Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in

Un protocollo per l'imaging dal vivo di proteine ​​GFP-tagged o strutture autofluorescenti nei singoli Drosophila Ovociti è descritto.

L'ovocita Drosophila è stata stabilita come un sistema versatile per studiare questioni fondamentali quali la funzione del citoscheletro, l'organizzazione delle cellule, e la struttura e la funzione degli organelli. La disponibilità di diverse proteine ​​GFP-etichetta significa che molti processi cellulari può essere monitorata in cellule viventi nel corso di minuti o ore, e utilizzando questa tecnica, processi come RNP trasporti, morfogenesi epiteliale, e rimodellamento tissutale sono state descritte in dettaglio in ^1,2 Drosophila ovociti.

La possibilità di eseguire immagini video in combinazione con un ricco repertorio di mutanti permette una grande varietà di geni e dei processi da esaminare in dettaglio incredibile. Un esempio è il processo di streaming ooplasmic, che inizia a metà oogenesi ^3,4. Questo vigoroso movimento di vescicole citoplasmatiche è microtubuli e chinesina-dipendente ⁵ e fornisce un sistema utiletemperatura per indagare la funzione del citoscheletro in queste fasi.

Qui presento un protocollo per l'imaging lasso di tempo di ovociti di vita con pressoché qualsiasi configurazione microscopia confocale.

1. Preparazione mosche per la dissezione

1. Anestetizzare mosche sane del genotipo desiderato (per esempio, esprimendo una GFP-marcato proteina) che sono meno di una settimana fa. Selezionare 10-15 femmine di grandi dimensioni con arrotondati color crema addome.
2. Trasferire le mosche selezionati e alcuni (3-5) maschi in una fiala contenente nuovo cibo leggermente yeasted e permettere alle mosche di ingrassare per due giorni a 25 ° C. Fare riferimento a Weil et al. ⁶ per i dettagli di preparazione Drosophila. Ingrasso le mosche assicura che una serie di fasi, in particolare le fasi 8-12, sarà disponibile per l'imaging. Scarsamente ingrassato o unfattened vola di solito contengono solo nelle primissime fasi (1-6) e mature (stadio 14) ovociti.

2. Preparazione di ovociti per l'imaging utilizzo di un microscopio composto Montante

1. Preparare un vetrino vetro standard apponendo due coprioggetto al vetrino, di circa 1 cm di distanza, utilizzando greas siliconee. Utilizzare solo grasso sufficiente a garantire una buona tenuta tra il coprioggetto e far scorrere. Premere con decisione su ciascuna il coprioggetto si diffonderà il grasso in modo molto sottile. Aggiungete un po 'olio Halocarbon 27 (Sigma) alla giunzione tra i coprioggetti e far scorrere. Essi servono come distanziatori per evitare ferimento oociti isolati in fasi successive. No. 1.5 coprioggetti lavorare bene, con uno spessore medio (0,16-,18 mm) che corrisponde a quello di ovociti fase avanzata.
2. Posto 2-3 gocce di olio Halocarbon 27 sulla superficie di mm 22 ² coprioggetto. Per ottenere gli ovociti sani possibili, una femmina individuo viene rimosso dal flacone alimenti utilizzando pipette a bocca e delicatamente depositato nella Halocarbon senza anestetizzante prima.
3. Utilizzando taglienti dissettore (come Dumont # 5), il pin al volo contro il coprioggetto ed estrarre la punta dell'addome. Rimuovere le ovaie trascinandoli lungo la superficie del vetrino, sotto l'olio. Ciò promuoverà adhesion degli ovociti al coprioggetto.
4. Delicatamente prendere in giro a parte le ovaie, alla ricerca di ovociti che sono almeno 10B fase dell'oogenesi. Oociti in questa fase possono essere identificati osservando per camere d'uovo in cui l'ovocita occupa almeno il 50-60% del volume totale della camera uovo. A questo punto oogenesi, le cellule follicolari sovrastanti l'ovocita sono diventati colonnare, e circondano l'ovocita su tutti i lati tranne per una piccola regione dove i collegamenti alle cellule rimangono infermiera. Utilizzare le pinze per rimuovere singoli ovociti dalla guaina ovariole.
5. Procedi, con le femmine 1-3, fino al 5-8 ovociti non danneggiati sono stati isolati sul coprioggetto. Rimuovere qualsiasi tessuto inutilizzabile.
6. Agitare delicatamente il vetrino contenente gli ovociti sul pre-preparato diapositiva in modo che gli ovociti sono posizionate tra i due distanziatori. Non premere verso il basso sul vetrino invertita a quella danneggiare gli ovociti. Se necessario, aggiungere una piccola quantità di olio Halocarbon per tegli bordi del "sandwich" per garantire lo spazio è riempito. (Opzionale:. Lasciare riposare vetrino per alcuni minuti per consentire la sedimentazione di coprioggetto) Il vetrino è pronto per l'imaging.

3. Preparazione di ovociti per l'imaging utilizzo di un microscopio invertito composto

1. Gli ovociti vengono sezionati essenzialmente come descritto nella sezione 2, eccetto che piccoli piatti di Petri con un inserto in fondo di vetro (MatTek, 35 mm) sono utilizzati al posto di coprioggetti. Non è necessario per coprire il campione, e dopo la dissezione, il tessuto può essere ripreso direttamente nei piatti, ma bisogna fare attenzione a garantire gli ovociti rimangono coperti con olio e non sono autorizzati ad asciugarsi.

4. Vivo Imaging

1. Portare un ovocita a fuoco utilizzando DIC o ottica di contrasto di fase ed esaminare l'ovocita non presenti segni di danni, come ad esempio perdite di citoplasma, o rigonfiamento delle cellule del follicolo. Ovociti unica immagine che appaiono sani e non danneggiati.
2. Streaprogrammazione può essere monitorato direttamente senza la necessità di etichettatura GFP, dal tuorlo vescicole nel citoplasma sono autofluorescente ^7. Questo segnale può essere catturato nella gamma FITC della portata ma probabilmente richiederà impostazioni di guadagno più elevati rispetto a quelli utilizzati per le proteine ​​marcate con GFP.
3. Le migliori immagini di streaming sono ottenute da sezioni ottiche che sono appena sotto la superficie dell'ovocita che tocca la coprioggetto / Petri di vetro vetro. Qui l'ovocita è leggermente appiattito, rendendo per un piano di messa a fuoco migliore. Le immagini possono essere catturate a 200X - 1.000 X. Con la disposizione descritta qui, obiettivi a deve essere utilizzato, in quanto il vetrino forma una barriera tra l'ovocita e obiettivo. Questo è ottimale perché riduce notevolmente la deriva e movimento del campione.
4. Una volta che una regione di interesse è a fuoco, spegnere l'ottica brighfield e passare a confocale. Utilizzando il veloce scansione / anteprima funzione del software, la messa a fuoco e di ottenerecome necessario.
5. Impostazioni per la cattura variano da microscopio per microscopio, ma i parametri generali sono i seguenti: Utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di ~ 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di ~ 515 nm. Impostare asse Z catturare in modo che l'asse Z rimane costante, con un ritardo di 10 secondi tra i frame. Acquisire una sequenza di fotogrammi di prova 5-10 per garantire l'oocita è fermo e il piano di messa a fuoco è appropriato.
6. Una tipica sequenza di lasso di tempo di catturare fra 20 - 50 fotogrammi, e può essere rivisto immediatamente dopo il completamento per valutare la qualità del video. Il processo può essere ripetuto per altre celle nella diapositiva o femmine aggiuntivi possono essere sezionati secondo necessità.

5. Risoluzione dei problemi e comune

1. Drift - Quando si utilizza un microscopio in posizione verticale, le cellule possono a volte alla deriva a causa di diffusione di olio. Questo può essere minimizzato utilizzando solo olio sufficiente a coprire l'area sotto il coprioggetto. Se il problema persiste, utilizzare g silicone menorease di distanziali apporre alla diapositiva.

Nota: alcuni pacchetti software confocale consentire il monitoraggio delle cellule, ma in generale è meglio abbandonare l'imaging di ovociti alla deriva e di utilizzare invece un altro campione.

2. Nessun segno di streaming - Se lo streaming non è evidente, è probabile causa di una delle due cause: o il piano di riferimento per l'acquisizione di immagini non è corretta (in genere troppo in profondità verso l'interno dell'ovocita) o l'ovocita è danneggiato. Il tempo e la pratica possono ridurre al minimo sia gli errori.

Imaging di proteine ​​marcate con GFP varierà a seconda di come fortemente la proteina marcata è espressa. Un mid-stage ovocita esprime reticulon-simile 1 (Rtnl-1), esone etichettato con GFP ^8,9 produce segnale forte. Rtnl-1 sembra co-localizza con i microtubuli lunghi disponibili durante lo streaming ooplasmic ¹⁰ (Figura 1A). Rtnl-1 è un buon marcatore per osservare lo streaming, ed è anche un indicatore di organizzazione dei microtubuli in ovociti fase avanzata.

Streaming Ooplasmic in una camera di uovo di tipo selvatico è evidente come movimento notevole di vescicole tuorlo autofluorescenti quando si utilizza una velocità di acquisizione di un frame ogni 10 secondi (Figura 1B). Una proiezione massimo di cinque telai possono essere generati per segnare il percorso di vescicole movimento.

Figura 1. Vivo imaging sia autoflstrutture uorescenti e GFP-tagged. A) Un singolo time-lapse immagine di un oocita stadio 11 che esprime Rtnl1-GFP a 400X. Rtnl1-GFP fibre di muoversi con un movimento ondulatorio in ovociti di streaming. B) A cinque sporgenza massima cornice di una camera 10B stadio di uova in cui sono stati ripresi i vescicole autofluorescenti tuorlo ogni 10 secondi per 50 secondi totale, con ingrandimento 400X. Barra della scala = 30 micron

Ovociti Drosophila sono un sistema modello versatile per affrontare una serie di questioni relative alla funzione e l'organizzazione delle cellule e componenti subcellulari. Una comprensione completa della funzione della proteina richiede il controllo dei due aspetti spaziali e temporali di comportamento proteine. I progressi in entrambi i sistemi di imaging e gli strumenti genetiche disponibili per Drosophilists rendere possibile anche per piccoli laboratori per eseguire esperimenti di imaging di alta qualità in ovociti di vita. Qui delineare un protocollo per analizzare il comportamento di proteine ​​GFP-tag o autofluorescente e strutture durante metà a fine-oogenesi che può essere utilizzato in combinazione con una varietà di contesti genetici per sondare la funzione delle proteine.

In questo protocollo I descrivere il processo con cui vengono preparati oociti per l'imaging e le impostazioni di base confocali che consentano l'acquisizione di video lasso di tempo di proteine ​​fluorescenti e strutture. Ulteriori details sulla preparazione ovociti sono descritti da Weil et al. ⁶ Una varietà di ceppi di mosca esprimono proteine ​​che sono stati contrassegnati con endogenamente esone-trapping sono disponibili ⁸ e varianti proteiche infinitamente più possono essere progettati e reintrodotti mosche.

Nel lavoro con tessuto vivente, la salute degli esemplari è di fondamentale importanza. Camere di uova da 10B stadio possibile completare oogenesi in modo sostanzialmente autonomo ^11, che li rende ideali per brevi studi di imaging termine. Si deve prestare attenzione a diversi passaggi chiave per ottenere dati di alta qualità. Durante la dissezione è importante manipolare ovaie e ovociti meno possibile, e per ridurre al minimo la quantità di tempo tra la dissezione e il completamento di imaging. Idealmente, una stazione di dissezione piccola dovrebbe trovarsi nella stessa stanza che ospita il campo di applicazione confocale, e solo un paio di camere d'uovo alla volta deve essere ripreso. Il numero consigliato qui (5-8) Garantisce che il tempo dissezione è minimizzato massimizzando la probabilità di ottenere immagini di buona qualità. Vi consiglio di catturare una breve serie di immagini per valutare la qualità delle immagini e verificare che le impostazioni di cattura sono ottimizzate, prima di catturare più di una sequenza lasso di tempo. Più software consente singoli fotogrammi per essere salvato, e queste immagini possono poi essere analizzati in una varietà di modi utilizzando ImageJ ¹² o altro software.

Non ho nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione GM096076 dal programma AREA NIH.