Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos.

Geração de uma população homogênea e abundante de células do músculo esquelético a partir de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) é um requisito para terapias baseadas em células e para uma "doença em um prato de" modelo de doenças neuromusculares humanas. Principais obstáculos, como a baixa abundância e heterogeneidade da população de interesse, bem como a falta de protocolos para a formação de estruturas contráteis tridimensionais, têm limitado as aplicações de células-tronco para doenças neuromusculares. Criamos um protocolo que supera esses limites por introdução ectópica de fatores definidos no hESCs - o fator MyoD determinação muscular e SWI / SNF cromatina remodelação complexo BAF60C componente - que são capazes de reprogramar hESCs em células musculares esqueléticas. Aqui nós descrevemos o protocolo estabelecido para gerar mioblastos derivados de células estaminais embrionárias humanas e promover o seu agrupamento em estruturas miniaturizadas tridimensionais (myospheres) que funcionalmente imitam músculos esqueléticos miniaturizados ⁷

Por causa de sua habilidade única de auto-renovação, mantendo pluripotência, as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são considerados um recurso valioso na medicina regenerativa. Geração de células-tronco repovoamento mediada dos músculos doentes e células-hESC ou tronco pluripotentes induzidas (iPSC) derivadas de músculos esqueléticos in vitro para modelagem de doenças são metas fundamentais de estudos que visam identificar tratamentos e elucidar a patogênese de muitas doenças neuromusculares. No entanto, estes estudos têm sido desafiados pela resistência de hESCs para converter em células musculares esqueléticas e pela escassez de informações sobre a regulação molecular de células estaminais embrionárias humanas-compromisso com tecido muscular esquelético. De fato, as tentativas anteriores para gerar progenitores musculares esqueléticas de hESCs revelou que apenas corpo embryoid progênies (EB) derivados ou células mesenquimais são competentes para ativar tecido muscular esquelético seguinte expressão ectópica de ativadores de transcrição (por exemplo,Pax3 ou Myf5) ^1-3, ou por exposição a condições específicas de cultura ^4-5.

Temos anteriormente mostrado que o componente de SWI / SNF, BAF60C (codificado por SMARCD3), é um componente essencial da maquinaria transcricional que permite a activação mediada por MyoD de loci específicos do músculo ^6. Descobrimos recentemente que a ausência selectiva de BAF60C confere hESCs para a resistência à activação mediada por MyoD de tecido muscular esquelético ⁷ que é de outro modo observada no BAF60C expressando células somáticas ^8-10, num processo vulgarmente referido como conversão miogénica. Expressão forçada de BAF60C permite MyoD ativar diretamente tecido muscular esquelético em hESCs, mediante condições específicas de cultura, com BAF60C e MyoD impor uma assinatura epigenética que comete hESCs para a linhagem miogênica ^7. De nota, a análise proteômica anterior revelou a ausência seletiva de BAF60C, entre os componentes SWI / SNF, na CES ^11. Nós usamos este conhecimento para impor um compromisso epigenética de hESCs na linhagem miogênica, levando à geração de uma população homogênea de mioblastos esqueléticos que podem ser agregados para formar contrátil tridimensional estruturas (myospheres) que funcionalmente imitam músculos esqueléticos miniaturizados ^7. Na verdade, o nosso método de gerar progenitores musculares esqueléticas de hESCs conta com o compromisso de epigenética hESCs à linhagem miogênica, que é fenotipicamente latente até que as células são expostas a sinais de diferenciação, tais como células agregação e cultura em meio de diferenciação (ver protocolo específico). Esta estratégia permite a expansão de uma população homogénea de hESCs que estão comprometidos com a linhagem epigenètica músculo esquelético e adequado para a formação de myospheres contrácteis tridimensionais que recapitulam histológica e as propriedades funcionais de esqueléticomúsculos. Os myospheres fornecem a primeira evidência de músculos miniaturizados exploráveis ​​por uma "doença em um prato de" modelo de doenças musculares. Quando gerada a partir de pacientes provenientes iPSCs, estes myospheres têm o potencial para elucidar questões de desenvolvimento de longa data e patogênese de doenças raras, além de oferecer o enorme potencial como ferramenta de alto throughput screening de compostos terapêuticos. Observamos também que uma leitura imediata de análise myosphere poderia ser fornecido por imuno-histoquímica em seções, como descrito em um protocolo JOVE por ¹² Gomes et al.

1. Infecção de hESCs

Este protocolo requer alta lentivírus titulação codificação BAF60C e MyoD ^13. Estas construções estão disponíveis mediante solicitação.

1. Recomendações antes de iniciar
   1. A fim de assegurar uma elevada eficiência de infecção, hESCs placa para infecção em condições livres de alimentação (Figura 2A) para eliminar concorrentes celulares durante a absorção do vírus. De fato, MEFs são notoriamente mais fácil para infectar, em comparação com hESCs e são competentes para a conversão mediada por MyoD. Assim, eliminando MEFs a partir de culturas de hES aumenta a taxa de infecção.
   2. Recomenda-se a ter os lentivírus título elevado para garantir uma elevada eficiência de infecção. Opções para melhorar a eficiência de infecção são discutidos na seção "verificando a infecção".
   3. Prepare a placas revestidas com matrigel por adição de 1 ml de 1 mg / ml de Matrigel em cada poço e deixar pelo menos 1 hora à temperatura ambiente (ou S / N selado a 4 ° Cse preparado no dia anterior).
2. Procedimento Infecção
   1. Dia antes da infecção
      1. Adicionar hES celular clonagem e recuperação suplemento no meio de diluição de 1.000 X (2 mM de concentração final).
   2. Dia 0 - Infecção por BAF60C
      Nota: Execute a infecção de hESCs com BAF60C primeiro, seguido por infecção com MyoD.
      1. Dissociar um poço de uma placa de 6 poços de hESCs cultivadas como colónias em ¹⁴ uma suspensão de células individuais por incubação com 1 ml de TrypLE para 5 min a 37 ° C.
      2. Transferência de suspensão para um tubo de 15 ml, adicionar 9 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas e centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm.
      3. Durante a centrifugação, preparar a mistura de infecção em um tubo limpo pela adição de 1 ml de mTeSR1, polibreno (6 mg / ml) e hES celular clonagem e recuperação de suplemento (2 mM).
      4. Re-suspender o sedimento de células (cerca de 5 x 10 ⁵ x 10 -1 ⁶ células de um confluent bem de hESCs) com 1 ml de mistura de infecção e da placa para uma placa de fixação de 6 poços de baixo, o que impede que as células de aderir ao plástico.
      5. Adicionar BAF60C-IRES-GFP vírus em 10 ⁸ MOI e incubar 3 horas na incubadora
      6. Recolha a suspensão de células contendo vírus e dividir igualmente em duas cavidades revestidas com matrigel. Em seguida, adicionar 2 ml de mTeSR1 + hES celular clonagem e recuperação suplemento a cada poço e deixou S / N na incubadora.
   3. Dia 1
      1. Retire cuidadosamente o meio contendo o vírus e substituir com 2 ml de mTeSR1and hES celular Clonagem e Recuperação Suplemento. As células começarão a aglutinação, como mostrado na Figura 2B.
   4. Day2 - Infecção por MyoD
      1. Antes de continuar verifique o status de fluorescência das células sob um microscópio de fluorescência para certificar-se de ter uma alta eficiência de infecção. Se não, veja a seção "verificando infectarion ".
      2. Se as células atingiram pelo menos 80% de confluência, proceda da seguinte forma; caso contrário, esperar por mais um dia antes de prosseguir.
      3. Retire a médio e adicione 1 ml de reagente TrypLE dissociar as células. Incubar 5 min a 37 ° C.
      4. Repita conforme descrito from1.2.2.2 - 1.2.2.6 acrescentando vírus MyoD em 10 ⁸ MOI.
   5. Dia 3
      1. Retire cuidadosamente o meio contendo o vírus e substituir com 2 ml de mTeSR1and hES celular Clonagem e Recuperação Suplemento.
      2. MEFs placa em placas revestidas com matrigel a 2,5 x 10 ⁵ / cm ² para o dia seguinte, para permitir a propagação das células infectadas.
   6. Dia 4
      1. Retire a médio e adicione 1 ml de reagente TrypLE dissociar as células. Incubar 5 min a 37 ° C.
      2. Transferir as células num tubo de Falcon de 15 ml, adicionar 9 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas e centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm.
      3. Remover o sobrenadante e re-suspensão em 6 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas.
      4. Remover o meio do MEFs contendo placa de 6 poços e hESCs placa na razão de 1:2 de divisão, dispensando 3 ml para cada MEFs contendo bem.
         Dica! Quando as colônias atingir confluência, alguns dos poços de células MyoD/BAF60C-infected pode ser congelado em nitrogênio líquido como um estoque de reserva. Meio de congelamento inclui 90% dos KOSR e 10% DMSO mais 2 hES mM celular Clonagem e Recuperação Suplemento. Os restantes poços pode ser, em seguida, exposta ao protocolo de diferenciação - ver abaixo a descrição. Se mais células são necessárias para produzir mais myospheres, hESCs infectadas podem ser propagadas ainda como se segue:
      5. Remover o meio e incubar com 1 mL de 1 mg / ml de colagenase IV, durante 5 min a 37 ° C.
      6. Remover colagenase IV e adicionar 1 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas.
      7. Sob um microscópio de dissecação raspar as colônias com uma gorjeta de 10 ml.
      8. Recolher os pedaços de colonizaçãoes em um tubo de 15 ml e permitem-se sedimentar durante 3 min. Em seguida, retire o sobrenadante, ressuspender em hESC médio e placa em MEFs placas usando uma proporção 01:04.
3. Verificando infecção
   1. Enquanto propagação das células, recomenda-se ao prato as células infectadas em menor escala para a colheita para análise RNA e realizar a análise de expressão de proteínas por imunofluorescência, a fim de verificar a existência de biomarcadores que reflitam o estado biológico adequada em cada estádio (ver resultados representativos). Para lentivírus título elevado a percentagem de células infectadas esperados deve ser, pelo menos, 80%.
   2. Para garantir uma elevada eficiência, os vectores lentivirais podem ser modificados, a introdução de um marcador de selecção de fluorescência e / ou uma resistência a antibióticos. Nossa plasmídeo lentiviral expressando BAF60C também transporta fluorescência da GFP.
   3. Triagem hESCs para um marcador fluorescente. No caso de baixa eficiência de infecção é recomendado o uso de fluorescência de umacélulas ctivated (FACS-ordenação) para enriquecer as células que expressam vírus BAF60C e depois infectar as células com altos títulos de vírus MyoD.
      1. Adicionar hES celular Clonagem e Recuperação Suplemento no meio do dia antes da ordenação.
      2. O dia da triagem, dissociar as células por TrypLE (como descrito no dia 0) e voltar a suspender as células em soro KO substituição mais hES celular clonagem e recuperação suplemento em FACS-tubos.
      3. No final da triagem, recolher as células em soro KO substituição e placa em MEFs placas adicionando hES celular clonagem e recuperação de suplemento.

2. EB-como indução e Diferenciação

1. Procedimento de indução e diferenciação
   1. Dia 0 - indução EB
      1. Certifique-se, antes de iniciar a diferenciação de BAF60C/Myod-infected hESCs, ter elevado número de colônias no poço (Figura 2C).
      2. Para cada poço remover o meio, lava-se com PBS e adicionar 1 ml de 1 mg / ml de colagenase IV. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
      3. Remover colagenase e adicionar 1 ml de meio de EB.
      4. Sob um microscópio de dissecação rapidamente dissociar mecanicamente as colônias em 400-800 agregados celulares raspando com uma gorjeta de 10 ml.
      5. Recolher os pedaços de colónias em um tubo de 15 ml e deixa-se sedimentar durante 3 min. Retirar o sobrenadante, re-suspensão em 3 ml de meio EB e transferir a suspensão de células para um poço de uma placa de 6 poços de baixo anexo.
   2. Dia 1
      1. Verifique o tamanho das colônias e da morte celular antes de prosseguir. Se pedaços grandes estão presentes, quebrá-los cuidado pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 5 ml, 3-4 vezes. Se a morte celular é muito alta (muitas células flutuantes e detritos) substituir o meio, recolhendo os agregados num tubo de 15 ml, por gravidade e placa-los com 3 ml de meio EB fresco, caso contrário, proceder da seguinte maneira.
      2. Adicionar 1,5ml de meio fresco EB nos poços
   3. Dia 2
      1. Mude o meio, recolhendo os agregados dos poços em um tubo de 15 ml. Deixe que eles se contentam com 2 min.
      2. Retirar o sobrenadante, substitua com 3 ml de meio fresco e EB redistribuir sobre os mesmos poços.
   4. Dia 3
      1. Adicionar 1,5 ml de meio EB fresco nos poços.
   5. Dia 4
      1. Proceder conforme descrito em "Day 2".
   6. Dia 5 - diferenciação miogênica de clusters EB-like (Figura 2D).
      1. Recolher os agregados, como descrito em 2.1.3.1 e lavar uma vez com 2 ml de PBS; permitir que o agregado para sedimentar.
      2. Remover PBS e adicionar 3 ml de meio de DM; placa nos mesmos poços.
   7. Dia 6 - Dia 20
      1. De d6 para d20 substituir o meio com meio fresco a cada 3 dias. Myospheres representativos são mostrados no Figura 2E.
2. Verificando diferenciação myosphere
   1. Antes de prosseguir, recomenda-se verificar a eficiência de diferenciação miogênica nos myospheres fazendo seções dos myospheres embutidos em composto OCT, conforme descrito em um protocolo de ¹² Jove anterior. Executar uma técnica de imunofluorescência para marcadores miogênicos como myognenin (F5D clone, DSHB) e da cadeia de miosina pesada (MF20 clone, DSHB) (ver resultados representativos).
      TIP! Para ter sucesso com a coloração para miogenina em secções de EB é crítico para executar a recuperação de antigénio por tratamento com sulfato de dodecil de sódio (SDS) a 0,5% durante 5 min. Além disso, é possível usar este protocolo para a coloração dupla utilizando anticorpos F5D e MF20.

3. Receitas Mídia

1. Médio ESC
   DMEM-F12
   1 mM de L-glutamina
   20% Knockout Serhum meio de substituição (KOSR)
   0,1 mM de aminoácidos não-essenciais (NEAA)
   50 U / ml de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep)
   0,1 mM de beta-mercaptoetanol
   Factor de crescimento de 8 ng / ml de base de fibroblastos (bFGF)
2. Médio EB
   DMEM F12
   1 mM de L-glutamina
   15% de FBS
   5% Soro de Cavalo
3. Médio DM
   DMEF F12
   1X SEU Liquid Media Supplement
   1X Suplemento N-2

A Figura 1A apresenta um esquema do protocolo proposto para gerar myospheres de hESCs. Os passos críticos de controlo (indicados pelas setas) é a eficiência da infecção em hESCs e a conversão miogénica dentro dos myospheres.

Em nossos experimentos, tirar proveito de um vetor de codificação BAF60C lentiviral que carrega GFP fluorescência. Nós normalmente infectam as células com BAF60C e FACS tipo 72 horas após a infecção para enriquecer a população que expressa BAF60C. Quando as células atingem em torno de 70-80% de confluência, nós infectar com MyoD lentivírus. Após a primeira infecção normalmente leva dois ou três dias para que as células atingissem que confluência.

A Figura 1B mostra os níveis de genes exógenos como a dobra de indução em relação aos hESCs não infectadas expressão. Figura 1C mostra a expressão e distribuição ao nível das proteínas dos factores introduzidos. BAF60C expressão é apresentado como a GFP de fluorescência, enquanto que a expressão de MyoD é detectado por imunofluorescência com um anticorpo MyoD. Consideramos dia 0 o dia em que começar a diferenciação de hESCs infectados em agregados EB-like. Após 15 dias em meio MS, uma porção dos myospheres (usualmente um poço inteiro) é incorporado em OCT composto ¹² e seccionados para realizar imunofluorescência para marcadores miogénicas para verificar a eficiência da conversão miogénica. Figura 1D mostra a coloração representativo para miogenina e de miosina de cadeia pesada em uma diferenciação miogênica ideal. Myospheres pode ter formas diferentes ou incomuns, talvez como resultado da fusão com myospheres menores. A partir do dia 10, é possível observar a contracção esporádicos nas myospheres (ver filme 1 e 2).

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Figura 1. UM) esquemática do protocolo utilizado para a geração de myospheres de hESCs. B) os níveis de mRNA de genes exógenos em hESCs infectadas com BAF60C e MyoD (H9-BM) monitorizada por qRT-PCR e expressa como a indução de dobragem, como comparado a zombar hESCs infectados imagens (H9-CTR). C) imunofluorescência que apresentam coloração MyoD (vermelho) e fluorescência BAF60C (verde) devido ao elemento IRES-GFP no vetor. D) Imunofluorescência realizada em myosphere secções marcadas para Miogenina (MYOG ), miosina pesada Cadeia (MyHC) e contrastado para DAPI (ver detalhes de imunofluorescência). Barra de escala é 100 mm.

Figura 2. Imagens representativas de aparecimento de células em diferentes fases doprotocolo da infecção (parte I) para a diferenciação (parte II). Escala da barra é 100 um. Considerando EB-estruturas, como a partir de d1 a d5 são em sua maioria de forma circular (D), myospheres cultivados ao longo de 15 dias de acordo com o esquema na Figura 1A apresentar uma forma imprevisível e são heterogêneas em cultura; veja dois exemplos em E e F.

O protocolo proposto aqui descreve como gerar agrupamentos tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres) diretamente do hESCs. A estratégia proposta tem o potencial sem precedentes e extraordinário para a produção de mini músculos em suspensão que pode ser apropriado como uma "doença em um prato de" modelo para ambos os ensaios de avaliação e estudos de desenvolvimento. Além disso, o método para gerar myospheres de hESCs é simples e não requer qualquer passo de triagem FACS durante a diferenciação, o que tipicamente tem um impacto negativo sobre o rendimento das células recuperadas. Além disso, um procedimento de classificação durante a diferenciação iria interferir com a agregação, uma vez que implica uma dissociação da EB em células individuais.

O método proposto é baseado na reprogramação epigenética de hESCs de factores específicos, MyoD e BaAF60C, que não são expressos em células-tronco embrionárias pluripotentes. MyoD e BAF60C fornecer o "core" da proteína ª complexoem marcas loci genômico a partir do qual procede a transcrição para ativar o programa miogênica esquelético. Os dois factores são entregues às células por meio de infecções lentivirais e, por conseguinte, é essencial para obter uma elevada eficiência de infecção de ambos os factores em todas as células. Isto pode ser conseguido através da utilização de vírus com título elevado ou vírus dotados de marcadores de selecção. As condições de cultura, também desempenham um papel importante na optimização da extensão da diferenciação miogénica. Propomos um protocolo de diferenciação à base de soro para a diferenciação de MyoD/BAF60C expressando hESCs em conjuntos de precursores miogénicas, seguido por incubação em meio definido isento de soro (contendo transferrina insulina - STI) para alcançar a conversão de precursores miogénicos em miotubos esqueléticos. No entanto, é possível que outros meios definidos pode atingir uma diferenciação miogénica igual ou melhor. Uma limitação de corrente de que o protocolo é que ele se baseia na utilização de soro fetal de bovino, o qual, além de contering muitas proteínas animais e substâncias, mostra as variações de lote para lote. Isso pode resultar em menor eficiência ou heterogeneidade de conversão miogênica dentro myospheres. De notar que nem todas as estruturas de EB-como derivados de BAF60/MyoD-expressing hESCs são myospheres; ou seja, alguns estão agregados EB-como inteiramente compostas de miofibras. O número de myospheres normalmente derivadas hESCs expressam BAF60C MyoD e pode variar de 30 a 60%, tal como estimada por imunocoloração em secções EB realizadas no final do protocolo (ver Resultados). Uma abordagem potencial para o enriquecimento de um prato de cultura para apenas myospheres seria a utilização de um repórter miogénica. Isso facilitaria descartando os clusters EB-como parcialmente ou não diferenciados e selecionando apenas os myospheres.

Por último, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes às exigências temporais dos factores introduzidos seria útil para melhorar o método de administração. Por exemplo, se BAF60C e MyoD são necessárias apenas para shmomento ou a "chutar" as células na direção certa, métodos baseados na entrega mRNA modificado pode ser aplicada. Por outro lado, se os factores são necessários para um tempo mais longo antes de as células de explorar as suas proteínas endógenas, uma abordagem epissomal seria recomendada para eliminar a variabilidade e efeitos não controlados devido a integração no genoma. Finalmente, observa-se que é imperativo para expressar BAF60C antes ou ao mesmo tempo que MyoD (nunca depois), a fim de obter a conversão hESC em músculos esqueléticos. A exigência de expressão antes de BAF60C depende presumivelmente sobre o seu papel na pré-configuração da paisagem epigenética para o bom distribuição MyoD cromatina através do genoma ^6,15. Como tal, os futuros protocolos pode ser melhorada através de compostos ou outras manipulações que promovem a expressão BAF60C em hESCs.

Não temos nada a divulgar.

PLP é um Investigador Associado do Centro de Investigação em Saúde da Sanford Children. Este trabalho foi suportado pelos seguintes subvenções a PLP: R01AR056712, R01AR052779 e P30 AR061303 do Instituto Nacional de / Instituto Nacional de Artrite e musculosqueléticas Saúde e Doenças da pele (NIAMS), MDA e Sanford Children prêmio Health Research. Este trabalho tem, em parte, beneficiaram de financiamento da investigação de Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia no projeto FP7-Saúde - 2009 ENDOSTEM 241440 (Ativação da vasculatura células-tronco associadas e células-tronco musculares para a reparação e manutenção do tecido muscular) SA foi apoiado por. comunhão CIRM.