ヒト多能性のための代替培養はセル生産、メンテナンス、および遺伝子解析幹

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

多系列成体組織に向かって差別化するhPSCsの容量は、心血管、肝臓、膵臓、および神経システム^1-4を伴う重篤な疾患に苦しむ患者の治療に新たな道を開いた。 hPSCsから派生した様々な細胞型はまた、疾患のモデリング、遺伝子工学、薬物スクリーニング、および毒性試験^1,4のための堅牢な携帯プラットフォームを提供するであろう。将来の臨床的および薬理学的用途を保証する重要な問題は、 インビトロでの細胞培養を介して臨床グレードhPSCs多数の生成である。しかし、現在の培養系ではコロニー^5,6としてhPSCsの様々なフィーダーフィーダーフリーの培養液を含む、不十分であったり、本質的に可変のどちらかである。

hPSCs株哺乳動物の初期胚の内部細胞塊（ICM）の多くの構造的特徴のコロニー型の増殖。 ICMは3生殖層に分化する傾向がある多細胞の環境であるため、異種シグナル勾配の存在。このように、初期胚発生における不均一性の獲得は、分化に必要なプロセスであると考えますが、HPSC文化の不要な機能です。 HPSC培養における不均一性は、多くの場合、過度のアポトーシスシグナルおよび準最適な成長条件による自発的分化によって誘導される。従って、コロニータイプの培養で、不均一な細胞は、しばしば、コロニー^7,8の周囲に観察される。また、ヒト胚性幹細胞（hESCの）中の細胞が、例えばBMP-4 ⁹とシグナル伝達分子に展示差動応答をコロニーことが示されている。また、コロニー培養法は、制御不能の成長率およびアポトーシスシグナル伝達経路^6,9に低い細胞収量だけでなく、凍結保存と非常に低い細胞回収率を生成する。近年、種々の懸濁培養は、培養のためにhPSCs particulが開発されているフィーダーマトリックスを含まない条件下^6,10-13中hPSCs、大量の拡張のためアルリー。明らかに、別の培養システムは、独自の長所と短所を有する。一般に、hPSCsの不均一な性質を遺伝子工学⁶ hPSCsにDNAとRNAの物質を送達するための準最適であるのコロニー型および凝集培養法における主な欠点のうちの1つを表す。

明らかに、現在の培養方法のいくつかの欠点を回避する新しいシステムを開発する必要性が不可欠である。単一細胞の生存を改善する（このようなROCK阻害剤Y-27632およびJAK阻害剤1のような）低分子阻害剤の発見は解離し、HPSC文化^14,15のための道を開く。これらの小分子を使用することで、我々は最近、非コロニー型（NCM）を解離·hPSCs ⁹の成長に基づいた培養法を開発した。この新規培養法は、単一細胞継代と高密度の両方を兼ね備え、メッキ法、私たちは主要な染色体異常⁹なしで一貫性のある成長サイクルの下で均質hPSCsを大量に生成することができます。あるいは、NCM培養は広い用途のための培養方法を最適化するために、異なる小分子と（例えば、ラミニンなど）が定義行列を用いて実施され得る。ここでは、NCMのカルチャに基づいて、いくつかの詳細なプロトコルを提示し、遺伝子工学のための詳細な手順を描く。 NCMプロトコルの汎用性を実証するために、我々はまた、多様なROCK阻害剤で、単一のラミニンアイソフォーム521（ すなわち 、LN-521）でNCM文化をテストしました。

hPSCsの単一細胞に基づく非植民地型単層（NCM）の文化。

1。準備

1. 10％FBS、2mMのL-グルタミン、および0.1mM非必須アミノ酸（NEAA）を補充したDMEM培地：マウス胚線維芽細胞（MEF）の培養のための培地500mlを加える。
2. DMEM培地中の0.1％ゼラチンでコーティングされた6ウェル細胞培養プレート上のルーチンプロトコル¹⁶と培養したMEF以下CF1株に由来するマウス胚線維芽細胞（MEF）細胞を単離する。代わりに、商業資源の一節3でMEFの株式を購入してください。
3. マトリゲルプレートを準備します。
   1. -20℃の冷凍庫に50％ずつ、5（〜4℃で冷やした）DMEM/F12培地mlのストアとのhESC修飾マトリゲルの株式の5ミリリットルを希釈します。冷蔵庫（約4℃）、O / Nで凍結したマトリゲルのストックを解凍し、さらに（2.5％作用濃度を生じる）冷たいDMEM/F12培地中でマトリゲルを希釈。
   2. ウェルあたり1.5ミリリットル2.5％マトリゲルでコーティング6ウェル細胞培養プレートは、冷蔵庫、O / Nでのコートされたプレートを格納します（注：2週間以内にマトリゲルコートプレートを使用します）。
   3. プレートは10から30分間、細胞培養フード（注：細胞培養​​インキュベーター中でプレートを暖めるません）で、室温で温める、冷蔵庫からマトリゲルプレートを取り外し、吸引したDMEM培地前hPSCsをメッキする。
4. 500ミリリットルのhESCの媒体を作る：80％DMEM/F12培地、20％KSR、2mMのL-グルタミン、0.1mMの非必​​須アミノ酸、0.1mMのβ-メルカプトエタノール、およびFGF-2の4 ng / mlの。
5. 、60％のFBS、20％のDMSO、およびmTeSR1培地中に20μMのY-27632濾過により殺菌し、1週間以内にメディアを使用します。2X HPSC凍結培地10mlを準備します。

2プロトコル1（基本）：フィーダー上HPSCコロニーを育て

1. 一貫resulを取得するために、HPSC培養のために5または6（P5とP6とする）で、MEFの継代数を使用して、TS。有糸分裂細胞を、1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）で3回、次いで0.53mMの0.05％トリプシンでのMEFを解離させる洗浄し、37℃で3時間、10μg/ mlのマイトマイシンCで細胞を処理することによってMEFのを不活性化EDTA。代わりに、X線照射で8000ラドの用量でのMEFを照射。
2. 顕微鏡下で、トリパンブルー染色排除法を用いて細胞数を数える。別の方法として、自動セルカウンターを使用しています。
3. 6ウェルポリスチレンプレート上にプレート照射されたMEFを、ウェル当たり1.88×10 ⁵細胞（ すなわち 、1.96×10 ⁴細胞/ cm ^2）の密度で0.1％ゼラチンでコーティングした。 37℃で細胞をインキュベートし、5％CO ₂で24時間。
4. （この時に必要ない洗浄ステップに注意していない）パスツールピペットで吸引によりMEF培養液を除去します。
5. 小さな塊に、前培養からの粉薬HPSCコロニー、FRの範囲にそれらのサイズを確保するために、顕微鏡下で塊を調べるOM 50径の100μmで、よくHPSC培地2mlを含む1にMEFフィーダー層の上にHPSC塊プレート。
6. 3〜5日間の変化のhESC媒体中の毎日、写真で記録的コロニー成長、いかなる形態学的に改変されたまたは分化コロニー（〜5％）をマークし、手動でパスツールピペットで吸引によって静かにマークされたコロニーを削除します。
7. 二回のMEF上の残りのコロニーをすすぐ（2分間D-PBSで各々）、10〜30分間HPSC培地中1 mg / mlのコラゲナーゼIV 2mlのコロニーをインキュベート）からHPSCコロニーの分離を調べるMEF-被覆された表面（注：コロニーをしっかりとプレートに取り付けられている場合にのみ、剥離プロセスを支援するためにスクレーパーを使用します）。
8. 、15mlチューブに酵素反応、転写コロニーを最小限HPSCコロニーをRTで3〜5分間沈降することができ、およびcの直接可視化することによりコロニーの沈降を確実にするために各ウェルにHPSC培地5mlを追加チューブの底のエル（注：このステップでチューブを遠心分離しないでください）​​。
9. 残留したMEFを含む上清を取り出して、単一細胞を解離し、ヒトES細胞培地5mlでコロニーを再懸濁し、二度沈降手順を繰り返します。
10. 細胞継代のための6ウェルプレートに（1良く凍結バイアルあたりの集密）またはプレート凍結保存のための媒体（またはCryoStore CS10凍結培地）を凍結1X HPSCの小さな塊、店にミディアム、粉薬HPSCコロニーを削除します。

3プロトコル2：NCMにHPSCコロニーをフィーダからの変換

1. 一度D-PBSでHPSCペレットをすすぎ、10分間1XをAccutase 1mlでペレットをインキュベートし、単一細胞解離を保証するために、顕微鏡下で酵素反応を調べる。
2. 穏やかに5分間、室温で200×gの遠心分離、続いて10μMのY-27632を含有mTeSR1培地5ml中で細胞を再懸濁することにより酵素反応を停止さ（細胞の損傷の原因となる過剰な遠心力を使用しないでください）​​。
3. ペレットにmTeSR1培地5mlを追加し、単一細胞としてペレットを再懸濁し、フィルターは40ミクロ​​ンセルストレーナー（残留細胞凝集体を除去するために）を通して細胞を解離した。
4. 1ウェルにシード1.3-2×10 ⁶ hPSCsは2.5％のhESC修飾マトリゲルでコーティングした6ウェルプレートの（1.4から2.1×10 ⁵細胞/ cm ^2）を 、2.5ミリリットルまでmTeSR1培地を追加し、10μMを含む培地中のY-27632（初期24時間単細胞メッキを容易にするため）。代わりに、単一セルのメッキを向上させるために、10μMのY-27632を交換するには、以下の小さな分子を利用さ1μmのY 39983（I阻害ROCK）、1μMのphenylbenzodioxane（ROCK II阻害剤）、1μMのthiazovivin（小説ROCK阻害剤を） 、および2μMのJAK阻害剤1。
5. （24時間以内）の次の日に薬物を含まないmTeSR1培地で培地を交換して、余分な1から細胞を解離ウェル、および単一細胞播種効率を決定するために細胞数をカウントし（注：およそ、この段階で達成することができる単一細胞プレーティング効率の50〜90％で）。
6. 細胞がmTeSR1培地3mlで数日間、単一セルに形成された単層として成長することができます。毎日培地交換。
7. 経験的に継代のスケジュールを決定する細胞密度に依存してNCMに適合される。細胞増殖は、細胞間の境界線が消失した後3日目または4日目にコンフルエンスに達し、又は4時間の時点で通路。をAccutase 1mlの細胞を解離、細胞継代のために1〜3個の分割比（6ウェルプレートの3ウェルに播種した細胞、すなわち 、1コンフルエントウェル）を使用し、5継代によって適応NCMを安定化させる。
8. 細胞凍結
   1. 1凍結バイアル用（〜5-6×10 ⁶細胞）とともに1集密を利用：10分をAccutaseの1ミリリットルとよく1コンフルエントから細胞を解離する。
   2. 希薄W上記のようにmTeSR1媒体遠心細胞のi番目の5ミリリットル。
   3. mTeSR1培地500μl中にペレットを再懸濁した後、徐々に凍結保存バイアル中で（20μMのY-27632を含む）2X HPSC凍結培地500μlを加える。代わりに、10μMのY-27632または2のどちらか100μMのJAK阻害剤1の存在下での2100μMのJAK阻害剤1または1x CryoStor CS10培地を含む1X HPSC凍結培地中で細胞を再懸濁。
   4. 氷冷低温容器（isopranol底で満たされた）に凍結バイアルを置き、すぐに-80℃の冷凍庫に冷凍容器を移す。
   5. 長期間の凍結保存のために（翌日の）液体窒素タンクに℃の冷凍庫から-80細胞を移す。
9. 細胞融解
   1. 6ウェルプレートの1だけでなく、メッキ用の凍結保存バイアルを利用する。
   2. 10分間37℃の水浴で2分間、同じ水浴中で解凍細胞において前加温mTeSR1培地滴下10μMのY-27632を含む予め温めmTeSR1培地5mlにセルを追加し、上記のように遠心します。
   3. 静かに、10μMのY-27632を含むmTeSR1培地2mlで細胞ペレットを再懸濁し、ゆっくりと（注：空気の泡を発生しないよう）十分にマトリゲルでプレコートに細胞を移す。
   4. 毎日培地交換し、HPSCの成長が3日または4でコンフルエントに達することを期待しています。

4プロトコル3：NCM文化にマトリゲル上HPSCコロニーを変換する

1. 冷蔵庫からマトリゲルコートプレートを外し、10から30分間組織培養フードにプレートを置き、プレートの各ウェルから培地を除去し、各ウェルに予め温めmTeSR1培地2mlを加える。
2. 転送は、上記のマトリゲル板にフィーダー文化（基本プロトコールのステップ2.10）からHPSC塊を粉砕した。各ウェルの2.5ミリリットル最終容量までmTeSR1媒体を追加します。
3. 3から4日間、毎日培地を交換コロニーは百分の80から90までのコンフルエンスに到達するまでだ。
4. 細胞継代のために：二回D-PBSですすぎコロニーを15〜20分間、37℃で2 mg / mlのディスパーゼ1mlで細胞を処理し、塊として沈殿し、継代細胞。
5. NCM培養のため：3.1 3.9には、議定書2に記載された手順を繰り返します。

5プロトコル4：上hPSCsのNCM文化LN-521

1. 使用する日の前に、4℃で、組換えLN-521溶液を解凍し、最終濃度を（のCa ^{2 +} / Mg ^{2 +}を含有） ^を 1×D-PBSで解凍し、ラミニン希釈することによりラミニンコーティング溶液（LCS）を作る10μg/ mlの。
2. （：ドライアウト塗装工程の間は避けてください）​​6ウェルプレートに1にLCSの1ミリリットルを追加します。
3. 蒸発を防ぐため、冷蔵庫（4℃）のO / N（：1週間以内にプレートを使用してください）​​で、プレートを格納するためのパラフィルムでコーティングされたプレートをシール。
4. 静かにすることなく、パスツールピペットでLCSを削除コー​​ティングされた表面をuching、よく1にmTeSR1培地2mlを加える。
5. 25分間37℃の水浴中で（D-PBSを含む）すべての培養液を温める。
6. HPSCコロニーはNCMに変換
   1. 議定書2に記載されているようにして、Accutaseを持つ単一の細胞に細胞凝集を解離する。
   2. シード1.3-2×10 ROCK阻害剤の存在なしに1よくLN-521でコーティングされた（1.4から2.1×10 ⁵細胞/ cm ^2）に⁶ hPSCs。
   3. 3から4日間、毎日培地を交換。
   4. 1〜3個の分割比を使用して次の細胞継代のために3日目または4にして、Accutase 1ml中の細胞を解離する。

6プロトコル5：NCM文化プラスミドDNAトランスフェクションのために

1. 4のプロトコル2で説明したように、NCMの文化にHPSCコロニーを適応させる。
2. プレートを10μMY-2763の存在下でのmTeSR1培地において⁵細胞/ウェル7.5×10 6の細胞密度で12ウェルプレート中hPSCs解離2。
3. 細胞をプレーティングした後4-8時間の間に薬物を含まないmTeSR1培地でmTeSR1培地を交換してください。
4. 各トランスフェクションのために、（ 例えば 、pmaxGFP）発現プラスミド2.5μgのを希釈し、125μlののOpti-MEMのそれぞれに別々のエッペンドルフチューブ中のリポフェクタミン2000の5μlの血清培地を削減。
5. 5分後、希釈された試薬を混合し、（トランスフェクション複合体を形成する）を室温で20分間インキュベートする。
6. 1ミリリットルmTeSR1培地中の各ウェルを含むhPSCsに250μlのトランスフェクション複合体を追加し、24時間、CO ₂インキュベーター内で37℃で細胞を培養する。
7. 実際のトランスフェクション効率の計算のために、ランダムに蛍光顕微鏡と写真の下にトランスフェクション効率を調べます。

7プロトコル6：NCM文化マイクロRNAのトランスフェクションのために

1. 6ウェル当たりをAccutaseを1mlを添加してNCM条件下で、2日目に、半コンフルエントhPSCsを解離ウェルプレート。
2. 5分間200×gでの酵素反応と遠心分離機を希釈するmTeSR1培地10mlを追加します。
3. mTeSR1培地で細胞ペレットを再懸濁し、10μMのY-27632を含有mTeSR1培地中で12ウェルプレート中ウェル当たり7.5×10 ⁵細胞の密度で細胞を播種し、細胞を4時間インキュベートさせて取り付ける。
4. Y27632フリーmTeSR1培地で培地を交換してください。
5. 市販のマイクロRNA（ 例えば 、DY547で標識された非標的miRIDIAN miRNAのトランスフェクションコントロール）を使用します。提供される試薬を用いて、0〜160 nmの範囲の濃度を滴定し、メーカーの指示に従ってください。
6. トランスフェクション後24時間で、顕微鏡下で生きている細胞のDY547蛍光を撮像してHPSC株では各濃度のトランスフェクション効率を最適化します。
7. すべての画像化された細胞の上DY547陽性細胞の割合に基づいてトランスフェクション効率を計算します。

1. 繰り返します議定書6の7.4に7.1を繰り返します。
2. TUは単位を変換の総数を表すのに対し、MOIは、ウェル内感染の所望の多重度を等しく、TU =（MOIがCNのX）/ VT（MOIまたは：次の式を使用します。形質導入のために使用されるウイルス粒子の量を算出TU /細胞）、CN、各ウェル中の細胞数を指定し、VTは、ストックのウイルス力価（TU / ml）を示す。例えば、SMART-shRNAベクターのための在庫のウイルス力価（1mlあたりの単位を変換する）、1×10 ⁹ TU / mlに等しいことを考えると、7.5×10 ⁵形質導入の際にウェル当たり細胞および20の予想されるMOIは：15を使用し各ウェルのための株式のウイルス粒子液（注意：この条件は、一過性のレンチウイルス誘導のために推奨されます）。
3. 30分間のポリブレン10 mg / mlのとmTeSR1媒体の前のウォーム300μL。
4. に株式ウイルス粒子の15μLを追加予め温めmTeSR1媒体はポリブレンを含む、ゆっくりと溶液を混合。
5. ウイルス粒子を含む予め温め培地300μlの細胞培養培地を交換してください。
6. 4時間のインキュベーションの後、形質導入効率を決定するためにturboGFP蛍光（shRNA発現用のメーカー）を調べる。
7. 細胞はturboGFPを発現し始めるときだけでなく変換に追加のmTeSR1培地300μlを加える。
8. 12〜16時間インキュベートした後、ターボGFP発現を見直す。
9. 72時間内にこれらの形質導入細胞で所望のフォローアップ実験を行う。

NCM文化の一般的なスキーマ

図1に、ROCK阻害剤Y-27632の存在下での高密度単一細胞めっき後hPSCsの動的な変化を示す典型的なNCM培養スキーマを表します。これらの形態学的変化は、細胞のクラスター形成をプレーティングし、細胞縮合、続いて指数関数的な細胞増殖（ 図1A）の後に細胞間接続を含む。代表的な実験は、1日目に、10μMのY-27632の存在下で個/ cm ² 1.9×10 ⁵細胞の密度で単一細胞としてメッキ、WA01（H1）ヒトES細胞を示している（ 図1B、左のパネル）は、さらにすることなく伝播2日目のコロニー（ 図1B、中央パネル）の形成、および所望の実験のために、または3日目（ 図1B、右パネル）における細胞の継代に好適である均質な単層として集光される。

<強い>様々なROCK阻害剤は、NCMの文化をサポート

96ウェルプレートアッセイは、概念実証ハイスループット薬物スクリーニングのために使用した。また、NCMの培養を支持するための様々なROCK阻害剤の使用を最適化するように設計した。およそ、31,000 SCU-I10細胞、ヒト誘導多能性細胞^{（hiPSCs）17が}解離し、あるマトリゲル被覆されたROCK阻害剤の異なる濃度の存在下でウェルに播種した。 24時間後、細胞をこれらの条件下で細胞生存を決定するために、CCK-8ベースの生存率アッセイに供した。我々は以前にNCM方法は、単一細胞メッキを増強するために10μMで、ROCK阻害剤Y-27632の使用を必要とすることを示した。この報告では、10μMY-27632が著しくhiPSCsの効率をメッキ24時間単一細胞（P <0.05）（ 図2）を増加させることを確認した。また、Y-39983（I阻害ROCK）、phenylbenzodioxane（ROCK II inhibiことがわかった器）、およびthiazovivin（新規なROCK阻害剤）有意に単一細胞プレーティング効率を調節し、それらの対照（P <0.05）（ 図2）と比較した場合、1μMでNCMの成長を促進する。さらに、単一細胞プレーティング効率（1μMでの）は、3つのROCK阻害剤の効果は、10μM（P> 0.05）（ 図2）におけるY-27632のそれに匹敵した。注目すべきことに、私は（5μmに）阻害岩は他の分子よりも特異的な相互作用が関与し、1μM（P <0.05）での薬物と比較して顕著な細胞毒性を示すことが表示されます。したがって、様々なROCK阻害剤は、将来のNCM培養を支持するために使用することができる。しかし、これらの新しい阻害剤とNCMの下で両方のhESCとhiPSCsの完全な特性は、将来の使用のために必要とされるであろう。

LN-521は、ROCK阻害剤を使用することなく、NCM培養を支持する

Tを決定するために、彼のhESCの成長を支援する具体的なラミニンアイソフォームの役割は、我々は、異種非含有培地TeSR2におけるLN-521コートプレート上でSCU-I30 hiPSCsを培養した。興味深いことに、単独のLN-521は、ROCK阻害剤の存在なしに、単一細胞播種と、この条件の下で15継代のための後続のNCMの成長（ 図3）をサポートしています。抗NANOGポリクローナル抗体とSCU-I30細胞の免疫染色は、この条件の下で細胞が核内で高いNANOGの発現（ 図3A）を有することを示した。フローサイトメトリー分析は、hESCのマーカー発現プロフィールが、ROCK阻害剤Y-27632（ 図3B）を用いて、NCMのように増殖させた細胞と同様であったことを示した。

レンチウイルス粒子を使用せずにマイクロRNA配信の高効率

DY547標識オリゴヌクレオチドのマイクロRNAを用いたトランスフェクションは、NCM条件下WA01（H1）細胞で行った。 WA01のヒトES細胞は、NCMでのように成長させた 2.5％2（ 図4A）のためのmTeSR1におけるマトリゲルおよび18（ 図4B）は、それぞれ通路。これらの細胞は、高いトランスフェクション効率が24時間後にトランスフェクション（ 図4Aおよび図4B）を示した。一般的に、我々は、トランスフェクション後24時間でヒトES細胞で91パーセントにトランスフェクション効率を得ることができます。

NCM文化の図1（A）スキーマ。折れ線グラフは、NCMの条件の下で、典型的な3日間の培養での多細胞関連の動的な変更の輪郭を描く。（B）16継代のmTeSR1培地に2.5％マトリゲル上でのNCM条件で伝播WA01（H1）ヒトES細胞の代表的な位相画像が（指定WA01、mcp16）など。下のパネルは、上部パネルの拡大図である。スケールバーは、100μmを示す。EF = "https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg"ターゲット= "_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2の96ウェルフォーマットを用いて単一細胞生存アッセイ。約31,000 SCU-i10でhiPSCs ^17は、示された濃度でRho関連キナーゼ（ROCK）経路に関連する種々の小分子阻害剤の存在下で2.5％マトリゲル上に播種し。 24時間後、細胞を450nm（A450）での吸光度を測定することにより、CCK-8生存率アッセイに供した。スチューデントt検定は、種々のROCK阻害剤との間の単一細胞プレーティング効率の差は統計的有意であるかどうかを決定するために使用した。単数アスタリスク記号（*）は、P＆＃（阻害剤との間に有意差がないことを示します62; 0.05）、（**）観察された差である二重アスタリスク記号は、統計的有意性（P <0.05）であるのに対し。ヒストグラムの列は四連の決定やバーの平均値は標準偏差を表す指定します。

図3。ラミニン521上hiPSCsのNCM文化（LN-521）ROCK阻害剤が存在しない。SCU-I30 hiPSCラインはセルユニット幹NIHの確立された。 SCU-I30細胞は、ROCK阻害剤などの小分子阻害剤を使用せずに15継代異種非含有培地中でTeSR2 LN-521-コーティングした6ウェルプレート上で増殖させた。抗有するSCU-I30細胞の（A）免疫染色-NANOGポリクローナル抗体およびヘキスト33342（ヘキスト）で対比。注目すべきは、負のNANOG染色を持っているいくつかの細胞が目です有糸分裂の下のE細胞（B）のY-27632なしのLN-521に、10μMのY-27632（上のパネル）またはNCMを使用して2.5％マトリゲル上NCMとして成長SCU-I30細胞中のHPSCマーカー発現のフローサイトメトリー分析（下のパネル）。免疫染色およびフローサイトメトリー分析の両方のための手順は、以前に記載された^5。スケールバーは、100μmを示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図4マイクロRNAトランスフェクションのためのNCM hPSCs培養。WA01 hESCを、それぞれ、 図2（A）及び図18（B）継代mTeSR1中の2.5％マトリゲル上NCMとして増殖させた。 DyのでトランスフェクションWA01細胞の代表的な位相および蛍光画像トランスフェクション後24時間で、トランスフェクション効率を監視するための547-標識コントロール·マイクロRNA。スケールバーは、100μmを表しています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

従来の（フィーダまたは細胞外マトリックス上の細胞の）コロニー型の文化やフィーダー⁶のない集合体としてhPSCsの懸濁培養：in vitroでの培養hPSCsには、2つの主要な方法があります。コロニー型とサスペンションの両方培養法の制限は累積異質と継承エピジェネティックな変化があります。 NCM培養物は、単一細胞継代及び高密度細胞播種の両方に基づいて、HPSC成長^6,18のための新しい培養方法を表す。なお、種々の単一細胞継代方法は、文献に記載されているが、それらのどれも、ルーチン増殖のために使用されない。たとえば、呉らはHPSC成長¹⁹上の様々な小分子カクテルの効果を研究するために単一細胞継代方法を採用。しかしながら、それらの最終培養物はコロニーである。だから、低密度ベースの単一細胞継代方法はまだ植民地型文化に属している。 NCM文化に関しては、高隠れ家最終細胞生成物が均質な単層であるため、ITYメッキは、新しいメソッドにこの文化を変換します。最近では、ドヴォルザークらは総合的に、この成長条件の下で¹⁸ HPSC特性を分析するために同様の方法を使用していました。その結果はまた、当社の主要な結論をサポートしています。これは、NCMの文化は、いくつかの新しい特性を有する新たな方法であり、さらに、多能性幹細胞生物学の多くの潜在的なアプリケーションのために変更することができることが明らかになっている。

NCM培養からhPSCsの基本的なプロパティ

それはコロニー^9,18として成長した細胞と同じ種類のNCM文化を共有し、多くの特性の下でhPSCsことが考えられる。 Oct-4の、NANOG、SSEA-3/4、TRA-1-60、TRA-1-81およびSSEA-1を含むhPSCsにおけるhESCのマーカーの発現レベルは、NCMおよびコロニー型培養物の両方に類似している。 NCM適応細胞はまた、M HPSC上に成長したコロニーに類似した全体的なmRNA発現パターンを保持するEFフィーダー層^9。奇形腫アッセイ^9,18によって決定された明らかに、NCMに適応した細胞が多能性状態を維持する。しかしながら、HPSCコロニーとは異なり、NCM条件下で細胞が一貫した成長曲線、細胞周期、細胞数⁹によって特徴付けられる予測可能な成長速度を有する。による高密度単一細胞めっきを、NCM条件下hPSCsことによりHPSCのMEF上で増殖させたコロニーと比較して4倍の細胞数を増加させる、2日目および4（ 図1B）との間の指数関数的な成長を示す。長期の培養は、細胞産生を増加させず、むしろアポトーシスおよび分化応力^9が増大する。 NCMはまた、このように解凍した細胞（プロトコル1）をめっきする際に迅速な細胞の回復を可能にし、最適な凍結保存を可能にします。また、NCMは、様々な異種非含有のプロトコル⁹にHPSC文化の適応を容易にします。一般的には、NCMは、hPSCsの成長をサポートする多能性状態を維持し、潜在を維持3胚葉の成体組織に分化するhPSCsのには必須の条件です。

NCMの下hPSCsにおける染色体の安定性

染色体安定性の点で、異なる培養方法からの細胞の間には直接の比較は存在しない。 G-バンディング、アレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーション（のaCGH）、および蛍光in situハイブリダイゼーション ^（FISH）9によって決定されるように我々のNCM培養条件下hPSCsの大部分は正常な核型および遺伝子コピー数を有する。二行（〜13％）が1行（ すなわち 、WA09）はトリソミー20 ⁹の細胞の14％を持っていた高架倍数性と別の1（ES01）を示している、異常な核型を示した。これは、これらの異常核型が誘導されたかどうかは不明である前NCM文化に変異した細胞を既存またはNCM適応の間に誘導の選択。それが始まるHPSCコロニーやコロニーのサブセットがNCM培養SHに使用することが重要ですNCM適応のための時間に自分の均質性および染色体安定性の点で十分に特徴付けられウルド。注目すべきことに、NCM条件下での異常な核型の速度は、作成者が優勢なコロニー型の培養条件の下で²⁰は34％異常な核型を明らかにした、最近のコホート分析で報告されたものよりはるかに低い。したがって、我々の研究は、我々は、解離し、単細胞を増殖し、NCMの条件の下で彼らの染色体の安定性を維持できることを示しています。それにもかかわらず、我々はまた、今後数年間でhPSCsの染色体異常を調べるために、より高感度な方法を使用する必要があります。これらの頻繁に変化した染色体におけるいくつかの小さな病変（ 例えば 、20q11.21アンプリコン）は、従来では検出できないように、特に、我々は、より高い解像度のプローブ（ すなわち 、<50キロバイト）を用いて、染色体1、12、17、および20をスキャンする必要が染色体分析およびFISH ^20〜22。さらに、多様なNCMプロトコールの開発はrobuを識別するために、私たちを可能にするSTおよび将来のアプリケーションのための安全な方法。

多様な変更の下で、NCM文化

ROCK阻害剤の使用、Y-27632は、単一細胞ベースのアッセイのためにドアを開いた。多様なROCK阻害剤の有効性は、hPSCsのNCMベースの拡大と凍結保存します（ 図2）のための追加の選択肢を提供するであろう。理論的には、有意に単一細胞プレーティング効率を向上させることができる任意の小分子は、NCM培養を容易にするために使用することができる。それらの異なったROCK阻害剤から機能するJAK阻害剤1は、例えば^9を表す。単一分子又はコンビナトリアルアプローチの使用は私達に最適な細胞増殖、細胞アッセイ、及びhPSCsの凍結保存を提供することができる。しかしながら、このような通常のhESC ^23-25 ​​において発現ラミニンアイソフォームLN-521のような定義された細胞外マトリックスタンパク質上の別のhPSCs NCM培養物は、小の干渉を排除することができる分子（ 図3）。 LN-521は解離し、HPSCの生存率を向上させ、α6β1-PI3K/AKT経路²⁴の活性化を介して多能性を維持可能性があります。 LN-521との継代hPSCsのシンプルさは、様々なフィーダーを含まない、完全に定義された培地（プロトコル4）を使用して、異種非含有細胞培養システムと互換性の細胞の不均一性を低減する。それはまた、小分子の影響を受けずに高スループットアッセイのための追加のモジュールを提供する。 LN-521上のNCMの文化の下の性IPSCはHPSCマーカーのパネルの発現を維持したが、奇形腫アッセイおよび胚様体媒介多系列分化を使用して、これらの細胞のさらなる特徴付けは、これらの細胞に多能性の状態を確認する必要があるかもしれない。注目すべきは、ラミニンアイソフォームLN-521上で培養hiPSCsは伝え細胞遺伝学的に安定した（http://biolamina.com/）です。しかし、我々はまた、（上述のように）電子を高解像度かつ高感度の方法を適用する必要がこれらの細胞における染色体の安定性をxamine。

遺伝子工学のためのNCMの文化の多様性

NCMに基づく方法hPSCs（プロトコル5-7）の遺伝子操作のために特に有用である、シンプルな堅牢かつ経済的なシステムを表しています。これは、hESCコロニーは、異なる研究所間で^26-28トランスフェクション/形質導入効率に大きな変動性、トランスフェクトまたは形質導入することが困難であることが知られている。例えば、ヒトES細胞におけるトランスフェクション効率は、3〜コロニー培養条件の下で^26〜35％の範囲である。コロニー条件下BG01細胞におけるレンチウイルス形質導入信号は⁹極めて低いことが見出された。しかしながら、NCMによって媒介されるトランスフェクション効率が75％超であった⁹及び形質導入方法の変形例^90〜28％までのレンチウイルス媒介性形質導入効率を増加させることができる。タイトな比較研究は、それが目であることを明らかにした低トランスフェクション効率⁹に貢献するhESCコロニー内の電子の多団体。さらに、我々は最近、マイクロRNAトランスフェクションプロトコールを変更し、レンチウイルス（プロトコル6および図4）を使用せずに高いトランスフェクション効率（〜91％）を達成することができている。 5日間の時間枠に - このプロトコルは、使いやすく、3内の一過性トランスフェクション実験のために特に有用である。我々は上記のプロトコルに記述されているように我々はhPSCsにトランスフェクション/形質導入効率を最適化する際に、複数の要因が配慮されるべきである。これらの因子は、細胞密度、プラスミド濃度、レンチウイルス力価を、感染多重度（MOI）、トランスフェクション/形質導入の持続時間、試薬の細胞毒性、および監視トランスフェクション/形質導入効率のために使用される方法が挙げられる。

私たちは、マトリゲル上で、定義された細胞外マトリックス上で培養hPSCsにNCM方法を詳しく説明して拡張します。この培養法一般HPSCコロニー凝集培養物中に見られる不均一性を排除する効率的な方法です。 NCMの成長条件下でヒト多能性幹細胞は、多能性および染色体安定である。この新規な培養系は、HPSCのメンテナンス、大規模な拡張、および遺伝子操作するための簡単​​で汎用性があります。

The authors declare that they have no competing financial interests.

This work was supported by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) at the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We would like to thank Dr. Ronald D. McKay for his discussion and comments on this project.