Изучение взаимодействий

Мы представляем методы для изучения эффект PSMs и других токсинов выделяемый Золотистый стафилококк На нейтрофилах использованием проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии.

Мы представляем методы для изучения влияния фенола растворимые модулинов (PSMs) и другие токсины, вырабатываемые и выделяемые золотистый стафилококк на нейтрофилы. Для изучения влияния PSMs на нейтрофилы мы изолируем свежих нейтрофилов использованием центрифугирования в градиенте плотности. Эти нейтрофилы загружаются с красителем, который флуоресцирует при мобилизации кальция. Активацию нейтрофилов PSMs инициирует быстрое и кратковременное повышение в свободном внутриклеточной концентрации кальция. В эксперименте проточной цитометрии этой быстрой мобилизации может быть измерена путем мониторинга флуоресценции предварительно загруженных краситель, который реагирует на повышение концентрации свободного Ca2 ^+. С помощью этого метода можно определить PSM концентрации, необходимой для активации нейтрофилов и измерить эффекты конкретные и общие ингибиторы активации нейтрофилов.

Чтобы исследовать экспрессию PSMs в межклеточном пространстве, шэлектронной построили репортер слитых от промотора из PSMα оперон, чтобы GFP. Когда эти репортером штаммы S. стафилококк фагоцитированы нейтрофилах, индукция выражение может быть, наблюдаемые с помощью флуоресцентной микроскопии.

Нейтрофилы (PMNs) профессиональные фагоциты, которые играют ключевую роль в врожденную иммунную ответ против золотистый стафилококк ^1. Постоянном битве между хоста и микроба привела к гонки вооружений того и другого. В последнее время сообществу-связанного (CA) штаммов Meticillin устойчивыми штаммами S. стафилококк (MRSA) появились, которые, кажется, очень эффективным в обход Совета нейтрофилом убийству ^2,3. Чрезмерные фенолом растворимые модулин (PSMs) производство CA-MRSA была связана с более высокими вирулентности ^4,5. Человека нейтрофилах могут распознать эти PSMs через FPR2, которые приводят к активация этого G-белком рецептор ^6. Один из самых ранних событий является мобилизацией внутриклеточного МАГАЗИНЫ кальция (Ca ^{2 +).} Са ^{2 +} выступает в качестве вторичного посланник для разнообразие эффекторных функций из PMNs в том числе дегрануляции и фагоцитоз ^7. Поэтому Ca ^{2 +} является очень чувствительным индикаторомфункциональную способность PSMs, чтобы активировать PMNs. Для изучения эффекты из PSMs на нейтрофилах, свежий нейтрофилы изолированы и загружается с краситель, который флуоресцирует на мобилизации кальция. В эксперименте по проточную цитометрию эту быстрой мобилизации может быть измерена. Используя этот метод, оно является возможным изучать прямые эффекты из токсичные и с другими компонентами на нейтрофилы, и определить самую низкую концентрация, при которой эти являются активными. Для нас это является очень полезный инструмент, чтобы изучения влияния многих белки, продуцируемые S. стафилококк, участвующих в иммунном уклонением, такие, как FPR2 ингибиторного белка (FLIPR) ^8, FLIPR-подобный ^+7, и Хемотаксис ингибиторного белка из золотистый стафилококк (CHIPS) ^9. Все эти белки, были показанный, чтобы ингибировать кальций мобилизация в нейтрофилах путем связывания с рецептор признавая агонистом.

В последнее время наша группа описано, что PSMs являются функционально ингибируются сывороточные липопротеины ^{+10 <}/ Вир>. Эти липопротеины в большом количестве присутствуют в пределах в кровь и человеческой ткани, указывая, что PSMs оказывают свое функция в первую очередь в внутриклеточный окружающую среду. Доступность из анализе мобилизацию кальция позволила нам точно измерить эффект из сывороточные липопротеины на активации нейтрофилах по PSMs, на что указывает значительный ингибирование с помощью очень низких концентрациях из сыворотке крови.

Так как PSMs являются функционально ингибируется при добавлении сыворотки к мы предположили, что там является важной функцией для PSMs как внутриклеточные токсинов. Поэтому мы стремились, чтобы определить роли PSMs после того, как фагоцитоза. Чтобы исследовать выражением PSMs в межклеточном пространстве, мы построили репортером слияний от промотора из psmα оперон, чтобы GFP. Когда эти репортером штаммы S. стафилококк были фагоцитированы нейтрофилах, индукция выражения мнения было наблюдаемыми с помощью флуоресцентной микроскопии ^+10. Очевидно, что эта TEChnique позволяет изучением выражение из большого числа из гены в S. стафилококк или других патогенами после того, как фагоцитоза. Так как для S. стафилококк выживших в межклеточном нишу очень важна, чтобы преодолеть врожденная иммунная система ^{11 10 12,} изучая роли генов активированы в этой нише является высоко, важной для понимания его вирулентность.

1. Выделение PMNs из крови человека по центрифугирование в градиенте плотности

1. Draw 5 9 мл пробирках из гепаринизированной венозной крови.
2. Подготовьте двойной слой Ficoll градиенты (4 градиентов для +5 пробирки для крови) в качестве следующим образом: заливают 12 мл от плотности, +1,119 г / мл фиколл решение в 50-мл трубка и тщательно слой 10 мл от плотности, 1,077 г / мл фиколл решение на верхней части.
3. Разбавьте кровь с равным объемом из PBS.
4. Слой разбавленной крови тщательно на двойственной слой с градиентом Ficoll; 20-25 мл на градиентом.
5. Центрифугируйте 20 мин при 396 XG в качающуюся ротору ведро, +22 ° C без торможения.
6. Подготовьте холодный среде RPMI, содержащим 0,05% альбумина сыворотки человека, (среде RPMI-HSA). Также подготовьте 9 мл стерильной деионизированной H ₂ O. Предварительно-охлаждения обоих RPMI и H ₂ O на льду.
7. Аспирируйте верхний слой Ficoll содержащих плазму (желтый цветными), а также РВМС,,, а второй слой из Ficoll (белое цветными) с применением из вакуумным насосом (положить стерильный наконечник пипетки напипетке).
8. Соберите PMNs в 50 мл трубах с помощью небольшой пипетки пластиковые (1 трубка для PMN фракциях из каждые 2 градиенты), и разместите их на льду.
9. Добавить холодный среде RPMI-HSA до общего объема из +50 мл и центрифуги в течение 10 мин при 249 мкг в при 4 ° C.
10. Возьмите выключено надосадочной жидкости с использованием вакуумный насос и вихревой гранула мягко (эритроциты и PMNs).
11. Добавить 9 мл стерильной деионизированной H ₂ O и включите таймер. Остановите гипер осмотический шок после 30 сек точно,, путем добавления 1 мл 10 раз концентрированных PBS. Примечание: 30 сек очень критичны.
12. Добавить холодный среде RPMI-HSA до общего объема из +50 мл и центрифуги в течение 10 мин при 249 мкг в при 4 ° C.
13. Возьмите выключено надосадочной жидкости с использованием помощью вакуумного насоса и собирать PMN гранула в 1 трубка с определенным объем (1-2 мл) среде RPMI-HSA.
14. Определить количество клетках и отрегулировать концентрацию до 1,10 ⁷ клеток / мл. В зависимости от донора, Выход выделенного PMNs будет BetweEN 5 х 10 ⁶ и 3 х 10 ⁺⁷ PMNs от каждой 9 мл пробирке с кровью

2. Проточной цитометрии Assay для Оценки мобилизации кальция в Человеческой PMNs

1. Нагрузка клетках (5 х 10 ⁶ клеток / мл) с 2 мкМ Fluo-3-AM в RPMI-HSA и инкубировать в течение 20 мин при комнатной качалки Температура медленно, использованием, например, качающейся платформе шейкер, защищен от светом.
2. В то же время подготовить серийным разведением (например, 3-сгиб) от стимул при 10x конечной концентрации. PSMα3 используется в этом протокол; тем не менее любой GPCR стимул, которая действует на нейтрофилах является подходящим.
3. Подготовьте 10-кратным концентрированный ингибитор из рецептор в среде RPMI-HSA. Когда ингибитор действует на стимул (например HDL на PSMα3), предварительно инкубируйте в 25 мкл стимул с равным объемом из ингибитор в течение 10 мин при комнатной температуре.
4. Вымойте клетки путем добавления 10 мл из среде RPMI-HSA и центрифуги в течение 249 мкг в при комнатной температуре. Ресуспендируют клеток до 5 х10 ⁶ клеток / мл.
5. Как раз перед эксперимент, разбавьте клетки к 2x10 ⁺⁶ клеток / мл в среде RPMI-HSA и добавить 200 мкл клеток-на одно трубка FACS. Разводненная PMNs являются очень хрупкими. Держать их слишком долго при этой концентрации приведет к автоматической активации; то же верно для энергичного встряхивания или пипетированием.
6. Прикрепите трубки к проточного цитометра, подождите 3 сек и начать приобретением. После фиксированного периода времени (например, 8 сек), сними трубке и быстро добавить 50 мкл стимулом к образцу. Немедленно повторно прикрепить трубке на держатель образца, и продолжить приобретением.
7. Начните с низкого тона и кончаться с самой высокой концентрацией из стимулу. Вымойте иглой проточного цитометра регулярно после каждого которым управляют, с RPMI-HSA.
8. Анализировать данными с потока программного обеспечения для анализа цитометрии. Сравните среднюю сигнала флуоресценции, прежде чем дополнение из стимулом к, что после того дополнение из стимула и используйте соответствующий положительные и отрицательные контроли для расчета переменного токаактиваций прочность для каждого разведения измерена.

Альтернативно, когда ингибитор действует на рецептор предварительно инкубируйте в клеток с ингибитора.

3. Флуоресцентный анализ Микроскопия Выражение GFP Бактерии после того, как Фагоцитоз по PMNs

1. Grow S. стафилококк штаммов, содержащих репортером конструкт интерес в течение ночи в бульон (с помощью антибиотиков, когда это требуется для поддержания репортер плазмиды),. В этом случае штаммом MW2 содержащий PSMα репортер GFP конструкцию используют ^10,, выращенного в в 50-мл пластиковую трубку с помощью 5 мл LB культуральной среде.
2. Чтобы удалить все GFP от O / N выражением, разбавить культурах, чтобы OD ₆₆₀ +0,01 и развиваться, чтобы OD ₆₆₀ 0,1. Redilute эту культуру 1:30, и контролировать показать рост до культуру не достигнет OD ₆₆₀ из +0,1. Соберите бактериями путем центрифугирования и мыть один раз в DPBS. Ресуспендируют в 1:10 от первоначального объема чтобы получить OD ₆₆₀ из 1,0, либо гпротрите его 5,10 ⁸ КОЕ / мл.
3. Смешайте бактериями (+1,10 ⁺⁷ / мл) с свежевыделенные PMNs (1.10 ⁺⁶ / мл) в среде RPMI-HSA (соотношение 10:1), в микропробирку объемом 1,5 мл и добавлять объединенной человеческой сыворотка до конечной концентрации из 10%. Дрожание при съемке Платформа для встряхивания на в течение 10 мин при 37 ° C, чтобы стимулировать фагоцитоза. Разбавьте PMNs загружается с бактериями до 5.10 ⁵ PMNs / мл, и пипетки 250 мкл в колодец из 8-луночных под патрон покровным стеклом.
4. Изображение PMNs с бактерии на микроскопом. Инвертированного микроскопа оборудованный с 40X/0.85 объективный NA хорошо работает, и должны быть заключенный в кожух в темную камеру окружающая среда, чтобы сохранить окружающую среду стабильно при 37 ° С. Приобретать изображениями в течение ряда предварительно заданные положения использованием камеры каждые 5-10 мин в обоих яркий поле, и канал GFP чтобы следовать GFP производство во времени.

Проточной цитометрии анализе для оценки мобилизации кальция в человеческих PMNs

Инкубирующие нейтрофилах с концентрацией серия из синтетический PSMα3 что приводит к быстрому активация как измерено кальций флюс, которая показана по увеличение в сигнале в FL-1. Предварительно инкубация из синтетический PSMα3 с помощью 0,01%, 0,1% или на 1% сыворотке крови человека значительно ингибировал способность вызывать кальций потоках (Рисунок 1).

Анализ GFP экспрессии в бактериях после того, как фагоцитозу PMNs с помощью флуоресцентной микроскопии

Фагоцитированы бактерии содержащий PSMα-GFP репортерной конструкции ⁺¹⁰ начала до флуоресцировать зеленый между 1 и 2 час после того, как фагоцитоз, что указывает на выражение из PSMα промотором. Бактерии за пределами нейтрофилах не флуоресцируют, или показать флуоресценция только после того, внеклеточный бактерии сформировали плотный микроколоний (Рисунок 2). Этиданные указывают на то том, что экспрессия PSMα является быстро переключаемыми от того, когда бактерии фагоцитированы PMNs.

Рисунок 1. Нейтрофильная активации с помощью PSMα3. Активации из Нейтрофилы по диапазоне концентраций от PSMα3, как измерено кальций мобилизации. Когда очень низкими количествами сыворотка, добавляются активации нейтрофилов ингибируется, и на уровне 1% сыворотка вряд ли любой активация является видимый по крайней эти PSMα3 концентрациями (Адаптировано из ссылкой 10).

Рисунок 2. Индукционная из выражение из PSMα после того, как фагоцитоза.Нейтрофилы было разрешено фагоцитируют S. стафилококк, содержащим репортерный конструкцию по настоящему промоутер из PSMα, слитые с GFP. Приблизительно 1 час после того, как старт из фагоцитоз внутриклеточное бактерии начинают, чтобы флуоресцировать зеленый, что указывает на выражение из PSM α оперон, тогда как бактерии за пределами нейтрофилом (#), не индуцируют экспрессию PSM α в этой таймфрейме (Адаптировано из ссылкой 10).

Рисунок 3. Схематическая модель экспериментов, выполненных. Нейтрофилы были изолированы и инкубировали с PSMs чтобы измерить активация эффект из этих небольших амфипатическими спиралей в анализе мобилизация кальций. Когда сыворотка было добавлено, то PSMs были нейтрализованы и больше не активировал нейтрофилами. Для изучения внутриклеточные Expression из PSMs, штамм, содержащий собой слияние PSMα-промоутер, чтобы GFP был смешан с сыворотке крови и нейтрофилах, чтобы позволить фагоцитоза. GFP выражением последовала используя время покадровой флуоресцентной микроскопии. Нажмите здесь,, чтобы увеличить рисунок .

В способах, описанных здесь некоторых шаги очень критическим. Мы будем выделить эти здесь.

Для изоляции нейтрофилах центрифугированием в градиенте плотности оно имеет важное значение, чтобы не потревожить слои, во время или после того, как центрифугирование шагов. Когда аспирацией нейтрофилах с помощью пластикового пипетка, убедитесь, что не сжать шар то время как в слой клеток,, как эжекции жидкости будет беспокоить слоями. Кроме того, визуально осмотрите гранула из нейтрофилах после того, как осмотический шок и центрифугирования шаге. Если гранулу-прежнему красный эритроцита лизис прошел не является достаточно эффективным, и ее следует повторить еще раз. Если это произойдет регулярно, увеличению время инкубации с помощью деионизированной H ₂ O на срок до пяти секунд, чтобы получить более полное эритроцита лизиса.

Для метода мобилизацию кальция оно имеет важное значение, чтобы иметь нейтрофилах, которые изолированы свежей. Как правило, клетки, которые были храниться в холодильнике, чтобыO длинных не будет реагировать как хорошо. Они либо, возможно, активированный уже вызывая уменьшение в эффекте из добавленный стимул, или умерли, а не будет реагировать вообще. Сильные агрегацию нейтрофилов является знаком, что они не являются свежей больше, и должно быть отброшены.

В микроскопию настройку несколько вещей, имеют важное значение. Чтобы быть в состоянии наблюдать увеличение из GFP внутри бактерии, необходимо, о том, что высоко стабильный GFP белок будет удален из бактерий путем несколько шагов, разбавления и рост в условиях, когда представляющего интерес гена экспрессируется на очень низком уровне или не на все. В нашем случае, так как оперон psmα выражается при высоких плотностях клетка ^+13, два постоянно повторяющихся шаги разбавление до того, клетки достигают середины логарифмического фаза являются достаточными. Также для этих экспериментов, это лучше, что нейтрофилах являются свежими, особенно, так как Вы, возможно, захотите чтобы следовать за ними в течение нескольких часов в микроскопе. Добавление пропидий йодид (PI) к среде RPMI-HSA буфер будет позволять визуализация из нарушение работы нейтрофилом мембрана с помощью экспрессии PSMs. Когда PI добавляется, убедитесь, что соответствующий фильтры доступны в микроскопе так что красные PI флуоресценции не вмешивается с зеленая флуоресценция GFP. Особенно, когда использованием длинных фильтры нижних частот для GFP, PI, безусловно, вмешиваться. Еще один интересный вариант заключается в использовании нескольких флуоресцентные журналистам в бактериях, такие, как хромосомная интеграция из CFP в сочетании с репортер GFP, что позволило бы для мониторинг всех бактерии с помощью конфокальной микроскопия,, где трудно, чтобы увидеть не-меченый бактериях. Кроме того, в широким микроскопию флуоресценции поле, используя нескольких этикеток имеет явные преимущества. Недостатком использования стабильными флуоресцентные журналистам как мы это делали является их стабильности. Очень медленных Оборот белка GFP допускает возможность лишь мониторинге с кнопкой ВКЛ-выключателя репортера, OFF-переключатель не может быть визуализированных легко. Для этой одна было бы нужно использовать СПЭей нестабильное конструкциями GFP, или использовать системой люминесценции выражением на питание от например, Lux оперон ^14.

Авторы заявляю, что у них нет никакого конкурирующие между собой финансовые интересы.

RN был частично финансируется за счет Марии Кюри европейские Re-интеграции грантов (ERG) из Седьмая рамочная Европейского Сообщества Программой, номером проекта 268324.