Жить Визуализация GFP-меченых белков в

Протокол для живых изображений GFP-меченных белков или аутофлуоресцентной структур в отдельных Drosophila Ооцитов описано.

Ооцита дрозофилы была создана как универсальная система для исследования фундаментальных вопросов, таких как функция цитоскелета, клеточной организации, и органелл структуры и функции. Наличие различных GFP-меченных белков означает, что многие клеточные процессы можно наблюдать в живых клетках в течение нескольких минут или часов, и с помощью этой методики, процессы, такие как RNP транспорта, эпителиальный морфогенез, и ткань реконструкции были описаны в мельчайших подробностях в ^1,2 Drosophila ооцитов.

Способность выполнять видео изображения в сочетании с богатым репертуаром мутантов позволяет огромное разнообразие генов и процессов, которые будут рассмотрены в невероятных деталях. Одним из таких примеров является процесс ooplasmic поток, который инициирует в середине оогенеза ^3,4. Это энергичные движения цитоплазматических пузырьках является микротрубочек и кинезин зависит от ⁵ и предоставляет полезную системытемпература для исследования функции цитоскелета на этих стадиях.

Здесь я представляю протокол промежуток времени изображение жизни ооцитов, используя практически любые конфокальной микроскопии установки.

1. Подготовка мух для Dissection

1. Anesthetize здоровых мух желаемого генотипа (например, выразив GFP-меченых белков), что меньше, чем неделю назад. Выберите 10-15 крупных самок с закругленными кремового цвета животы.
2. Передача выбранного мух и несколько (3-5) самцов флакон, содержащий новые слегка дрожжевой пищи и позволяют мух для откорма в течение двух дней при температуре 25 ° C. См. Вейль и др. ^6. Подробности подготовки дрозофилы. Откорм мух гарантирует, что различные этапы, особенности этапов 8-12, будет доступна для работы с изображениями. Плохо откормленных или unfattened летит обычно содержат только очень ранней стадии (1-6) и зрелые (этап 14) ооцитов.

2. Подготовка ооцитов для визуализации с использованием прямой микроскоп соединения

1. Подготовка стандартных предметное стекло путем проставления два покровных к слайду, примерно 1 см друг от друга с помощью силиконовых greasе. Используйте только смазки достаточно, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между покровным и слайдов. Нажатие вниз твердо на каждом покровном будет распространяться смазки тонко и равномерно. Добавьте немного масла хладон 27 (Sigma) на стыке между покровные и слайдов. Они будут служить в качестве прокладки для предотвращения ранения изолированные ооцитов в последующих шагах. № 1.5 покровные работает хорошо, со средней толщиной (0.16-0.18 мм), что соответствует, что в последнее ооцитов стадии.
2. Место 2-3 капли масла хладон 27 на поверхности 22 мм ² покровное. Для получения здоровых яйцеклеток возможно, особи женского пола удаляют из пищи флакон использованием рот пипеткой и аккуратно хранение в Галокарбоновое масло без предварительного обезболивающее.
3. Использование резкое диссекции (таких, как Дюмон № 5), контактный лету против покровное и снять кончике живота. Удалите яичники, перетаскивая их по поверхности покровного стекла, в соответствии с маслом. Это будет способствовать adhesioп ооциты покровное.
4. Аккуратно дразнят друг от друга яичников, ища ооцитов, что, по крайней мере этап 10B оогенеза. Яйцеклетки на данном этапе могут быть выявлены, глядя на яйца камеры, в которых яйцеклетки занимает по крайней мере 50-60% от общего объема яйца камеры. На данный момент в оогенеза, фолликул клеток вышележащих яйцеклетки стали столбчатые, и окружающие яйцеклетку со всех сторон, за исключением небольшой области, где подключение к медсестре клетки остаются. Используйте пинцет, чтобы удалить отдельные ооциты от яйцевая трубка оболочки.
5. Приступить, используя 1-3 самок, пока 5-8 неповрежденных ооциты были выделены на покровное. Удалите все непригодной ткани.
6. Аккуратно перевернуть покровное содержащих ооциты на заранее подготовленные слайды, так что ооциты расположены между двумя распорками. Не нажимайте на перевернутую покровное так как это повредит ооцитов. Если необходимо, добавьте небольшое количество галоидоуглеводородов нефти в тОн края "сэндвич", чтобы обеспечить пространство заполнено. (Дополнительно:. Пусть слайд отдыха несколько минут для оседания покровное) слайд готова к визуализации.

3. Подготовка ооцитов для визуализации с использованием инвертированного микроскопа соединение

1. Ооциты расчлененные по существу, как описано в разделе 2, за исключением того, что маленькие чашки Петри с вставкой со стеклянным дном (Маттек, 35 мм) используется вместо покровные. Это не является необходимым для покрытия образца, и после вскрытия, ткань может быть отображена непосредственно в блюда, но необходимо соблюдать осторожность для обеспечения ооциты остаются покрыты маслом и не высыхать.

4. Изображений живых

1. Принесите яйцеклетки в фокус с помощью DIC или оптику фазового контраста и исследовать яйцеклетку на предмет повреждений, таких как утечки из цитоплазмы, или выпячивание фолликула клетками. Изображение только ооциты, которые появляются здоровые и неповрежденные.
2. StreaМина может контролироваться напрямую, без необходимости для маркировки GFP, так как желток пузырьков в цитоплазме находятся аутофлуоресцентной ^7. Этот сигнал может быть захвачен в FITC диапазоне масштабов, но, вероятно, потребуется большее усиление параметров, чем те, которые используются для GFP-меченых белков.
3. Лучшие изображения потокового получаются из оптического разделы, которые чуть ниже поверхности яйцеклетки, которые упираются в стекло покровное / Петри стекла. Здесь ооцит слегка сплюснутый, что делает для лучшего плоскости фокуса. Изображения могут быть захвачены на 200X - 1000 X. Использование договоренности, описанные здесь, воздушные цели должны быть использованы, так как покровное образует барьер между ооцитов и объективным. Это является оптимальной, поскольку это значительно снижает дрейф и перемещение образца.
4. После того, как область интереса находится в фокусе, выключите brighfield оптики и перейти к конфокальной микроскопии. С помощью быстрого сканирования / функция предварительного просмотра программного обеспечения, настройки фокуса и получитьпо мере необходимости.
5. Настройки для захвата будет варьироваться от микроскопа, чтобы микроскопом, но общие параметры таковы: Используйте возбуждения волны ~ 488 нм и длине волны излучения ~ 515 нм. Настройка Z-оси захвата, так что Z-оси остается постоянной, с отставанием в 10 секунд между кадрами. Захват тестовую последовательность из 5-10 кадров для обеспечения яйцеклетки является стационарным и плоскости фокуса является целесообразным.
6. Типичная последовательность промежуток времени будет фиксировать между 20 - 50 кадров, и могут быть просмотрены сразу же после завершения оценки качества видео. Этот процесс может быть повторен для других клеток в слайд или дополнительного женщин можно разрезать по мере необходимости.

5. Устранение неполадок и общие проблемы

1. Drift - При использовании прямого микроскопа, клетки иногда могут дрейфовать в связи с распространением нефти. Это может быть сведено к минимуму, используя только достаточно нефти, чтобы покрыть площадь под покровное. Если проблема не устранена, используйте меньше силиконовые гrease, чтобы прикрепить прокладки на слайд.

Примечание: Некоторые конфокальной программные пакеты позволяют клетке слежения, но в целом он лучше отказаться от изображения дрейфующих ооцитов и вместо этого использовать другого образца.

2. Никаких признаков потокового - Если потоковых не очевидно, вполне вероятно, связано с одной из двух причин: либо фокальной плоскости для захвата изображения не является правильным (как правило, слишком глубоко внутрь яйцеклетки) или яйцеклетки повреждены. Время и практика может свести к минимуму и ошибок.

Визуализация GFP-меченых белков будет меняться в зависимости от того, как сильно отмеченных белок экспрессируется. В середине стадии ооцита reticulon выражения типа 1 (Rtnl-1), экзон с меткой GFP ^8,9 дает сильный сигнал. Rtnl-1 представляется ко-локализуются с длинными микротрубочек присутствовать при ooplasmic потоковое ¹⁰ (рис. 1А). Rtnl-1 является хорошим маркером для наблюдения потоков, а также индикатор организации микротрубочек в конце ооцитов стадии.

Ooplasmic потоковое в камере яйца дикого типа является очевидным, как заметное движение аутофлуоресцентной пузырьки желтка при использовании скорости захвата одного кадра каждые 10 секунд (рис. 1б). Максимальная проекция пять кадров могут быть получены наметить пути движущихся пузырьков.

Рисунок 1. Жить изображений и autoflлюминесцентные и GFP с метками структур.) одного покадровой образ этап 11 ооцитов выражения Rtnl1-GFP на 400X. Rtnl1-GFP волокон двигаться с волнообразным движением в потоковом ооцитов. B) пять проекции максимальной рамках этапа 10B камеру яйцо, в котором желток аутофлуоресцентной пузырьки были обследованы каждые 10 сек в течение 50 сек общем, на 400X увеличение. Шкала бар = 30 мкм

Drosophila ооциты являются универсальными модель системы для решения различных вопросов, связанных с функцией и организации клеток и субклеточных компонентов. Полное понимание функции белка требует мониторинга как пространственные, так и временные аспекты поведения белков. Достижения в обеих системах визуализации и генетических инструментов, доступных для Drosophilists сделать его возможным даже для небольших лабораторий для выполнения высоким качеством изображения экспериментов в живой ооцитов. Здесь я изложить протокол анализа поведения GFP с метками или аутофлуоресцентной белков и сооружений в середине-конце оогенеза, который может быть использован в сочетании с различным генетическим фоном для исследования функции белка.

В этом протоколе я опишу процесс, посредством которого ооциты готовы для работы с изображениями и основные конфокальной параметров, которые позволят приобретение промежуток времени видео флуоресцентных белков и сооружений. Дополнительная DetaiЛ. С. О подготовке яйцеклетки описываются Вейль и др. ^6. широкий спектр лету штаммов экспрессии белков, которые были эндогенно отмеченных через экзон-захвата доступны ^8, и бесконечно больше вариантов белка может быть спроектирован и вновь, чтобы мухи.

При работе с живой тканью, здоровье образцов имеет первостепенное значение. Яйцо камер со сцены 10B может завершить оогенеза в основном автономно ^11, что делает их идеальными для краткосрочных исследованиях изображениями. Необходимо соблюдать осторожность на нескольких ключевых шагов, чтобы получить данные высокого качества. Во время рассечения важно, чтобы манипулировать яичников и ооциты как можно меньше, и свести к минимуму количество времени между вскрытие и завершения обработки изображений. В идеале, небольшая станция вскрытие должно быть расположено в том же помещении, где находится конфокальной области, и только несколько камер яйца в то время, должны быть отображены. Число рекомендуется здесь (5-8) Гарантирует, что рассечение время сведены к минимуму при максимальной вероятность получения хорошего качества изображения. Я рекомендую захватить небольшую серию фотографий для оценки качества изображения и убедиться, что захват настройки оптимизированы, прежде чем захватить больше последовательности промежуток времени. Большая часть программного обеспечения позволяет отдельным кадрам, чтобы спастись, и эти изображения могут быть проанализированы различные способы использования ImageJ ¹² или другого программного обеспечения.

Мне нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана грантом GM096076 из программы ОБЛАСТЬ NIH.