Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Qui, descriviamo un protocollo basato su riprogrammazione epigenetica di cellule staminali embrionali umane (hESCs) verso generare una popolazione omogenea di progenitori muscolari scheletriche che in condizioni di coltura permissive formano cluster tridimensionali delle miofibre contrattili (myospheres), che ricapitolano caratteristiche biologiche umana muscoli scheletrici.

Generazione di una popolazione omogenea e abbondante di cellule muscolari scheletriche da cellule staminali embrionali umane (hESCs) è un requisito per terapie cellulari e per una "malattia in un piatto" modello delle malattie neuromuscolari umane. Principali ostacoli, come la bassa abbondanza ed eterogeneità della popolazione di interesse, così come la mancanza di protocolli per la formazione di strutture contrattili tridimensionali, hanno limitato le applicazioni delle cellule staminali per disturbi neuromuscolari. Abbiamo progettato un protocollo che supera questi limiti dall'introduzione ectopica di fattori definiti nel hESCs - il fattore di determinazione muscolare MyoD e SWI / SNF rimodellamento della cromatina complesso BAF60C componente - che sono in grado di riprogrammare hESC in cellule muscolari scheletriche. Qui si descrive il protocollo stabilito per generare mioblasti hESC-derivati ​​e promuovere il loro raggruppamento in strutture tridimensionali miniaturizzati (myospheres) che funzionalmente mimici muscoli scheletrici miniaturizzati ⁷

A causa della loro capacità unica di auto-rinnovarsi, pur mantenendo la pluripotenza, le cellule staminali embrionali umane (hESC) sono considerate una risorsa inestimabile nel campo della medicina rigenerativa. Generazione di cellule staminali ripopolamento mediata dei muscoli malati e cellule hESC o staminali pluripotenti indotte (iPSC)-derivati ​​dei muscoli scheletrici per la modellazione della malattia in vitro sono obiettivi fondamentali di studi volti ad identificare i trattamenti e chiarire la patogenesi di molte malattie neuromuscolari. Tuttavia, questi studi sono state contestate dalla resistenza di hESC a convertire in cellule del muscolo scheletrico e dalla scarsità di informazioni riguardanti la regolazione molecolare di hESC-impegno verso myogenesis scheletrico. Infatti, precedenti tentativi di generare progenitori muscolari scheletriche da hESCs ha rivelato che solo il corpo embryoid progenie (EB)-derivati ​​o cellule mesenchimali sono competenti per attivare miogenesi scheletrica seguente espressione ectopica di attivatori trascrizionali (es.Pax3 o Myf5) ^1-3 o dall'esposizione a particolari condizioni di coltura ^4-5.

Abbiamo precedentemente dimostrato che il componente SWI / SNF, BAF60C (codificata dal SMARCD3), è un componente essenziale del macchinario trascrizionale che permette l'attivazione MyoD-mediata di muscolo-specifica loci ^6. Abbiamo recentemente scoperto che l'assenza selettiva di BAF60C conferisce sul hESCs la resistenza all'attivazione MyoD-mediata di miogenesi scheletrica ⁷ che è altrimenti osservata in BAF60C esprimere cellule somatiche ^8-10, un processo comunemente indicato come conversione miogenico. Espressione forzata di BAF60C permette MyoD di attivare direttamente miogenesi scheletrica in hESCs, su specifiche condizioni di coltura, con BAF60C e MyoD imporre una firma epigenetico che impegna hESCs verso la linea miogenico ^7. Di nota, precedente analisi proteomica ha rivelato l'assenza selettiva di BAF60C, tra i componenti SWI / SNF, in CES ^11. Abbiamo usato questa conoscenza per imporre un impegno epigenetica hESCs sulla linea miogenico, porta alla generazione di una popolazione omogenea di mioblasti scheletrici che potrebbero essere aggregati per formare contrattile tridimensionale strutture (myospheres) che funzionalmente imitano i muscoli scheletrici miniaturizzati ^7. Infatti, il nostro metodo di generazione di progenitori muscolari scheletriche da hESCs si basa sull'impegno epigenetico di hESC al lignaggio miogenico, che è fenotipicamente latente fino a quando le cellule sono esposte a segnali di differenziazione, come la cella aggregazione e cultura in terreno di differenziamento (vedi protocollo specifico). Questa strategia consente l'espansione di una popolazione omogenea di hESCs che sono epigeneticamente impegnata scheletrico lineage muscolare ed adatto alla formazione di myospheres contrattili tridimensionali che ricapitolano istologico e proprietà funzionali dei scheletricomuscoli. I myospheres forniscono la prima prova dei muscoli miniaturizzati sfruttabili per una "malattia in un piatto" modello di malattie muscolari. Quando generate da pazienti provenienti iPSCs, questi myospheres hanno il potenziale per chiarire questioni di sviluppo di lunga data e la patogenesi delle malattie rare, oltre ad offrire l'enorme potenziale come strumento per lo screening ad alto rendimento di composti terapeutici. Si segnala altresì che una lettura immediata di myosphere analisi potrebbe essere fornito mediante immunoistochimica su sezioni, come descritto in un protocollo JoVE da Gomes et al. ¹²

1. Infezione hESCs

Questo protocollo richiede alta lentivirus di titolo di codifica BAF60C e MyoD ^13. Questi costrutti sono disponibili su richiesta.

1. Raccomandazioni prima di iniziare
   1. Al fine di garantire un'elevata efficienza di infezione, hESCs lastra per infezione condizioni prive di alimentazione (Figura 2A) per eliminare concorrenti cellulari durante l'assorbimento virale. Infatti, MEF sono notoriamente più facile per infettare rispetto a hESCs e sono competenti per la conversione MyoD-mediata. Così, eliminando MEF da culture hESC aumenta il tasso di infezione.
   2. Si raccomanda di avere lentivirus alto titolo di garantire un'elevata efficienza di infezione. Opzioni per migliorare l'efficienza di infezione sono discussi nella sezione "controllo dell'infezione".
   3. Preparare piastre Matrigel rivestite con l'aggiunta di 1 ml di 1 mg / ml Matrigel in ogni pozzetto e lasciare almeno 1 ora a temperatura ambiente (o O / N sigillato a 4 ° Cse preparato il giorno prima).
2. Procedura di infezione
   1. Giorno prima che l'infezione
      1. Aggiungi HES cellulare Clonazione & Recovery Supplemento a medio a 1.000 X diluizione (2 mM concentrazione finale).
   2. Giorno 0 - Infezione da BAF60C
      Nota: Eseguire l'infezione di hESC con BAF60C prima seguita da infezione con MyoD.
      1. Dissociare un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti di hESC coltivate come colonie ¹⁴ in una cella singola sospensione mediante incubazione con 1 ml di TrypLE per 5 min a 37 ° C.
      2. Sospensione trasferire in un tubo da 15 ml, aggiungere 9 ml di hESC medio e centrifugare per 5 min a 1200 rpm.
      3. Durante la centrifugazione, preparare la miscela infezione in una provetta pulita aggiungendo 1 ml di mTeSR1, polibrene (6 mg / ml) e con HES cellulare Clonazione & Recovery Supplementare (2 mM).
      4. Risospendere il pellet di cellule (circa 5 x 10 ⁵ -1 x 10 ⁶ cellule da un confluent ben di hESCs) con 1 ml di miscela di infezione e piastra su una piastra da 6 pozzetti partire allegato, che impedisce alle cellule di aderire alla plastica.
      5. Aggiungi BAF60C-IRES-GFP virus a 10 ⁸ MOI e incubare 3 ore in incubatrice
      6. Raccogliere la sospensione cellulare contenente i virus e dividere equamente in due pozzetti Matrigel rivestite. Quindi aggiungere 2 ml di mTeSR1 + HES cellulare Clonazione & Recovery Supplemento a ciascun bene e lasciare O / N in incubatrice.
   3. Giorno 1
      1. Rimuovere con cautela il supporto contenente il virus e sostituirlo con 2 ml di mTeSR1and HES cellulare Clonazione & Recovery Supplement. Cellule inizieranno agglomerante come illustrato nella Figura 2B.
   4. Day2 - Infezione da MyoD
      1. Prima di procedere controllare lo stato fluorescenza delle cellule con un microscopio a fluorescenza per assicurarsi di avere una elevata efficienza di infezione. In caso contrario, vedere la sezione "controllo infettareione ".
      2. Se le cellule hanno raggiunto almeno l'80% di confluenza, procedere come segue; altrimenti attendere un giorno in più prima di procedere.
      3. Rimuovere il medio e aggiungere 1 ml di TrypLE reagente per dissociare le cellule. Incubare 5 min a 37 ° C.
      4. Ripetere quanto descritto from1.2.2.2 - 1.2.2.6 aggiungendo virus MyoD 10 ⁸ MOI.
   5. Day 3
      1. Rimuovere con cautela il supporto contenente il virus e sostituirlo con 2 ml di mTeSR1and HES cellulare Clonazione & Recovery Supplement.
      2. MEF piastra su Matrigel rivestite piastre a 2,5 x 10 ⁵ / cm ² per il giorno successivo per consentire la propagazione delle cellule infette.
   6. Giorno 4
      1. Rimuovere il medio e aggiungere 1 ml di TrypLE reagente per dissociare le cellule. Incubare 5 min a 37 ° C.
      2. Trasferire le cellule in un tubo Falcon da 15 ml, aggiungere 9 ml di hESC medio e centrifugare per 5 min a 1200 rpm.
      3. Rimuovi il supernatante e risospendere in 6 ml di hESC medie.
      4. Rimuovere il supporto dal 6 pozzetti MEF-contenimento e hESCs piastra in rapporto 1:2 di divisione, erogazione di 3 ml per ogni MEF contenenti bene.
         SUGGERIMENTO Quando le colonie raggiungono confluenza, alcuni dei pozzi di cellule MyoD/BAF60C-infected possono essere congelati in azoto liquido come riserva per stock. Medio Congelamento comprende il 90% dei KOSR e il 10% DMSO più 2 HES mM cellulare Clonazione & Recovery Supplement. I restanti pozzetti possono essere poi esposti al protocollo differenziazione - vedi sotto per la descrizione. Se sono necessarie più cellule a produrre più myospheres, hESCs infetti possono essere propagate ulteriormente come segue:
      5. Rimuovere il terreno e incubare con 1 ml di 1 mg / ml di collagenasi IV per 5 min a 37 ° C.
      6. Rimuovere collagenasi IV e aggiungere 1 ml di hESC mezzo.
      7. Sotto un microscopio dissezione raschiare le colonie con una punta di 10 ml.
      8. Raccogliere i pezzi di colonies in una provetta da 15 ml e lasciar sedimentare per 3 min. Quindi rimuovere il surnatante, risospendere in hESC medio e piastra su MEF piatti con un rapporto 1:4.
3. Controllo infezione
   1. Mentre moltiplicazione delle cellule, si raccomanda alla piastra le cellule infette in una scala più piccola della raccolta per l'analisi di RNA e di eseguire analisi di espressione proteica mediante immunofluorescenza al fine di verificare la presenza di biomarcatori che riflettono lo stato biologico corretta in ogni fase (vedere i risultati rappresentativi). Per lentivirus ad alto titolo la percentuale di cellule infettate attesi deve essere almeno l'80%.
   2. Per garantire un'elevata efficienza, i vettori lentivirali possono essere modificate, introducendo un marcatore di selezione fluorescente e / o una resistenza agli antibiotici. Il nostro plasmide lentivirale che esprime BAF60C svolge anche GFP fluorescenza.
   3. Ordinamento hESCs per un marcatore fluorescente. Nel caso di scarsa efficienza di infezione si consiglia di utilizzare una fluorescenzacellule ctivated (FACS-ordinamento) per arricchire di cellule esprimenti virus BAF60C e quindi di infettare le cellule con alto titolo virus MyoD.
      1. Aggiungi HES cellulare Clonazione & Recovery Supplemento nel mezzo il giorno prima l'ordinamento.
      2. Il giorno della selezione, dissociare le cellule TrypLE (come descritto al giorno 0) e risospendere le cellule nel siero sostituzione KO più HES cellulare Clonazione & Recovery Supplemento FACS tubi.
      3. Al termine della selezione, raccogliere le cellule nel siero sostituzione KO e piatto sul MEF piatti aggiungendo HES cellulare Clonazione & Recovery Supplement.

2. EB-come induzione e differenziazione

1. Induzione e differenziazione procedura
   1. Giorno 0 - induzione EB
      1. Assicurarsi, prima di iniziare la differenziazione da BAF60C/Myod-infected hESCs, per avere elevato numero di colonie nel pozzo (Figura 2C).
      2. Per ogni bene rTogliete il mezzo, lavare con PBS e aggiungere 1 ml di 1 mg / ml di collagenasi IV. Incubare per 5 min a 37 ° C.
      3. Rimuovere collagenasi e aggiungere 1 ml di EB mezzo.
      4. Sotto un microscopio dissezione rapidamente dissociarsi meccanicamente le colonie in 400-800 aggregati di cellule raschiando con una punta da 10 ml.
      5. Raccogliere i pezzi di colonie in un tubo da 15 ml e lasciar sedimentare per 3 min. Rimuovere il surnatante, risospendere in 3 ml di EB medio e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti bassa allegato.
   2. Giorno 1
      1. Controllare la dimensione delle colonie e la morte cellulare prima di procedere. Se grandi blocchi sono presenti, li rompere pipettando gentilmente su e giù con una pipetta da 5 ml, 3-4 volte. Se la morte cellulare è molto elevata (molte cellule e detriti galleggianti) sostituire il mezzo raccogliendo aggregati in un tubo da 15 ml per gravità e piastra con 3 ml di mezzo fresco EB, altrimenti procedere come segue.
      2. Aggiungere 1,5ml di mezzo fresco EB nei pozzetti
   3. Day 2
      1. Cambiare il mezzo raccogliendo aggregati dai pozzetti in un tubo da 15 ml. Lasciateli stabilirsi per 2 min.
      2. Rimuovere il surnatante, sostituire con 3 ml di mezzo fresco EB e ridistribuire sugli stessi pozzi.
   4. Day 3
      1. Aggiungere 1,5 ml di mezzo fresco EB nei pozzetti.
   5. Giorno 4
      1. Procedere come descritto in "Day 2".
   6. Giorno 5 - Il differenziamento miogenico di cluster EB-like (Figura 2D).
      1. Raccogliere gli aggregati come descritto in 2.1.3.1 e lavare una volta con 2 ml di PBS; consentono al aggregato di sedimento.
      2. Rimuovere PBS e aggiungere 3 ml di terreno DM; placcare sugli stessi pozzi.
   7. Giorno 6 - Giorno 20
      1. Da d6 a d20 sostituire il mezzo con mezzo fresco ogni 3 giorni. Myospheres rappresentativi sono riportati in FIGURA 2E.
2. Controllo differenziazione myosphere
   1. Prima di procedere oltre, si raccomanda di controllare l'efficienza del differenziamento miogenico entro i myospheres rendendo sezioni dei myospheres incorporati in OCT, come descritto in un precedente protocollo JoVE ^12. Eseguire una colorazione immunofluorescenza per i marcatori miogenici come myognenin (F5D clone, DSHB) e catena pesante della miosina (clone MF20, DSHB) (vedere i risultati rappresentativi).
      SUGGERIMENTO Per avere successo con la colorazione per miogenina su sezioni EB è fondamentale effettuare recupero dell'antigene mediante trattamento con sodio dodecil solfato (SDS) 0,5% per 5 min. Inoltre, è possibile utilizzare questo protocollo per la doppia colorazione con anticorpi F5D e MF20.

3. Ricette media

1. ESC medio
   DMEM-F12
   1 mM L-glutammina
   20% Knockout Serum medio di sostituzione (KOSR)
   0,1 mm aminoacidi non essenziali (NEAA)
   50 U / ml penicillina / streptomicina (Pen / Strep)
   0.1 mM beta-mercaptoetanolo
   8 ng / ml fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF)
2. EB medio
   DMEM F12
   1 mM L-glutammina
   15% FBS
   5% Horse Serum
3. Medio DM
   DMEF F12
   Supplemento 1X ITS Liquid Media
   1X N-2 Supplemento

La figura 1A mostra uno schema del protocollo proposto per generare myospheres da hESCs. I passaggi critici per controllare (indicate dalle frecce) sono l'efficienza dell'infezione in hESCs e la conversione miogenica nei myospheres.

Nei nostri esperimenti ci avvaliamo di vettori lentivirali codifica BAF60C che porta GFP fluorescenza. Noi di solito infettare le cellule con BAF60C e FACS-tipo 72 ore dopo l'infezione per arricchire per la popolazione esprimere BAF60C. Quando le cellule raggiungono circa il 70-80% di confluenza, si infettiamo con MyoD lentivirus. Dopo la prima infezione richiede normalmente due o tre giorni per le cellule per raggiungere tale confluenza.

Figura 1B mostra i livelli di espressione di geni esogeni come piega induzione rispetto al hESCs non infette. Figura 1C mostra l'espressione e la distribuzione a livello proteico dei fattori introdotte. BAF60C espressione viene mostrato come fluorescenza GFP, mentre l'espressione di MyoD viene rilevato mediante immunofluorescenza con un anticorpo MyoD. Consideriamo Giorno 0 il giorno in cui iniziamo la differenziazione delle hESC infetti in aggregati EB-like. Dopo 15 giorni in media DM, una porzione delle myospheres (di solito un intero bene) è incorporato in OCT ¹² e sezionato effettuare immunofluorescenza per marcatori miogenici controllare miogenico efficienza di conversione. Figura 1D mostra colorazione rappresentativo per miogenina e miosina catena pesante in un differenziamento miogenico ottimale. Myospheres possono avere forme differenti o inusuali, forse a causa di fusione con myospheres piccoli. A partire dal 10 ° giorno, è possibile osservare sporadica contrazione dei myospheres (vedi film 1 e 2).

43/51243fig1.jpg "/>
Figura 1. A) Schema del protocollo utilizzato per la generazione di myospheres da hESCs. B) livelli di mRNA di geni esogeni in hESCs infettate con BAF60C e MyoD (H9-BM) monitorato mediante PCR ed espressa come induzione volte, come rispetto a deridere hESCs infetti immagini (H9-CTR). C) immunofluorescenza mostrano MyoD colorazione (rosso) e BAF60C fluorescenza (verde) per l'elemento IRES-GFP nel vettore. D) immunofluorescenza eseguita su myosphere sezioni colorate per Myogenin (MYOG ), Catena miosina pesante (MyHC) e counterstained per DAPI (vedi dettagli immunofluorescenza). Barra della scala è di 100 micron.

Figura 2. Immagini rappresentative della comparsa delle cellule a diversi stadi delprotocollo dall'infezione (parte I) alla differenziazione (parte II). bar Scala è di 100 micron. Considerando che le strutture EB-come da D1 a D5 sono per lo più di forma circolare (D), myospheres coltivate oltre 15 giorni secondo lo schema della figura 1A presenta una forma imprevedibile e sono eterogenei nella cultura; vedere due esempi E e F.

Il protocollo proposto qui descritto come generare cluster tridimensionali di myofibers contrattili (myospheres) direttamente da hESCs. La strategia proposta ha il potenziale senza precedenti e straordinaria per produrre mini muscoli in sospensione che può essere adatto come "malattia in un piatto" modello per entrambi i saggi di screening e studi di sviluppo. Inoltre, il metodo per generare myospheres da hESCs è semplice e non richiede alcun passo-FACS cernita durante la differenziazione, che tipicamente ha un impatto negativo sulla resa di cellule recuperate. Inoltre, una procedura di ordinamento durante la differenziazione interferirebbe con l'aggregazione in quanto implica una dissociazione della EB in cellule singole.

Il metodo proposto si basa sulla Riprogrammare epigenetico di hESC con fattori specifici, MyoD e BaAF60C, che non sono espressi nelle cellule staminali embrionali pluripotenti. MyoD e BAF60C forniscono il "core" della proteina complessa tha segni loci genomico da cui trascrizione procede per attivare il programma miogenico scheletrico. I due fattori sono trasportati alle cellule mediante infezioni lentivirali ed è quindi indispensabile avere una elevata efficienza di infezione di entrambi i fattori in tutte le cellule. Ciò può essere ottenuto utilizzando virus alto titolo o virus dotati di marcatori di selezione. Condizioni di coltura svolgono un ruolo importante per ottimizzare l'entità del differenziamento miogenico. Proponiamo un protocollo di differenziazione basata siero per la differenziazione dei MyoD/BAF60C esprimere hESC in gruppi di precursori miogenici, seguita da incubazione in terreno definito privo di siero (contenente insulina transferrina - ITS) per ottenere la conversione dei precursori miogenici in miotubi scheletrici. Tuttavia, è possibile che altri media definito può raggiungere un differenziamento miogenico uguale o migliore. Una limitazione corrente del protocollo è che si basa sull'utilizzo di siero bovino fetale, che, oltre a contenereing molte proteine ​​animali e sostanze, mostra lotto a lotto variazioni. Ciò può comportare una minore efficienza o eterogeneità della conversione miogena all'interno myospheres. Di nota, non tutte le strutture EB-come derivati ​​da BAF60/MyoD-expressing hESCs sono myospheres; vale a dire, alcuni sono aggregati EB-like completamente composti da miofibre. Il numero di myospheres normalmente derivati ​​da hESCs BAF60C esprimenti MyoD e può variare dal 30 al 60% come stimato dalla immunoistochimica su sezioni EB effettuate alla fine del protocollo (vedi Risultati). Un approccio potenziale per arricchire un piatto di coltura per soli myospheres sarebbe quella di utilizzare un giornalista miogenico. Ciò faciliterebbe scartando i grappoli EB-come parzialmente o non differenziati e selezionando solo i myospheres.

Infine, una migliore comprensione dei meccanismi sottostanti i requisiti temporali dei fattori introdotte sarebbe utile per migliorare il metodo di consegna. Ad esempio, se BAF60C e MyoD sono richieste solo per shtempo Ort a "calcio" le cellule nella giusta direzione, potrebbe essere applicato metodi basati sulla consegna mRNA modificato. Per contro, se sono richiesti i fattori per un tempo più lungo prima che le cellule sfruttano le proteine ​​endogene, un approccio episomale sarebbe consigliabile eliminare la variabilità ed effetti incontrollato dovuto a integrazione nel genoma. Infine, notiamo che è obbligatorio esprimere BAF60C prima o nello stesso tempo come MyoD (mai dopo) per ottenere la conversione hESC nei muscoli scheletrici. L'obbligo di previa espressione di BAF60C si basa probabilmente sul suo ruolo nella pre-impostazione del paesaggio epigenetico per una corretta distribuzione MyoD cromatina attraverso il genoma ^6,15. Come tale, i futuri protocolli potrebbero essere migliorate composti o altre manipolazioni che promuovono l'espressione BAF60C in hESCs.

Non abbiamo nulla da rivelare.

PLP è un ricercatore associato del Centro di Salute di ricerca Sanford bambini. Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni a PLP: R01AR056712, R01AR052779 e P30 AR061303 dal National Institute of Health / National Institute of Arthritis e muscoloscheletrico e malattie della pelle (NIAMS), MDA e Sanford Children premio Health Research. Questo lavoro ha in parte beneficiato di finanziamenti per la ricerca dal Settimo programma quadro della Comunità europea nell'ambito del progetto FP7-Health - 2009 ENDOSTEM 241440 (Attivazione dei vasi cellule staminali associate e di cellule staminali muscolari per la riparazione e la manutenzione del tessuto muscolare) SA è stato supportato da. CIRM comunione.