Генерация Myospheres Из ЭСК эпигенетическими Перепрограммирование

Здесь мы опишем протокол на основе эпигенетической перепрограммирования человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) к генерации гомогенную популяцию скелетных мышечных клеток-предшественников, которые в разрешающих условиях культивирования образуют трехмерные кластеры сократительных мышечных волокон (myospheres), которые воспроизводят биологические особенности человека скелетные мышцы.

Генерация однородной и обильной населения скелетных мышечных клеток из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) является необходимым условием для клеточной терапии и для "болезни в посудомоечной» модели нервно-мышечных заболеваний человека. Основные препятствия, такие как низкой численности и неоднородности населения интерес, а также отсутствия протоколов для формирования трехмерных сократительных структур, ограничили применение стволовых клеток для нервно-мышечных расстройств. Мы разработали протокол, который преодолевает эти ограничения по внематочной введения определенных факторов в ЭСК - определение мышцы фактором MyoD и SWI / ОЯТ хроматина сложный компонент BAF60C - которые способны перепрограммировать ЭСК в клетки скелетных мышц. Здесь мы опишем протокол создан для генерации чЭСК полученных миобластов и содействовать их кластеризацию в трехмерный миниатюрных структур (myospheres), который функционально мимические миниатюрных скелетные мышцы ⁷

Из-за их уникальной способности к самообновлению, сохраняя плюрипотентности, человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) считаются бесценным ресурсом в регенеративной медицине. Стволовые клетки, опосредованного репопуляции больных мышц и чЭСК-или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSC), полученных поколение скелетных мышц для моделирования болезни в пробирке являются ключевыми задачами исследований, направленных на выявление лечения и выяснения патогенеза многих нервно-мышечных заболеваний. Тем не менее, эти исследования были оспорены сопротивления ЭСК для преобразования в клетках скелетных мышц и скудностью информации о молекулярном регулирования чЭСК-приверженности к скелетной миогенеза. Действительно, предыдущие попытки генерировать скелетных предшественников мышечных от ЭСК показал, что только эмбриоидного тела (EB)-производные потомства или мезенхимальные клетки компетентны, чтобы активировать скелетных миогенез следующие эктопической экспрессии транскрипционных активаторов (например,Pax3 или Myf5) ^1-3 или под воздействием конкретных условий культивирования ^4-5.

Ранее нами было показано, что компонент SWI / ОЯТ, BAF60C (кодируется SMARCD3), является одним из важнейших компонентов транскрипционного аппарата, что позволяет MyoD-опосредованной активации мышц конкретных локусов ^6. Недавно мы обнаружили, что селективный отсутствие BAF60C дает на чЭСК сопротивление MyoD-опосредованной активации скелетных миогенеза ^7, который в противном случае, наблюдаемой в BAF60C выражения соматических клеток ^8-10, процесс обычно называют миогенного преобразования. Усиленная экспрессия BAF60C позволяет MyoD чтобы непосредственно активировать скелетных миогенез в ЭСК, от конкретных условий культивирования, с BAF60C и MyoD внушительной эпигенетическую подпись, которая совершает ЭСК к миогенной линии ^7. Следует отметить, что предыдущая протеомный анализ показал селективное отсутствие BAF60C, среди компонентов SWI / ОЯТ, в ЭСК ^11. Мы использовали эти знания навязать эпигенетическую приверженность ЭСК на миогенной линии, что приводит к генерации однородной популяции скелетных миобластов, которые могут агрегатироваться с образованием трехмерной сократительной структуры (myospheres), которые функционально мимические миниатюрных скелетные мышцы ^7. Действительно, наш метод генерации скелетные предшественники мышечных от ЭСК опирается на эпигенетической приверженности ЭСК к миогенной линии, которая является фенотипически скрытая пока клетки подвергаются дифференциации сигналов, таких как клетки агрегации и культуры в дифференциации среды (см. специальный протокол). Эта стратегия позволяет расширение однородной популяции ЭСК, которые эпигенетически привержены скелетных мышц линии и подходящий к образованию трехмерных сократительных myospheres что резюмировать гистологические и функциональные свойства скелетныхмышцы. В myospheres обеспечивают первое доказательство миниатюрных мышц эксплуатируемых для "болезни в посудомоечной» модели мышечных заболеваний. Когда генерируется из пациентов получены ИПСК, эти myospheres есть потенциал, чтобы выяснить давние вопросы развития и патогенеза редких заболеваний, в дополнение к предложению огромный потенциал в качестве инструмента для высокопроизводительного скрининга терапевтических соединений. Отметим также, что один непосредственный отсчет myosphere анализа может быть обеспечена с помощью иммуногистохимии на срезах, как описано в протоколе Юпитер по Гомес и др. ^12.

1. Заражение ЭСК

Этот протокол требует высокий титр лентивирусы кодирования BAF60C и MyoD ^13. Эти конструкции могут быть предоставлены по запросу.

1. Рекомендации перед началом
   1. В целях обеспечения высокой эффективности инфекции, плиты ЭСК для инфекции на фидерных без условий (рис. 2А), чтобы устранить сотовой конкурентов во время вирусной поглощения. Действительно, MEFs, как известно, легче заразить по сравнению с ЭСК и компетентны для MyoD опосредованного преобразования. Таким образом, устранение MEFs от чЭСК культур повышает уровень инфицированности.
   2. Рекомендуется иметь высокие лентивирусы титр для обеспечения высокой эффективности заражения. Опции по повышению эффективности инфекции обсуждаются в разделе "Проверка инфекции".
   3. Подготовка Матригель покрытием пластины добавлением 1 мл 1 мг / мл Матригель в каждую лунку и оставить по крайней мере 1 час при комнатной температуре (или O / N герметичный при 4 ° Сесли готовы накануне).
2. Процедура Инфекция
   1. День до заражения
      1. Добавить HES сотового Клонирование & Приложение Recovery в среде в 1000 X разбавления (2 мМ конечная концентрация).
   2. День 0 - Заражение BAF60C
      Примечание: Выполните инфекции ЭСК с BAF60C сначала следуют инфекции MyoD.
      1. Диссоциируют колодец 6-и пластины ЭСК, выращенного как колонии ¹⁴ в одной клеточной суспензии путем инкубации с 1 мл TrypLE в течение 5 мин при 37 ° С
      2. Передача суспензии до 15-мл пробирку, добавляют 9 мл чЭСК среде и центрифугируют в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту.
      3. В ходе центрифугирования готовить смесь инфекции в чистую пробирку, добавив к 1 мл mTeSR1, полибрен (6 мг / мл) и ГЭС Cell Cloning и восстановления дополнительная (2 мм).
      4. Повторное приостановить осадок клеток (примерно 5 х 10 ⁵ -1 × 10 ⁶ клеток из одной сonfluent хорошо из ЭСК) с 1 мл инфекции смеси и пластины на 6-а низкой пластины крепления, который предотвращает клетки от присоединения к пластике.
      5. Добавить BAF60C-IRES-GFP вирус в 10 ⁸ МВД и инкубировать 3 ч в инкубаторе
      6. Сбор клеточной суспензии, содержащей вирусы и разделить поровну в двух Матригель покрытием скважин. Затем добавить 2 мл mTeSR1 + ЭСК клетки Клонирование и восстановление дополнения в каждую лунку и оставить O / N в инкубаторе.
   3. День 1
      1. Осторожно снимите среду, содержащую вирус и заменить 2 мл mTeSR1and ЭСК клетки Клонирование и дополнения Recovery. Клетки начнет наносить удар, как показано на рисунке 2B.
   4. День 2 - Заражение MyoD
      1. Прежде чем продолжить проверить состояние флуоресценции клеток под флуоресцентным микроскопом, чтобы убедиться, иметь высокую эффективность инфекции. Если нет, см. раздел "проверка заразитьионный ".
      2. Если клетки достигли по крайней мере 80% от слияния, выполните следующие действия; в противном случае ждать дополнительного дня до судебного разбирательства.
      3. Снимите среду и добавить 1 мл TrypLE реагента для диссоциации клеток. Инкубировать 5 мин при 37 ° С
      4. Повторите, как описано from1.2.2.2 - 1.2.2.6 добавления вируса MyoD 10 ⁸ МВД.
   5. День 3
      1. Осторожно снимите среду, содержащую вирус и заменить 2 мл mTeSR1and ЭСК клетки Клонирование и дополнения Recovery.
      2. Пластинчатые MEFs на матригеле покрытием пластин при 2,5 х 10 ⁵ / см ² в течение следующего дня, чтобы позволить распространение зараженных клеток.
   6. День 4
      1. Снимите среду и добавить 1 мл TrypLE реагента для диссоциации клеток. Инкубировать 5 мин при 37 ° С
      2. Трансфер клеток в 15 мл трубки сокола, добавить 9 мл чЭСК среды и центрифуги в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту.
      3. Rалить супернатант и повторно приостанавливать в 6 мл чЭСК среды.
      4. Снимите среды из MEFs содержащего 6-луночный планшет и пластинчатых ЭСК в 1:02 коэффициенту распределения, выдачи 3 мл для каждого MEFs содержащих хорошо.
         СОВЕТ! Когда колонии достичь слияния, некоторые из лунки MyoD/BAF60C-infected клеток могут быть заморожены в жидком азоте в виде резервного запаса. Замораживание среда включает 90% KOSR и 10% ДМСО плюс 2 мм HES сотового Клонирование & Приложение Recovery. Остальные скважины могут быть затем подвергают воздействию протокола дифференцировки - см. ниже описании. Если больше клеток необходимы, чтобы произвести больше myospheres, инфицированные ЭСК могут распространяться дальше следующим образом:
      5. Снимите среды и инкубировать 1 мл 1 мг / мл коллагеназы IV в течение 5 мин при 37 ° С
      6. Удалить коллагеназы IV и добавить 1 мл чЭСК среды.
      7. Под микроскопом рассечение очистить колонии с наконечником 10 мл.
      8. Соберите куски колоновэс в 15-мл трубки и позволяют оседать в течение 3 мин. Тогда удалите супернатант, ресуспендируют в чЭСК среды и пластины на MEFs пластин с использованием соотношении 1:4.
3. Проверка инфекции
   1. В то время как распространяющихся клеток, рекомендуется к пластине инфицированных клеток в меньшем масштабе, чтобы собрать для анализа РНК и выполнять анализ экспрессии белка с помощью иммунофлуоресценции с целью проверки биомаркеров, которые отражают правильное положение биологическую на каждом этапе (см. репрезентативные результаты). Для высоким титром лентивирусов процент ожидаемых инфицированных клеток должна быть не менее 80%.
   2. Для обеспечения высокой эффективности, то лентивирусные векторы могут быть изменены, представляя флуоресцентный маркер выбора и / или устойчивости к антибиотикам. Наша лентивирусный плазмиды выражения BAF60C также несет флуоресценции GFP.
   3. Сортировка ЭСК для флуоресцентным маркером. В случае низкой эффективности инфекции рекомендуется использовать флуоресценции Activated клетки сортировки (FACS-сортировки) для обогащения клеток, экспрессирующих вирус BAF60C а затем инфицировать клетки с вирусом MyoD высоким титром.
      1. Добавить HES сотового Клонирование & Приложение Recovery в среде за день до сортировки.
      2. День сортировки, отделить клетки от TrypLE (как описано в день 0) и ресуспендирования клеток в KO замены сыворотки плюс ЭСК клетки Клонирование и восстановление дополнения в FACS трубок.
      3. В конце сортировки, сбора клеток в KO замены сыворотки и пластины на MEFs пластин добавив HES сотового Клонирование & Приложение Recovery.

2. EB-как индукционные и дифференциация

1. Процедура индукции и дифференциация
   1. День 0 - индукция Е.Б.
      1. Убедитесь, перед началом дифференциации от BAF60C/Myod-infected ЭСК, чтобы иметь большое количество колоний в скважине (рис. 2С).
      2. Для каждого а галить среду, промыть PBS и добавить 1 мл 1 мг / мл коллагеназы IV. Выдержите в течение 5 мин при 37 ° С
      3. Удалить коллагеназы и добавить 1 мл EB среды.
      4. Под микроскопом рассечение быстро механически отделить колонии в 400-800 клеточных агрегатов путем соскоба с наконечником на 10 мл.
      5. Соберите куски колоний в 15-мл пробирку и дать осесть в течение 3 мин. Удалить супернатант, повторно приостанавливать в 3 мл EB среды и передачи клеточной суспензии на одну лунку 6-луночного низкой монтажной пластине.
   2. День 1
      1. Проверьте размер колоний и гибель клеток, прежде чем приступить. Если большие куски присутствуют, разбить их, осторожно пипеткой вверх и вниз с 5-мл пипетки, 3-4 раза. Если гибель клеток очень высока (многие плавающие клетки и мусор) замените носитель, собирая агрегатов в 15-мл трубки под действием силы тяжести и пластины их с 3 мл свежей EB среды, в противном случае действуйте следующим образом.
      2. Добавить 1,5мл свежего EB среды в скважинах
   3. День 2
      1. Изменение среды, собирая агрегаты из скважин в 15-мл трубки. Пусть они располагаются в течение 2 мин.
      2. Удалить супернатант, замените 3 мл свежей среды EB и перераспределять на тех же скважин.
   4. День 3
      1. Добавить 1,5 мл свежей EB среды в лунках.
   5. День 4
      1. Действуйте, как описано в "День 2".
   6. День 5 - Миогенный дифференциация EB-подобных кластеров (рис. 2D).
      1. Соберите агрегатов, как описано в 2.1.3.1 и мыть один раз с 2 мл PBS; позволяют агрегированный для осаждения.
      2. Удалить PBS и добавить 3 мл DM среды; пластины на тех же скважин.
   7. День 6 - День 20
      1. Из d6 к d20 заменить среду свежей средой каждые 3 дня. Представительства myospheres показаны на FНа рис 2E.
2. Проверка myosphere дифференциация
   1. Прежде чем двигаться дальше, рекомендуется проверить эффективность миогенной дифференцировки в пределах myospheres, сделав разделы myospheres встроенных в октябре соединения, как описано в предыдущем протоколе Юпитер ^12. Провести окрашивание иммунофлюоресценции для миогенных маркеров, таких как myognenin (клон F5D, DSHB) и тяжелой цепи миозина (клон MF20, DSHB) (см. Представитель Результаты).
      СОВЕТ! Чтобы быть успешным с окрашиванием для Myogenin по разделам EB это имеет решающее значение для выполнения извлечения антигена путем обработки додецилсульфата натрия (SDS) 0,5% в течение 5 мин. Кроме того, можно использовать этот протокол для двойного окрашивания с использованием F5D и MF20 антител.

3. СМИ Рецепты

1. ESC среднего
   DMEM-F12
   1 мМ L-глутамина
   20% Нокаут Serгм Замена среднего (KOSR)
   0,1 мМ заменимых аминокислот (NEAA)
   50 Е / мл пенициллина / стрептомицина (Pen / Strep)
   0,1 мМ бета-меркаптоэтанола
   8 нг / мл основного фактора роста фибробластов (оФРФ)
2. Е.Б. среднего
   DMEM F12
   1 мМ L-глутамина
   15% FBS
   5% лошадиной сыворотки
3. DM среднего
   DMEF F12
   1X жидком Медиа Дополнение
   1X N-2 Дополнение

На фиг.1А схематически протокола предложено, чтобы генерировать myospheres из ЭСК. Критические шаги по контролю (показано стрелками) являются эффективность инфекции в ЭСК и миогенной преобразования в пределах myospheres.

В наших экспериментах мы воспользоваться лентивирусным вектора кодирования BAF60C, который несет флуоресценции GFP. Мы обычно инфицировать клетки с BAF60C и СУИМ-Упорядочить 72 ч после заражения для обогащения населения, выражающей BAF60C. Когда клетки достигают порядка 70-80% от слияния, мы заразить MyoD лентивирус. После первого инфекции обычно занимает два-три дня для клеток, чтобы достичь этого слияния.

Фиг.1В показывает уровни экспрессии экзогенных генов, как кратное по отношению к индукции ЭСК не инфицированы. Фиг.1С показана экспрессия и распределение на уровне белка из факторов, введенных. BAF60C Выражение показан как флуоресценции GFP, в то время как выражение MyoD обнаружен с помощью иммунофлуоресценции с MyoD антитела. Мы считаем, день 0 день мы начинаем дифференциацию зараженных ЭСК в EB-подобных агрегатов. Через 15 дней в DM среды, часть из myospheres (как правило, один весь хорошо) вложено в октябре соединения ¹² и секционные выполнять иммунофлюоресценции для миогенных маркеров, чтобы проверить миогенную эффективность преобразования. Рисунок 1D показывает представительство окрашивание на Myogenin и тяжелой цепи миозина в оптимальная миогенной дифференциация. Myospheres могут иметь различные или необычные формы, возможно, в результате слияния с меньшими myospheres. Начиная с 10-й день, это можно наблюдать спорадический сокращение в myospheres (см. фильм 1 и 2).

43/51243fig1.jpg "/>
Рисунок 1.) Схема протокола, используемого для генерации myospheres из ЭСК. B) уровни мРНК экзогенных генов в ЭСК, инфицированных BAF60C и MyoD (Н9-BM), контролируемого Qrt-PCR и выражается в индукции раза, а по сравнению с издеваться зараженные ЭСК (Н9-CTR). C) иммунофлуоресценции изображения, показывающие MyoD окрашивание (красный) и BAF60C флуоресценции (зеленый) в связи с элемента IRES-GFP в векторе. D) Иммунофлуоресценции выполненного на myosphere срезах, окрашенных для Myogenin (MYOG ), тяжелой цепи миозина (MyHC) и контрастно для DAPI (подробности см. иммунофлюоресценции). Шкала бар составляет 100 мкм.

Рисунок 2. Типичные картины появления клеток на разных стадияхПротокол от инфекции (часть I) к дифференциации (часть II). Шкала бар составляет 100 мкм. В то время как EB-подобных структур с d1 на d5 в основном круглую форму (D), myospheres выращенные в течение 15 дней в соответствии со схемой на рис 1А представить непредсказуемую форму и являются гетерогенными в культуре; см. два примера в Е и F.

Протокол, предложенный здесь описывается создание трехмерных кластеров сократительных мышечных волокон (myospheres) непосредственно из ЭСК. Стратегия, предложенная имеет беспрецедентный и огромный потенциал для производства мини мышцы в суспензии, которые могут быть пригодны в качестве "болезни в посудомоечной» модели для обеих скрининга и исследований в области развития. Кроме того, метод для генерации myospheres от ЭСК проста и не требует никаких шагов FACS сортировки во время дифференциации, которая обычно оказывает негативное воздействие на выход клеток, выделенных. Кроме того, сортировка процедура при дифференциации будет мешать агрегации, так как это подразумевает диссоциацию ИС на отдельные клетки.

Предложенный метод основан на эпигенетической перепрограммирования из ЭСК с конкретными факторами, MyoD и BaAF60C, которые не выражены в плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток. MyoD и BAF60C обеспечить «ядро» белковый комплекс йна знаки геномная локусов, из которых транскрипция протекает активировать скелетных миогенную программу. Эти два фактора доставляются в клетки посредством лентивирусных инфекций и поэтому решающее значение для получения высокой эффективности инфекции обоих факторов во всех клетках. Это может быть достигнуто с использованием высоких вирусы или вирусы титр наделенные маркеров селекции. Условия культивирования, также играют важную роль в оптимизации степень миогенной дифференцировки. Мы предлагаем протокол дифференциации сыворотки на основе для дифференциации MyoD/BAF60C выражающей ЭСК в кластеры миогенных прекурсоров, а затем инкубации в бессывороточной среде (содержащей инсулин трансферрин - ИТС) для достижения преобразования миогенных прекурсоров в скелетных мышечных трубках. Тем не менее, вполне возможно, что другие средах определенного состава может достичь такой же или лучший миогенный дифференциации. Один ограничение тока протокола является то, что она опирается на использование эмбриональной телячьей сыворотки, которая, к тому же содержатING много животных белков и веществ, показывает много-к-много вариаций. Это может привести к снижению эффективности или неоднородности миогенной преобразования в myospheres. Следует отметить, что не все EB-как структуры, полученные из BAF60/MyoD-expressing ЭСК являются myospheres; а именно, некоторые агрегаты EB-подобные полностью состоит из мышечных волокон. Количество myospheres обычно полученных из ЭСК, экспрессирующих BAF60C и MyoD может варьироваться от 30 до 60% по оценкам иммунного окрашивания на EB секций, выполненных в конце протокола (см. результаты). Потенциальный подход для обогащения культуры блюдо для всего myospheres бы использовать миогенную репортер. Это будет способствовать отбрасывая частично или не дифференцированные EB-как кластеры и выбрав только myospheres.

И наконец, лучшее понимание механизмов, лежащих в основе временных требований факторов, введенных бы полезно улучшить метод доставки. Например, если BAF60C и MyoD требуются только для шорт время "удар" клеток в правильном направлении, методы, основанные на модифицированной доставки мРНК могут быть применены. Напротив, если факторы необходимы для более длительного времени, прежде чем клетки эксплуатировать свои внутренние белки, эписомными подход был бы рекомендован для устранения изменчивости и неконтролируемых последствий в связи с интеграцией в геноме. Наконец, отметим, что он является обязательным, чтобы выразить BAF60C до или в то же время, как MyoD (никогда после) в целях достижения преобразование чЭСК в скелетных мышцах. Требование предварительного выражения BAF60C предположительно зависит от его роли в предварительной настройки эпигенетическую ландшафт для правильного распределения MyoD хроматина через генома ^6,15. Таким образом, будущие протоколы могут быть улучшены за счет соединений или других манипуляций, которые способствуют BAF60C выражение в ЭСК.

Нам нечего раскрывать.

ПЛП является младший следователь Научно-исследовательского центра здравоохранения Sanford детей. Эта работа была поддержана следующих грантов PLP: R01AR056712, R01AR052779 и P30 AR061303 из Национального института здравоохранения / Национального института артрита и костно-мышечной и кожных заболеваний (NIAMS), MDA и Sanford детей исследованиям в области здравоохранения премию. Эта работа частично воспользовались финансирования научных исследований из Седьмой рамочной программы Европейского сообщества в проекте FP7-здоровье - 2009 ENDOSTEM 241440 (Активация сосудистой связанных стволовых клеток и мышечных стволовых клеток для ремонта и технического обслуживания мышечной ткани) SA была поддержана. CIRM общение.