеточную культуральную среду 300 мкл предварительно нагретой среде, содержащей вирусные частицы.
6. После 4 часов инкубации, изучить TurboGFP флуоресценции (производитель для выражения shRNA), чтобы определить эффективность трансдукции.
7. Добавить 300 мкл дополнительной mTeSR1 среды в преобразовательного хорошо, когда клетки начинают выражать TurboGFP.
8. После 12-16 часов инкубирования пересмотреть выражение турбо-GFP.
9. Выполните необходимые эксперименты последующие с этих трансдуцированных клеток в течение 72 часов.

Общая схема NCM культуры

Рисунок 1 представляет собой типичный NCM культуры схему, показывающую динамических изменений hPSCs после высокой плотности посева одноклеточных в присутствии ингибитора ROCK Y-27632. Эти морфологические изменения включают межклеточные связи после посева, образование сотовой кластеров, и экспоненциальный рост клеток с последующей конденсацией клеток (рис. 1А). Представитель эксперимент показывает, WA01 (H1) ЭСК, высевали в виде отдельных клеток при плотности 1,9 × 10 ⁵ клеток / см ² в присутствии 10 мкМ Y-27632 на 1 день (фиг. 1B, левая панель), далее распространяется без формирование колоний (фиг. 1B, средняя панель) в день 2, и конденсируется в виде однородного монослоя, который подходит для требующихся экспериментов или для пассирования клеток на 3-й день (фиг. 1B, правая панель).

<сильные> Различные ингибиторы ROCK поддерживает NCM культуры

Тарелка анализ 96-а был использован для доказательства правильности концепции высокопроизводительного скрининга наркотиков. Было также предназначен для оптимизации использования различных ингибиторов ROCK для поддержки NCM культуру. Приблизительно 31000 диссоциируют SCU-I10 клетки, плюрипотентных клеток человека индуцированной (hiPSCs) ^17, высевали на один Матригель покрытием хорошо в присутствии различных концентраций ингибиторов ROCK. Через 24 ч клетки подвергали основе анализа выживания CCK-8, чтобы определить, выживаемость клеток в этих условиях. Ранее нами было показано, что метод NCM требует использования скале ингибитора, Y-27632, на 10 мкм до повышения одноклеточные покрытие. В этом докладе, мы подтвердили, что 10 мкМ Y-27632 значительно увеличить с 24 часами одноклеточные обшивки эффективность hiPSCs (P <0,05) (рис. 2). Мы также обнаружили, что Y-39983 (РОК я ингибитора), phenylbenzodioxane (РОК II ингибиторытор), и thiazovivin (новый ингибитор ROCK) значительно модулировать эффективность одноклеточные обшивки и способствовать росту NCM на 1 мкМ по сравнению с их контрольной группы (р <0,05) (рис. 2). Кроме того, последствия трех ингибиторов ROCK (на 1 мкм) на эффективность одноклеточных покрытия были сопоставимы с Y-27632 на 10 мкм (р> 0,05) (рис. 2). Следует отметить, что ROCK I ингибитора (при 5 мкМ) по-видимому, показывают, выраженный цитотоксичность по сравнению с препаратом в 1 мкМ (p <0,05), вовлекая более чем специфическое взаимодействие других молекул. Таким образом, различные ингибиторы ROCK могут быть использованы для поддержки NCM культуры в будущем. Тем не менее, полная характеристика обоих ЭСК и hiPSCs под NCM с этими новыми ингибиторов будут необходимы для использования в будущем.

LN-521 поддерживает NCM культуру без использования ингибиторов ROCK

Для определения тон роль конкретного ламинином изоформы в поддержке роста чЭСК, мы культивировали СКУ-I30 hiPSCs на LN-521-покрытием пластин в ксено-среде без TeSR2. Интересно, что в одиночку LN-521, без присутствия ингибиторов ROCK, поддерживает покрытие одноклеточные и последующий рост NCM для 15 пассажей при этом условии (рис. 3). Иммуноокрашивание СКУ-i30 клеток с поликлональных антител анти-NANOG показали, что клетки при этом условии было высокое выражение Nanog в ядрах (рис. 3А). Анализ Цитометрический показали, что профиль экспрессии чЭСК маркер был похож на клетках, выращенных как NCM помощью ROCK ингибитор Y-27632 (рис. 3б).

Высокая эффективность доставки микроРНК без использования лентивирусных частиц

Трансфекцию с Dy547-меченых олигонуклеотидных микроРНК проводилось в WA01 (H1) клеток в условиях NCM. WA01 ЭСК были выращены как NCM на 2,5% Матригель в mTeSR1 для 2 (фиг.4А) и 18 (фиг. 4В) каналов соответственно. Эти клетки показали высокую эффективность трансфекции с 24 часами после трансфекции (фиг.4А и 4В). Как правило, мы можем получить трансфекции КПД до 91% в ЭСК в 24 часа после трансфекции.

Рисунок 1. (А) Схема NCM культуры. На линейном графике очерчивает динамические изменения многоклеточного ассоциации в типичной 3-дневного культуры в условиях NCM. (В) фазовые изображения представитель WA01 (H1) ЭСК, распространяющихся под условием NCM на 2,5% Матригель в mTeSR1 среды в течение 16 пассажей (обозначается как WA01, mcp16). Нижняя панель является увеличенный вид верхней панели. Масштабные полоски показывают 100 мкм.EF = "https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Анализы выживаемости Одноклеточные с использованием формата 96-луночного. Приблизительно 31000 SCU-i10 hiPSCs ¹⁷ высевали на 2,5% Матригель в присутствии различных низкомолекулярные ингибиторы, связанных с Rho-киназы, связанной (ROCK) путей при указанных концентрациях . Через 24 ч клетки подвергали для анализа выживания CCK-8 путем измерения оптической плотности при 450 нм (A450). Т-тест студент был использован для определения является ли различия в эффективности одноклеточных покрытия между различными ингибиторов ROCK имеют статистической значимости. Особая звездочка знак (*) указывает на отсутствие значимых различий между ингибиторами (P & #62; 0,05), в то время как двойные знаки звездочка (**) обозначает наблюдаемую разницу является статистической значимости (P <0,05). Столбцы в гистограмм назначить средние значения четырех экземплярах детерминант и баров представляют стандартные отклонения.

Рисунок 3. NCM культура hiPSCs на ламинином-521 (LN-521) без присутствии ингибиторов ROCK. СКУ-i30 hiPSC линия была создана в NIH ​​стволовых клеток Unit. СКУ-i30 клетки были выращены на LN-521-покрытием 6-луночных планшетах в ксено-среде без TeSR2 для 15 пассажей без использования низкомолекулярные ингибиторы, такие как ингибиторы ROCK. (А) Иммуноокрашивание СКУ-i30 клеток с анти -NANOG поликлональное антитело и контрастно с Hoechst 33342 (Hoechst). Примечательно, что некоторые клетки, которые негативно окрашивание Nanog являются йе клетки под митоза. (B) Цитометрический анализ в потоке HPSC маркера экспрессии в SCU-i30 клеток, выращенных как NCM на 2,5% Матригель с использованием 10 мкМ Y-27632 (верхняя панель) или NCM на LN-521 без Y-27632 (Нижняя панель). Процедуры как иммуноокрашивания и проточной цитометрии анализа были описаны ранее ^5. Масштабные бары изображают 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. NCM культура hPSCs для микроРНК трансфекции. WA01 ЭСК были выращены как NCM на 2,5% Матригель в mTeSR1 в течение 2 (А) и 18 (B) проходы соответственно. Представительства фазы и флуоресцентные изображения из WA01 клеток, трансфицированных Dy547-меченого управления микроРНК для мониторинга эффективности трансфекции в 24 часов после трансфекции. Масштабные полоски представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Есть два основных пути к культуре hPSCs в пробирке: обычные колонии типа культуры (ячеек на фидерах или внеклеточных матриц) и подвеска культура hPSCs как агрегатов без фидеров ^6. Ограничения и колонии типа подвески и методами культивирования включают накопленный неоднородность и наследуемые эпигенетические изменения. NCM культура, на основе как пассажей одноклеточных и обшивки высокой плотности клеток, представляет собой новый метод культуры для HPSC роста ^6,18. Хотя различные методы одноклеточных пассажи были описаны в литературе, но никто из них не используются для рутинного распространения. Например, Ву и его коллеги использовали метод одноклеточных пассажей для изучения влияния различных малые молекулы коктейлей на рост HPSC ^19. Тем не менее, их конечные продукты культуры являются колонии. Так, низкой плотности на основе методов одноклеточных пассажи-прежнему принадлежат колонии типа культуры. Что касается NCM культуры, с высоким содержанием притоновность покрытие преобразует эту культуру к новому способу, так как конечный продукт клетка представляет собой гомогенную монослой. Недавно, Дворжак и его коллеги использовали аналогичный метод, чтобы всесторонне проанализировать свойства HPSC при этом условии роста ^18. Их результаты также подтверждают наши основные выводы. Теперь ясно, что NCM культура является новым методом, который обладает несколькими новыми свойствами и может быть изменен в течение многих потенциальных применений в плюрипотентных биологии стволовых клеток.

Основные свойства hPSCs из NCM культуры

Вполне возможно, что hPSCs под NCM культуры имеют много общих характеристик с теми же типами клеток выращивают как колоний ^9,18. Уровни экспрессии маркеров в чЭСК hPSCs, которые включают в октябре-4, NANOG, SSEA-3/4, TRA-1-60, TRA-1-81, и SSEA-1, аналогичны в обоих NCM и колонии типа культуры . NCM-адаптированные клетки также сохранить подобные паттерны экспрессии глобальная мРНК в HPSC колоний, выросших на МEF фидерные слои ^9. Очевидно, NCM-адаптированные клетки поддержания плюрипотентных государство как определяется тератомы анализа ^9,18. Однако, в отличие HPSC колоний, клетки в условиях NCM иметь предсказуемое темпы роста, которая характеризуется последовательной кривых роста, клеточного цикла, и количества клеток ^9. Из-за высокой плотности посева одноклеточных, hPSCs в условиях NCM демонстрируют экспоненциальный рост между 2 и 4 день (фиг. 1B), таким образом увеличивая количество клеток по 4 раза по сравнению с HPSC колоний, выросших на MEFs. Длительное культура не увеличивает производство клеток, а скорее увеличивает апоптоза и дифференцировки стресс ^9. NCM также обеспечивает оптимальное криоконсервации, что позволяет быстрое восстановление клеток на покрытие размороженные клетки (протокол 1). Кроме того, NCM облегчает адаптацию HPSC культуры различных протоколов ксено-бесплатно ^9. В общем, NCM поддерживает рост hPSCs, поддерживает плюрипотентного состояния, и поддерживает потенциал hPSCs дифференцироваться в тканях взрослого трех зародышевых листков.

Стабильность хромосомной в hPSCs под NCM

С точки зрения стабильности хромосомной, нет непосредственное сравнение между клетками различных методов культуры. Большинство hPSCs в наших условиях NCM культуры имеют нормальные кариотипы и цифры ген копирования определяется G-диапазонов, на основе массива сравнительного геномного гибридизации (aCGH) и флуоресценции в гибридизация (FISH) ^9. Две линии (~ 13%) показали аномальный кариотип, в котором одна линия (т.е. WA09) выставлены повышенной полиплоидию и еще один (ES01) было 14% клеток с трисомией 20 ^9. Неясно, были ли получены эти аномальные кариотипы от Выбор существовавшие ранее мутировавших клеток до NCM культуры или индуцированных во NCM адаптации. Важно, что исходные колонии HPSC или подмножество колоний используется для NCM культуры шульд быть хорошо охарактеризованы с точки зрения их однородности и стабильности хромосомной в то время для NCM адаптации. Примечательно, что скорость аномальных кариотипов в условиях NCM значительно ниже, чем сообщалось в недавнем анализе когорты, в которой авторы выявить 34% аномальный кариотип под преобладающим колонии типа культуры условиях ^20. Таким образом, наше исследование показывает, что мы можем расти диссоциированные одиночные клетки и поддерживать их стабильность хромосомного в условиях NCM. Тем не менее, мы также должны использовать более чувствительные методы для изучения хромосомных аномалий hPSCs в ближайшие годы. В частности, мы должны проверить хромосомы 1, 12, 17 и 20 с помощью более высоких зонды разрешения (т.е. <50 Kb), а некоторые незначительные повреждения (например, 20q11.21 ампликон) на этих часто измененных хромосом не может быть обнаружена обычными кариотипирование и РЫБЫ ^20-22. Кроме того, развитие разнообразных протоколов NCM позволит нам определить Робуй и безопасные методы для будущих приложений.

NCM культура в разнообразных модификаций

Использование ROCK ингибитора, Y-27632, открыл дверь для анализов одноклеточных основе. Наличие разнообразных ингибиторов ROCK бы обеспечить дополнительные выборы для NCM основе расширения и криоконсервации hPSCs (рис. 2). В теории, любой маленькая молекула, которая может существенно повысить эффективность одноклеточные обшивки, могут быть использованы для облегчения NCM культуры. ЯК ингибитор 1, который функционирует иначе, чем те ингибиторов ROCK, представляет собой такой пример ^9. Использование одиночных молекул или комбинаторных подходов может обеспечить нам оптимальный рост клеток, клеточные анализы и криоконсервации hPSCs. Тем не менее, альтернативы NCM культура hPSCs на определенных белков внеклеточного матрикса, таких как ламинин изоформы LN-521, обычно выраженное в чЭСК ^23-25, может устранить интерференцию небольшоймолекулы (рис. 3). LN-521 может усилить диссоциируют-HPSC выживание и поддерживает плюрипотентность через активацию пути α6β1-PI3K/AKT ^24. Простота пассажей hPSCs с LN-521 уменьшает неоднородность клеток, совместимых с различными фидерных-свободными и ксено-бесплатно системах клеточных культур с использованием полностью определенной среде (Протокол 4). Он также обеспечивает дополнительный модуль для высокой пропускной анализов без влияния малых молекул. Хотя ИПСК под NCM культуры на LN-521 сохранил экспрессию панели HPSC маркеров, дальнейшей характеристики этих клеток с использованием тератомы анализа и эмбриоидных тела опосредованного мультилинейной дифференциации может быть необходимо для подтверждения плюрипотентных государства в этих клетках. Следует отметить, что hiPSCs культивировали на ламинином изоформы LN-521, как сообщается, цитогенетически стабильным (http://biolamina.com/). Тем не менее, мы также должны применяться с более высоким разрешением и чувствительные методы (как обсуждалось выше) до еxamine стабильность хромосомной в этих клетках.

Универсальность NCM культуры для генной инженерии

Методы NCM основе представляют собой простой, надежной и экономичной системы, которые могут быть особенно полезны для генетических манипуляций hPSCs (протоколы 5-7). Известно, что чЭСК колонии являются трудными для трансфекции или трансдукции, с большой изменчивостью в эффективности трансфекции / трансдукции между различными лабораторий ^26-28. Например, эффективность трансфекции в ЭСК составляет от 3 ​​до 35% при условиях культивирования колонии ^26. Лентивирусных сигналы трансдукции в BG01 клеток в условиях колонии оказались крайне низким ^9. Тем не менее, эффективность трансфекции опосредовано NCM было больше, чем 75% ⁹ и модификации методов трансдукции может увеличить лентивирус-опосредованной эффективность трансдукции до 90% ^28. Плотная сравнительное исследование показало, что это гое многоклеточные объединения в чЭСК колонии, которые способствуют низкой эффективности трансфекции ^9. Кроме того, мы недавно изменен протокол трансфекции микроРНК и способны добиться высокой эффективности трансфекции (~ 91%) без использования лентивирусы (Protocol 6 и рис. 4). Этот протокол является простым в использовании и особенно полезно для переходных экспериментов трансфекции в пределах 3 - до 5-дневного периода времени. Как мы очерчены в перечисленных протоколов, множественные факторы должны быть приняты во соображений, когда мы оптимизировать эффективность трансфекции / трансдукции в hPSCs. Эти факторы включают в себя плотность клеток, плазмиды концентрации, лентивирусные титры, множественность заражения (МВД), продолжительность трансфекции / трансдукции, цитотоксичность реагентов и методов, используемых для повышения эффективности мониторинга трансфекции / трансдукции.

Мы разрабатываем и расширить методы NCM для культуры hPSCs на Матригель и на определенных внеклеточных матриц. Этот метод культураявляется эффективным способом для устранения неоднородности обычно встречаются в HPSC колонии и агрегированных культур. Человека плюрипотентных стволовых клеток в условиях роста NCM плюрипотентны и хромосомно стабильной. Это новая система культуры является простым и универсальным для поддержания HPSC, масштабного расширения и генетических манипуляций.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This work was supported by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) at the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We would like to thank Dr. Ronald D. McKay for his discussion and comments on this project.