В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс

Имея небольшие прозрачные тела, хорошо документированный нейроанатомию и множество поддаются генетических методов и реагентов, C. Элеганс Является идеальной моделью для организма В естественных условиях Нейронов визуализации с использованием относительно простых, недорогих методов. Здесь мы описываем одно изображение нейрона в интактных животных взрослый с использованием генетически закодирована флуоресцентных индикаторов кальция.

Нематоды червя C. Элеганс является идеальной моделью для организма относительно простые, недорогие нейронов изображения в естественных условиях. Его маленький прозрачный корпус и простое, хорошо характеризуется нервная система позволяет идентифицировать и флуоресценции любого нейрона в интактных животных. Простые методы иммобилизации при минимальном воздействии на физиологию животного позволяет увеличить покадровой обработки изображений. Развитие генетически закодированный кальция чувствительной флуорофоры, такие как Cameleon ¹ и ² позволяют GCaMP в естественных изображений нейронов кальцием, касающихся как физиология клетки и активность нейронов. Многочисленные трансгенных линий выражения этих флуорофоров в конкретные нейроны являются доступными или могут быть построены с использованием хорошо известных методов. Здесь мы описываем подробные процедуры для измерения кальция динамику в пределах одного нейрона в естественных условиях, используя как GCaMP и Cameleon. Мы обсудим преимущества и disadvantвозраст обоих, а также различные методы подготовки образцов (животных иммобилизации) и анализа изображений. Наконец, мы представляем результаты двух экспериментов: 1) С помощью GCaMP для измерения сенсорные реакции конкретного нейрона на внешнее электрическое поле и 2) Использование Cameleon для измерения физиологической реакции кальция в нейрон травматического повреждения лазера. Кальций методы визуализации, такие как они широко используются в C. Элеганс и были распространены на измерения в свободном перемещении животных, несколько нейронов одновременно и сопоставления между генетического фона. C. Элеганс представляет собой надежную и гибкую систему в естественных нейронных изображений с преимуществами по сравнению с другими системами модель в технической простоте и стоимости.

Здесь мы приведем практические методы в естественных изображений кальция в C. Элеганс нейронов. Развитие генетически закодирована кальций-чувствительных флуорофоров с высоким отношением сигнал-шум делает C. Элеганс сравнительно простой и экономически эффективной системы для измерения нейрофизиологии и деятельности. Наши изображения осуществляется с помощью стандартного микроскопа соединения с использованием широкого поля флуоресценции обычно доступных флуорофоров. Мы представляем несколько методов с использованием различных флуорофоров и различные препараты образца, обсуждая сильные и слабые стороны каждого из них. Затем данные представлены в двух экспериментах пример. Отличный дополнительный ресурс на методы, описанные здесь, можно найти в WormBook, "Imaging активность нейронов и мышц» Р. Керр ( http://www.wormbook.org ) ^3.

Два основных классов генетическитически закодирована флуоресцентные журналистам кальция широко используются в C. Элеганс: GCaMP одного канала и FRET на основе Cameleon. Мы опишем методы и показать примеры данных, полученных в каждой.

GCaMP на основе модифицированного зеленого флуоресцентного белка (GFP), который является чувствительным к окружающим концентрации кальция. Это достигается путем слияния GFP и высоким содержанием кальция сродство белка кальмодулина, например, что связывание кальция кальмодулин приносит GFP молекулы в эффективных флуоресцентных подтверждение ^2. Последние достижения в этих флуорофоров генерировать исключительные размеры сигнала до 500% увеличение интенсивности флуоресценции более физиологическом диапазоне уровня кальция и достаточно быстро кинетики ~ 95 мс время нарастания и ~ 650 мс Время затухания ^4. За сравнительно короткие периоды времени (минуты), эти большие сигналы могут обеспечить более низкое разрешение изображения (нижняя увеличение), и, учитывая хорошо себя инициализацииIAL измерения базовой линии, свести на нет необходимость в непрерывном базовый или сравнительных измерений.

Cameleon имеет то преимущество, что FRET на основе флуорофором, который генерирует радиометрические измерения сравнении двух независимых каналов или длины волны ^1. Он состоит из двух отдельных флуорофоров (голубой и желтый-излучающих флуоресцентные белки, CFP и YFP), связанных белка кальмодулина. Комплекс подсвечивается синим светом (440 нм), которые возбуждают CFP. Связывание кальция приводит флуорофоров ближе друг к другу, увеличение флуоресценции резонансного переноса энергии (FRET) от CFP (донора) к YFP (акцептор) и вызывая CFP излучения (480 нм), чтобы уменьшить и YFP излучения (535 нм), чтобы увеличить . Относительный уровень кальция измеряется как отношение YFP ​​/ CFP интенсивности. Cameleon кинетики медленнее, чем GCaMP, измеренная в естественных условиях, чтобы иметь время нарастания ~ 1 сек, время затухания ~ 3 сек ^5. Тем не менее,отношение противоположно движущиеся сигналы увеличивает размер сигнал и компенсирует число возможных артефактов в связи с изменением концентрации флуорофора, движения или дрейф фокуса и отбеливание.

Генетически закодированный флуоресцентный журналистам отрицают большую часть подготовки образца необходимо с экзогенно вводили зонды и C. Элеганс небольшой прозрачный корпус позволяет изображений в интактных животных с помощью простых широкий флуоресценции поле. Основной технической проблемой в пробоподготовки поэтому безопасно иммобилизации животных. Есть целый ряд различных часто используемых методов каждого свои преимущества и недостатки. Использование фармакологических агентов, чтобы парализовать животных можно легко реализовать и позволяет монтаж нескольких животных на одного препарата (левамизол, холинергические агонисты, которое вызывает мышечную ткань, чтобы захватить как правило, используется ^6). C. Элеганс также может быть физически иммобилизованные путем установки ихна жесткий 10% агарозы ^{7, 8.} Это сводит к минимуму воздействие на физиологию животного, позволяет долгосрочное томография (часы) и восстановление нескольких животных, но является более технически сложными. Оба этих метода ограничить физический доступ к животным (которые находятся под крышкой скольжения) и поэтому могут быть использованы только с определенных экспериментальных стимулов (таких, как свет, температура, электрическое поле или лазерного повреждения). Для раздражителей, где физический доступ не требуется, такие как прикосновение или введения химических веществ, многие исследования успешно клееного C. Элеганс на месте (с помощью клея ветеринарной класс) ^9. Это технически более сложным, является одним подготовки животного и не позволяют животному восстановления. Наконец, многочисленные микрофлюидных устройства были заняты, что физически сдерживать C. Элеганс, сохраняя физиологии животных, позволяя воздействия большинства видов раздражителей (в зависимости от конструкции прибора) и может позволить быстрого обмена и восстановления животных ^{10, 11. Однако микрофлюидики требует дополнительных технических навыков и возможностей в области проектирования, изготовления и реализации. В иммобилизованных животных деятельность и стимул ответ в общем случае может быть измерена в сенсорной и интернейронов. Активность нейронов двигателя требует более сложных методов визуализации в движущихся животных. Здесь мы приведем подробные методы, использующие два наиболее простым методам фармакологической парализации и иммобилизации с жесткой агарозы.}

Методы, представленные здесь, могут быть использованы для измерения активности нейронов и клеточной физиологии C. Элеганс. Приведем пример каждого из них: использование GCaMP для измерения сенсорные реакции ASJ нейрона к внешним электрическим полем, и с помощью Cameleon для измерения физиологической реакции кальция лазерного повреждения нейронов. Эти примеры показывают, преимущества и недостатки двух типов флуорофоров и иллюстрируют, что это возможно с системой.

1. Оптическая установка

1. Используйте стандартный микроскоп соединения с эпифлуоресцентной возможности визуализации. Мы используем Nikon Eclipse Ti-U инвертированный микроскоп с Intensilight Просветитель HG.
2. Для достижения наилучшего изображения и качество сигнала использовать большое увеличение, высокое численное апертуре объектива. Обычно мы используем Nikon X60 1,4 NA нефти погружения цели. В некоторых случаях можно использовать более низкое увеличение (X40, X20) в зависимости от уровня экспрессии флуорофор и силы сигнала.
3. Используйте высокой чувствительности ПЗС-камеры охлаждается, таких как камеры Andor Клара максимально изображений чувствительности и минимизации фонового шума.
4. Для одного цвета флуорофоров использовать стандартный фильтр флуоресцентного микроскопа установлено предназначены для конкретной длины волны флуорофора. Для GCaMP использовать стандартный набор фильтров GFP оптимизирован для возбуждения при 488 нм и эмиссии при 525 нм. Никаких дополнительных оптических изменений не требуется.
5. Для логометрические флуорофоры, такие как Cameleon, используйте двойной системой визуализации, такие, что идентичные изображения могут быть одновременно захвачен в два отдельных длинах волн. Это достигается путем проецирования изображения двойной бок-о-бок на камеру. Простая настройка для достижения этой цели, используя основные оптические компоненты на оптический макет класса, показана на рисунке 1. Он состоит из:
   1. Микроскоп набор фильтров с 440 ± 20 нм фильтра возбуждения и 455 нм проходит дихроичным зеркалом.
   2. Изображение маски помещены в начальной плоскости изображения сразу за пределами микроскопа изображений порт (где датчик ПЗС-камеры, как правило, сидят). Это ограничивает поле зрения такова, что она заполнит только половина сенсора камеры. Размещение этой маской на первом плоскости изображения приводит к резкому границы изображения и не перекрываются, когда два изображения проецируются бок-о-бок.
   3. Первые линзы реле установить один фокусным расстоянием от тОн начальной плоскости изображения, такие, что коллимирует света.
   4. Дихроичным зеркалом, которое расщепляет свет в двух отдельных длинах волн изображений или каналов отражает один цвет (> 515 нм, желтый) при передаче другому (<515 нм, голубой).
   5. Выбросы фильтры (полосовой фильтр), что еще больше ограничивает проходящий свет на определенных длинах волн изображений (голубого при 485 ± 40 нм и желто при 535 ± 30 нм),
   6. Второй линзы реле (по одному на каждый канал), размещенных в пучке пути такова, что она перефокусирует свет на второй плоскости изображения на ПЗС-камеры.
   7. Пара зеркал и второй зеркальные направляет пучок путей таким образом, что два изображения рекомбинации и, по прогнозам бок-о-бок на датчик ПЗС-камеры. Рисунке 4а приведен пример результирующего изображения.
6. Начальная оптическая Выравнивание: Начать установку и выравнивание оптики с высоким контрастом мнимойE Использование низких увеличение объектива и передается широким полем света освещения (черный шулер нарисованные на стекле микроскопа работает хорошо). Принесите изображение, чтобы сосредоточиться через окуляры микроскопа, а затем перешли к микроскопу порт, который будет использоваться. С высокой освещением просмотра изображения на карточках на начальном фокальной плоскости (несколько сантиметров за пределы микроскопа порт). Поместите первый объектив реле (C) на пути луча, что он является одним фокусным расстоянием от начальной фокальной плоскости и коллимирует свет, а не отклонения луча (т.е. непосредственно в центре луча). Поместите маску на первой фокальной плоскости, с учетом ограничить половины поля зрения и производить резкие границы в изображении. Установите зеркала и фильтры (D, E, G) такая, что луча остается параллельно поверхности стола и работает в двух параллельных путей бок-о-бок, как показано на рисунке 1b. Центр второй линзы реле (F) в своих путях пучка иперемещать их вперед и назад вдоль путей довести изображений акцент на карточку помещается были Датчик ПЗС-камерой будет. Если все сделано правильно два изображения должны быть парфокальное с микроскопом окуляров и других портов камеры. Наконец поместите камеру в нужном положении и тонкой настройки выравнивания.
7. Тонкая настройка оптического выравнивания: Используйте двойные изображения рассматриваются ПЗС-камеры для тонкой настройки оптического выравнивания. Используйте высокую контрастность изображения и начать с более низким увеличением, переход на более высокое увеличение для окончательного выравнивания. Установите передаваемого изображения (голубой канал в рис. 1б), чтобы покрыть половину поля зрения камеры, перемещая камеру в позиции X и Y. отраженного изображения (желтый канал в рис. 1б), чтобы покрыть другой половине поля просмотреть, регулируя последние два зеркала (G) в его луча. Оптимизирует фокус, перемещая второй линзы реле для каждого канала взад и вперед вдоль луча. Если леваянеизменном оптические установки должны быть стабильными и требуют только редкие тонкой настройки мелодии.

2. Подготовка проб и сбора данных.

1. Приобретать животных выражения кальция чувствительной флуорофора в нейрон представляет интерес с Caenorhabditis генетический центр (CGC) или других источников. Кроме того трансгенные животные могут быть построены с использованием стандартных C. Элеганс техники. Одноместный экспрессии в клетках не требуется (а иногда и не желательно, если несколько нейронов, которые должны быть исследованы, см. ¹²⁾ до тех пор, изображений и измерения из нескольких ячеек можно легко отделить. Если трансген флуорофора не интегрируются в геном, значительные различия в выражении может происходить от животного к животному. В этом случае предварительного отбора животных с более высокими уровнями экспрессии с помощью флуоресцентного микроскопа рассекает повышает отношение сигнал-шум и улучшает измерений. Флуорофора уровни экспрессии в девичествеD будет достаточной, чтобы быть легко полученную с камеры при приобретении параметры, необходимые для эксперимента.
2. Сделать агарозном колодки, необходимые для желаемой техники иммобилизации (см. п. 2.3 ниже), нажав на маленькую каплю расплавленного агарозном между двумя стеклами, разнесенных на две части лабораторных ленты. Если необходимо, агарозы колодки могут быть переданы на покровным стеклом перед установкой животных. См. Рисунок 2.
3. Остановите C. Элеганс для визуализации с использованием одного из следующих методов:
   1. Фармакологические парализации: Добавить 0,05% Левамизол до 2% агарозном колодки (смешивая его в расплавленную агарозу до принятия прокладки в 2,2). Возьмите 5-10 животных на площадку и накрыть покровным стеклом. Нанесите небольшое количество горячей смеси воска (50% парафина и 50% вазелина), чтобы углы покровного стекла, чтобы удерживать его в этом положении. Разрешить 5-10 мин для Левамизол вступили в силу и животные бecome совершенно неподвижно.
   2. Жесткая иммобилизация агарозы: C. Элеганс может быть физически иммобилизованные использованием жесткой 10% агарозы колодки и 0,05 мкм диаметр наночастиц полистирола. Сделать 10% агарозы колодки (10% агарозы в буфере NGM по весу), как и в 2.2. Добавить ~ 3 мкл борта решение (1:10 полистирольных микросфер в NGM по объему) в верхней части панели. Быстро подобрать 5-10 C. Элеганс в бассейн из бисера решение на площадку и аккуратно накрыть крышкой скольжения. Используйте расплавленный воск применяется к углам крышки скольжения держать его в нужном положении. (Дополнительную информацию об этой технике см. ^7, а также предыдущую статью Юпитера ⁸⁾
   3. Склеивание: C. Элеганс можно приклеить на место с помощью небольших количеств ветеринарных класса клей наносится на одну сторону животного.
   4. Микрожидкостных устройств: многочисленные микрофлюидных устройства были разработаны, чтобы физически удерживайте клавишу C. Элеганс на место для работы с изображениями.
4. Поместите подготовленные слайды на микроскоп и сосредоточиться на нужный нейрон. Зачастую легче всего найти C. Элеганс использованием яркого освещения поля и малом увеличении. Затем переходят на больших увеличениях и флуоресцентной микроскопии, чтобы найти и сосредоточиться на конкретных нейронов.
5. Стимул: Если нейронов ответ на конкретный стимул нужен (свет, электрическое поле, вкусовых и обонятельных сигналов, температуры и т.д.), стимул аппарат должен быть разработан в микроскоп настройки, так что он может быть введен животных в пробоподготовка в то время как изображения.
6. Получить изображения с помощью камеры микроскопа CCD. Выдержка времени и уровня возбуждения светом будет зависеть от сигнала базовой и уровень экспрессии флуорофором, с более слабыми сигналами, требующих более длительного времени экспозиции с согласованно меньше времени разрешение. Обычно мы используем ~ 300 раз мс экспозиции.
7. Получение изображений либо индивидуально, либо в качестве тиМне покадровой фильма. Поскольку C. Элеганс нейроны обычно проявляют медленной динамики активации (т.е. им не хватает натрия на основе потенциалов действия), относительно медленный частота кадров ~ 1 сек часто являются достаточными для оценки динамики нейрона. Приобретение скорости до ~ 90 кадров в секунду были использованы хотя это может быть ограничен интеграция время, необходимое для слабой флуоресценцией. Индивидуальные фильмов одного нейрона может легко продлить на несколько минут (~ 5-10 мин) или дольше, если иммобилизации подготовки является стабильной и частотой кадров относительно медленно.

3. Анализ данных

1. Есть целый ряд различных флуоресцентных изображений пакетов программного обеспечения с динамическими и радиометрический анализ возможностей, включая ImageJ и NIS-Elements. Мы используем простой пользовательский MATLAB программа, которая измеряет среднее флуоресцентного сигнала в выбранной области интереса.
2. Для отдельных изображений (или замедленной фильмы, которые остаютсясовершенно неподвижно) выбрать область интереса (ROI) в пределах отображаемого нейрон и отдельная близлежащего региона для измерения фона. Для радиометрические изображения выберите аналогичный ROI и фон регионах для каждого из двойного изображения.
3. Незначительные движения отображаемого нейронов в замедленной фильм требует дополнительного анализа для автоматического выбора ROI в каждом кадре, что может быть выполнено с помощью многочисленных схем отслеживания объекта. Наша программа отображает сжатый образ всех образов в фильме, из которого неровной границей (охватывающей объект интересы во всех кадрах) вручную выбрать и независимый регион фона выбран. Для первого кадра, ROI вручную выбран из в границах региона. Для каждого последующего кадра, программа выбирает самые яркие пиксели внутри границы региона для создания ROI нужного размера (т.е. такое же количество пикселей в качестве учебного пособия первого ДО кадра). Для изображений, где объективнот интересов достаточно ярче окружающего фона в пределах границ области этот протокол выбирает разумные ROI для каждого кадра.
4. Флуоресцентный сигнал, F, для каждого кадра рассчитывается как средняя интенсивность пикселя в ROI минус средней интенсивности в области фона. Логометрический значения рассчитываются как отношение двух сигналов (YFP-YFP _фона) / (CFP-CFP _фоне) -0,65. Коэффициент 0,65 компенсирует кровоточить через CFP из канала в канал YFP, которая будет зависеть от флуорофоры, а также определенный набор фильтров используется (это значение обычно составляет ~ 0,6 для установки Cameleon).
5. Относительный уровень кальция для каждого кадра рассчитывается как процентное изменение интенсивности нормированная на начальное значение базовой измеряется с первого кадра (или серия кадров): f / F = (F (T)-F _о) / F _о, где F (T) является флуоресценция в момент времени T и F _Oначальное значение базового уровня.
6. ROI выбора тела клетки генерирует сильные самых надежных сигналов, но также можно выбрать и измерять сигналы от ROI вдоль нервных процессов.

4. Решение проблем

1. Отбеливание: Воздействие света возбуждения может привести к отбеливанию флуорофор и характеризуется устойчивым снижением сигнал, который зависит от уровня воздействия. Логометрический измерения помогают компенсировать это. Однако селективные отбеливания одной длине волны все еще может произойти (как правило, CFP отбеливателей быстрее, то YFP). Если отбеливание происходит уменьшить уровень освещенности за счет уменьшения времени экспозиции и / или интенсивности возбуждения (с фильтры нейтральной плотности в освещении пути). При необходимости, можно компенсировать обесцвечивание, запустив инсценированных судебных процессов (с тем же воздействием возбуждения нейронов, но не стимул) и количественной оценки постоянной времени спада сигнала.
2. Иммобилизация: Для простого анализа изображений, описанные здесь очень важно, животное все еще ​​остается сравнительно течение всего периода записи C.. Элеганс реагировать на освещенность и экспериментальных стимулов, что делает их, скорее всего, для перемещения во время записи. Незначительное движение может внести значительный шум в измерении особенно при измерении от аксона процессов. Логометрический анализ помогает смягчить эти последствия в некоторой степени и измерений от тела клетки являются более надежными. Тщательное исполнение и уточнение иммобилизации процедуры приведет к совершенно неподвижно животных.
3. Фон выбор: Тщательный подбор фона региона необходимо для успешного анализа изображений. Фон регионы должны быть достаточно однородным и темнее, чем отображаемого нейрона. Она должна быть достаточно удалена, чтобы избежать рассеянного света (и, следовательно, пикап сигнала) от отображаемого нейрона. Мы находим единый регион 20-50 мкм от ROI хорошо работает в большинстве случаев.
4. Логометрический Оптика: Правильное расположение изображений оптика имеет решающее значение для создания четкого двойное изображение. Коммерческая вложений микроскоп для логометрические изображений доступны. Альтернативный метод заключается в использовании быстрых последовательных изображений с помощью быстрого фильтра колесо, чтобы быстро переключаться между длинами волн излучения при записи отдельных изображений для каждого.
5. Логометрический анализа: анализ, описанный здесь, является относительно простой метод, который генерирует надежные сигналы в силу усреднения по ROI. Это требует распознать яркий объект, чтобы выбрать ROI. Более сложные радиометрический анализ возможной благодаря именно согласование и отображение двойного изображения, такие, что флуоресцентный отношение может быть рассчитано пиксель за пикселем.

Здесь мы приводим результаты двух отдельных экспериментов. Первые работают GCaMP для измерения реакции конкретных сенсорных нейронов, чтобы определить внешний стимул, давая хороший пример того, как флуоресцентные журналистам кальция может быть использован для оптического мониторинга активности нейронов у интактных C. Элеганс. Второй использует Cameleon для измерения внутриклеточного кальция срабатывает в течение переходного нейронов в ответ на конкретные повреждения лазера, таким образом, иллюстрирующий, как кальций физиология может быть измерена в пределах одной ячейки в естественных условиях. Чтобы сосредоточить внимание на технические аспекты каждого измерения индивидуальных результатов будут представлены и обсуждены в деталях. Часто средний отклик во времени (рассчитывается как среднее ответ в каждый момент времени по отношению к стимулу) или конкретной метрикой (таких, как средняя амплитуда ответа) рассчитываются через многочисленные испытания. Обычно 10-20 испытаний, необходимых для создания приемлемого измерения средней, но тего количество будет зависеть в собственной изменчивости отклика. Такой анализ данных для экспериментов обсуждаются здесь может быть найден в ¹² и ^13.

GCaMP измерения сенсорный ответ: Когда подвергаться сильным внешним электрическим полем (≥ 3 В / см), C. Элеганс активно ползти к отрицательному полюсу поля с точным направленное движение. Ранее мы показали, что это electrotactic поведение в первую очередь при посредничестве левой и правой нейронов ASJ, амфидов сенсорных нейронов, расположенных в голову животного ^12. Для визуализации этого ответа мы использовали трансгенных штамм выражения GCaMP3 в частности, в левой и правой нейронов ASJ под ГПа-9 промоутер. Мы иммобилизованных животных для визуализации с использованием агарозы колодки, содержащий 0,05% Левамизол зажатой между двумя покровные стекла (как описано в процедурах). Электрический стимул вводили с помощью пользовательского построен изображения камеры, которая умещается наэтап инвертированный микроскоп Nikon Ti (см. ^12). Короче говоря, подготовка покровного стекла помещают (с червем стороной вниз) над отверстием в небольшую пластиковую камеру разрешением доступа для целей снизу и стандартных изображений через крышку скольжения. Камера была наполнена 0,25 мМ NaCl и 50 мМ буфера глицерина и электрического поля, приложенного стимула с помощью двух платиновых электродов, выстилающих концах камеры. Как описано выше, одним нейроном ASJ выражения CGaMP было отображаемого использованием X100 1,4 NA нефти цели погружения и стандартной GFP набор фильтров. Покадровой фильм был приобретен за 80 сек (1 кадр / сек, 300 мс, время экспозиции), подвергая животных к внешнему 3 В / см электрического поля для трех отдельных испытаний каждая из которых длится 10 сек (рис. 3). Мы измеряли интенсивность флуоресценции на клетку тела, используя анализ изображения описанных выше. Видео отображается небольшая недостатки обоих движений и смещения фокуса в течение эксперимента. Йrength из GCaMP сигнала остается высоким, однако показывает большой ~ 250% увеличение флуоресценции в ответ как ^1-й и ^3-й раздражители. В результате со второй раздражители значительно снижается демонстрируют изменчивость в нейронную реакцию. Отбеливание минимальным, как видно по возвращении в последовательной базового уровня.

Cameleon измерения клеточной физиологии кальция: Травматическое повреждение клеток вызывает большие переходные кальция в нейрон, который играет важную роль в физиологической реакции диктует сотовой судьбы (то есть гибель клеток по сравнению с началом ремонтных процессов). Мы можем измерить эту повреждения вызванного ответа в естественных помощью фемтосекундного лазера разорвать отдельные C. Элеганс нейроны ^14, а одновременно измерение сигналов сотовой кальция использовании Cameleon YC3.60 ^{13, 15.} Животные выражения Cameleon YC3.60 в шести mechanosensory нейронов (подMEC-4 промоутер), были обездвижены, используя 10% агарозы и наночастиц полистирола, как описано в процедурах. Мы использовали двойной оптикой изображений для записи сигналов от обоих CFP и YFP флуоресценции каналов, как описано в процедурах. Мы отображаемого одного нейрона ALM и лазерных целевых аксона ~ 20 мкм от тела клетки (рис. 4а). Аксон был разорван кратким (<1 сек) воздействия света от фемтосекундного импульсного инфракрасного лазера фокусируется на целевой точки вдоль аксона по визуализации цели (см. ¹³ для подробной информации о лазерной хирургии). Покадровый изображения на кадр каждые 3 секунды, с 400 раза мс экспозиции были записаны на 320 сек при выполнении лазерной хирургии и кальция рассчитывается с использованием радиометрический анализ.

Сигналы были измерены независимо в теле клетки (рис. 4, б), и для сегмента аксона в течение 5 мкм разреза точке (рис. 4в). Цифры показывают, как CFP и YFP интенсивности, а также полученное FRET отношение. Измерения на теле клетки хорошо ведет себя с CFP быстро убывает и YFP растет в ответ на лазерное повреждение при Т = 0 сек (красная стрелка). Это приводит к немедленному ~ 200% увеличение логометрические сигнала (f / F), которая сохраняется в течение ~ 90 секунд, прежде чем упасть обратно в ближайшее базовых уровней. Отбеливание минимальным, как видно из последовательной линии.

В сегменте аксона близко к точке разреза, местные количество флуорофора изменяется в ходе эксперимента, усложняя сигнала. Лазерная хирургия разрывает аксонов и кратко разрывает мембраны, что позволяет избежать флуорофор и временно снижая его местные цитоплазматическая концентрация. Это видно из первоначального снижения в след YFP на рисунке 4С и сравнение сегменте аксона около повреждений точку в YFP изображений порой Т = 0 сек и т = 6 сек, рисунок 4А. В Ла-точками тер время, разорвала конца набухает в рамках своего продолжающегося восстановления, в результате более локализованной флуорофор и увеличением интенсивности. Это наиболее очевидно в медленно растущих CFP след на рисунке 4С и сравнение аксона сегмента в CFP изображений порой Т = 0 сек и т = 270 сек, рисунок 4А. Однако эти изменения влияют на обоих каналах одинаково и FRET отношение эффективно компенсирует. В результате измерения показывают ответ похож на тело клетки с непосредственным ~ 150% увеличение сигнала (f / F), драматический восстановление почти до отметки в ~ 90 сек, а затем дополнительно меньше вторичного ответа на ~ 150 сек. Радиометрический анализ является критическим для этого измерения, как это было бы чрезвычайно трудно отделить кальция сигнала от других эффектов, которые могут варьироваться в широких пределах от нейрона к нейрону и операции к операции. Аксону сигнал имеет больше шума по сравнению с сигналом тела клетки в основном за счет диммера флуоресценции именьше ROI в узком аксона.

Рисунок 1. Основные настройки и радиометрические оптики. А) На фотографии показана экспериментальная установка, состоящая из инвертированного микроскопа соединения и радиометрические оптики изображения. B) схема, иллюстрирующая изображений оптики, необходимых для логометрические FRET на основе измерений. Изображение делится на двух длинах волн или каналах, которые, по прогнозам бок-о-бок на ПЗС-матрицы.

Рисунок 2. Подготовка образцов. C. Элеганс монтируются в тонкие прокладки агарозы для работы с изображениями.) Агароза колодки сделаны сэндвич небольшую каплюрасплавленной агарозы между двумя микроскопа, разнесенных на две части лабораторных ленты. B) Животные переносят на площадку агарозы и покрыта покровным, удерживается на месте небольшое количество воска на каждый из четырех углов.

Рисунок 3. GCaMP данным примером. Сигнал GCaMP, f / F, записанных в естественных условиях от тела клетки нейрона ASJ отвечая на переменном включения / выключения электрического поля (зеленая линия). Толстые серые линии указывают на периоды, когда внешнее электрическое поле (3 В / см) была применена к животным. Шкала бар представляет собой 100%-ное увеличение интенсивности флуоресценции.

Рисунок 4. Данные Cameleon пример. А) Три отдельных кадров показывает двойное изображениеВид ALM нейрона до и после лазерной хирургии аксона 20 мкм от тела клетки. Красная стрелка в середине панели указывает точкой разреза. Нижняя панель показывает тело клетки и аксоны сегменте производства сигналов в B и C. B) Cameleon YC3.60 сигнала измеряется в тело клетки нейрона ALM до и после лазерной хирургии (красная стрелка). C) Cameleon YC3 0,60 сигнала измеряется в сегменте аксона в течение 5 мкм разреза точки до и после лазерной хирургии. Желтые следы указывают YFP сигналы, синие следы указывают CFP сигналов и оранжевые следы полученного FRET отношение. Часовой пояс относительно времени лазерной хирургии. Шкала баров представляют собой 100% увеличение интенсивности флуоресценции. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Генетически закодированный показатели кальция широко используется в C. Элеганс нейробиологии. Многочисленные группы использовали эти методы для изучения реакции первичных сенсорных нейронов на внешние раздражители, как показано здесь с ответом ASJ к электрическому полю. Известные примеры включают в себя ощущения механической связи, конкретных химических веществ, температура и электрическое поле, ^{12, 16-19.} Деятельность интернейронов и мышечных клеток были также мониторинг как в ответ на раздражители и в контроле за поведением животных. Многие из этих исследований подтолкнули этих методов еще один шаг с помощью технологии распознавания изображений и методов отслеживания, чтобы включить запись от нейронов в частично сдержанные или даже свободно движущихся животных, а также записи с нескольких нейронов одновременно. Дополнительные исследования изучали другие аспекты физиологии кальция, такие как реакция на повреждение нейронов ^{13, 20,} представленных здесь, а такжедегенерации нейронов на более длинных временных масштабах ^21.

При разработке конкретного эксперимента, каждый из альтернативных методов в отношении широко используются журналистами кальция и животного иммобилизации должны быть тщательно продуманы. Иммобилизация методы будут продиктованы технические аспекты, такие как необходимость физического доступа к животным, способность к восстановлению животных после визуализации или потребность в высокой пропускной способности. Различные флуоресцентные журналистам кальция имеют свои преимущества и недостатки. GCaMP использует простой одного анализа канала изображения и большое отношение сигнал-шум делает его применимым во многих ситуациях. Cameleon с другой стороны, требует более сложной обработки изображений и анализа, но полученный радиометрические измерения может иметь решающее значение в ситуации с потенциально большими артефактами. Например, колебания в размере флуорофора (как в примере лазерного разрушения) также может произойти в течение длительных периодов времени(Часов) в связи с изменением уровня экспрессии. Дополнительный двойной стратегии изображений также возможно, такие как GCaMP совместно выражена (или физически связано с) флуорофора RFP. Хотя не волнуйтесь основе это будет воспользоваться большим динамическим диапазоном современных вариантов GCaMP при использовании красного канала в реальном времени базовые измерения.

Важно отметить, что многие двухканальный визуализации микроскопа систем и программного обеспечения для анализа являются коммерчески доступными, которые, хотя часто более дорогим, может быть привлекательным для исследователей хотят построить дом, построенный системы, описанной здесь. Коммерческая двойной системы визуализации (DualView2-DV2, Фотометрия) обычно используют оптику похож на нашего дома построили системы, но содержатся в пределах одной привязанности микроскоп с стандартизированные процедуры выравнивания. Кроме того, быстрая замена фильтра системы (Lambda DG-4/DG-5 Plus, Sutter Instruments) позволяют быстро реальном времени последовательных изображений двух цветовых каналов Without дополнительная оптика изображения, но также являются дорогими и требуют точной синхронизации между фильтром обмена и приобретения камеры.

Таким образом, C. Элеганс представляет ряд преимуществ, в системе визуализации естественных условиях. Генетически закодирована флуорофоров часто ячейку конкретной и может устранить необходимость для введения или введение экзогенных флуорофоров. C. Элеганс оптического доступа позволяет изображений в интактных животных, которые являются простым и экономически эффективным в обслуживании, не требуют сложного рассечения или нейронов культивирования и сохранения клеточной физиологии. Кроме того, C. Элеганс имеет большие возможности для генетического анализа с большим количеством имеющихся генетических реагентов и хорошо зарекомендовавшие себя методы. Есть, конечно, недостатки системы, основной проблемой, возможно, в том, что это беспозвоночных. Кроме того, флуорофоры сообщать относительные изменения концентрации кальция раннийГ, чем абсолютное значение и временное разрешение измерений могут быть ограничены как динамика флуорофором, но и необходимым раза интеграции слабых сигналов флуоресценции. Наконец, в то время как кальций является составной частью нейронной активности и сигнализации флуорофоров прямо не сообщают мембранный потенциал напряжения и измеряется с помощью электрофизиологических методов. Тем не менее иллюстрируют процедуры, представленные здесь, C. Элеганс является привлекательным, относительно простой и экономически эффективной системы для широкого спектра исследований нейронов изображений.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Несколько человек участвовал в работе описано в этой статье. CVG построена экспериментальная установка, и LS, SHC, а CVG выполнены эксперименты. CVG и SHC написал рукопись. Все авторы впоследствии приняли участие в процессе пересмотра и утвержден окончательный вариант рукописи. Мы благодарим Павла Штернберга для GCaMP напряжения. Некоторые нематоды штаммы, используемые в этой работе были предоставлены Caenorhabditis генетический центр (CGC), которая финансируется за счет NIH Национальный научно-исследовательский центр ресурсов (NCRR). Анализ изображений MATLAB программа была адаптирована от используемой в ^18. Авторами были поддержаны Бостонского университета и Массачусетского Life Sciences Center.