חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent באדם דרוזופילה מתוארות.

ביצית דרוזופילה הוקמה כמערכת תכליתית לחקירת שאלות בסיסיות כגון פונקצית cytoskeletal, ארגון תא, ומבנה אברון ותפקודו. הזמינות של חלבונים שונים GFP מתויג-אומרת שתהליכים תאיים רבים יכולים להיות במעקב בתאים חיים במשך דקות או שעות, ושימוש בטכניקה זו, תהליכים כגון RNP תחבורה, המורפוגנזה אפיתל, ושיפוץ רקמה כבר תארו בפירוט רב ^ב1,2 תסיסנית ביציות.

היכולת לבצע הדמית וידאו בשילוב עם רפרטואר עשיר של מוטציות מאפשרת מגוון עצום של גנים ותהליכים שיש לבחון בפירוט מדהים. דוגמה אחת כזו היא התהליך של הזרמת ooplasmic, אשר יוזם ^ב3,4 אמצע oogenesis. תנועה נמרצת זו של שלפוחית ​​cytoplasmic היא microtubule ^ו5 kinesin תלוי ומספקת sys שימושיTEM לחקירת תפקוד cytoskeleton בשלבים האלה.

כאן אני מציג את פרוטוקול לזמן לשגות הדמיה של ביציות חיים באמצעות כמעט כל התקנת מיקרוסקופיה confocal.

1. הכנת זבובים לנתיחה

1. הרדם זבובים בריאים של גנוטיפ הרצוי (לדוגמה, מבטא חלבון ה-GFP שכותרת-) שהם פחות משבוע ישן. בחר 10-15 נקבות גדולות עם בטן בצבע שמנת מעוגלת.
2. להעביר את הזבובים הנבחרים וכמה (3-5) זכרים לבקבוקון המכיל מזון קל yeasted חדש ולאפשר את הזבובים להשמין במשך ימים ב 25 ° C. עיין וייל ואח'. ⁶ לפרטים של הכנת דרוזופילה. פיטום הזבובים מבטיחים כי מגוון שלבים, במיוחד שלבים 8-12, יהיה זמין להדמיה. פטם גרוע או unfattened טס בדרך כלל מכיל רק שלבים מוקדמים מאוד (1-6) ו( שלב 14) ביציות בשלות.

2. הכנה של ביציות לדימות באמצעות מיקרוסקופ מתחם זקוף

1. הכן שקופית זכוכית רגילה ידי הדבקת 2 coverslips לשקופית, מלבד כ 1 סנטימטר, באמצעות greas סיליקוןדואר. השתמש רק בגריז מספיק כדי להבטיח איטום טוב בין coverslip והשקופיות. לחיצה כלפי מטה בחוזקה בכל coverslip תתפשט הגריז דק ואחיד. הוסף מעט שמן halocarbon 27 (Sigma) לצומת בין coverslips והשקופיות. הם ישמשו כמפרידים כדי למנוע פציעת ביציות מבודדות בשלבים הבאים. המספר 1.5 coverslips עובד היטב, עם עובי ממוצע (0.16-0.18 מ"מ) שתואם לזה של ביציות בשלב מאוחרת.
2. מקום 2-3 טיפין של שמן halocarbon 27 על פני השטח של ² מ"מ coverslip 22. כדי לקבל את הביציות הבריאות ביותר האפשריות, נשי פרטית יוסר מבקבוקון המזון באמצעות pipetting פה והונח בעדינות לתוך שמן halocarbon בלי ההרדמה ראשונה.
3. שימוש במלקחי מנתחים חדים (כגון דומון # 5), להצמיד את הזבוב נגד coverslip ולמשוך את קצה הבטן. הסר את השחלות על ידי גרירתם על פני השטח של coverslip, תחת השמן. זו תקדם adhesion של הביציות לcoverslip.
4. בעדינות להקניט מלבד שחלות, מחפש ביציות כי הם לפחות 10B השלב oogenesis. ביציות בשלב זה ניתן לזהות על ידי מחפש תאי ביצה שבביצית מעסיקה לפחות 50-60% מהנפח הכולל של תא הביצה. בנקודה זו בoogenesis, את תאי הזקיק המונחים על הביצית הפכו עמודים, ומקיפים את הביצית מכל צדדיו, פרט לאזור קטן שבו חיבורים לתאי האחות יישארו. השתמש במלקחיים כדי להסיר ביציות בודדות מנדן ovariole.
5. להמשיך, באמצעות 1-3 נקבות, עד 5-8 ביציות שלא נפגעו היו מבודדות על coverslip. הסר את כל רקמת unuseable.
6. זהירות להפוך coverslip המכיל את הביציות לשקופית המוכנה מראש כדי שהביציות מוצבות בין שני מפרידים. אל תלחץ על coverslip ההפוך כמו שיפגע בביציות. במידת צורך, להוסיף כמות קטנה של שמן לhalocarbon tהוא הקצוות של "הכריך" כדי להבטיח את המקום מלאים. (אופציונלי:. בוא שקופית מנוחה לכמה דקות כדי לאפשר ליישוב של coverslip) השקופיות מוכנות כעת להדמיה.

3. הכנה של ביציות לדימות באמצעות מיקרוסקופ מתחם הפוך

1. ביציות הם נתחו למעשה כאמורים בסעיף 2, פרט לכך שצלחות פטרי הקטנות עם הוספת תחתית זכוכית (מאטק, 35 מ"מ) משמשות במקום coverslips. מיותר כדי לכסות את הדגימה, ולאחר נתיחה, רקמה יכולה להיות צלמה ישירות בכלים, אבל יש להקפיד על מנת להבטיח את הביציות תישארנה מכוסית בשמן ואסור להתייבש.

4. חי הדמיה

1. הבא את הביצית אל מוקד באמצעות דסק"ש או אופטיקה לעומת שלב ולבחון את הביצית לכל סימן של ניזק, כגון דליפה בציטופלסמה, או בולט של תאי זקיק. ביציות רק תמונה שמוצגות בריאים ולא ניזוקו.
2. Streaמינג ניתן לפקח באופן ישיר, ללא צורך בתיוג GFP, מאז שלפוחית ​​חלמון בציטופלסמה היא autofluorescent ^7. אות זה יכול להיות שנתפסה בטווח של FITC ההיקף אך סביר להניח כי צורך בהגדרות רווח גבוהות יותר מאלה המשמשים לחלבוני ה-GFP שכותרת-.
3. את התמונות הטובות ביותר של הזרמה מתקבלות מחלקים אופטיים שמתחת לפני השטח של הביצית שמונחת על זכוכית זכוכית coverslip / פטרי. הנה הביצית היא שטוחה מעט, מה שהופך למטוס טוב יותר מפוקוס. תמונות יכולות להיות שנתפסו ב200X - 1000 X. באמצעות ההסדר שתואר כאן, מטרות אוויריות צריכות לשמש, מאחר coverslip יוצר מחסום בין הביצית והאובייקטיבית. זה אופטימלי כי זה מאוד מצמצם סחף ותנועה של המדגם.
4. ברגע שאזור של עניין הוא בפוקוס, כבה את אופטיקה brighfield ולעבור להדמית confocal. השימוש בפונקציית הסריקה / תצוגה מקדימה המהירה של התוכנה, להתאים להתמקד ולהשיגבמידת צורך.
5. הגדרות עבור לכידה תשתנינה ממיקרוסקופ למיקרוסקופ, אבל פרמטרים כלליים הם כדלקמן: השתמשו באורך גל עירור של 488 ננומטר ~ וגל פליטה של ​​~ 515 ננומטר. הגדר את ציר Z-לכידה כך שציר Z-נשאר קבוע, בפיגור של 10 שניות בין מסגרות. לכידת רצף מבחן המסגרות 5-10 כדי להבטיח הביצית היא נייחת והמטוס של מוקד הוא מתאים.
6. רצף זמן פקיעה טיפוסי יהיה ללכוד בין 20-50 מסגרות, וניתן לסקור באופן מיידי לאחר השלים להעריך את איכות וידאו. התהליך ניתן לחזור לתאים אחרים בשקופית, או נקבות נוספות ניתן גזור לפי צורך.

5. פתרון בעיות ומשותפות

1. להיסחף - בעת שימוש במיקרוסקופ זקוף, תאים יכולים לעתים להיסחף בשל התפשטות של נפט. זו ניתן למזער באמצעות מספיק שמן רק כדי לכסות את השטח שמתחת לcoverslip. אם בעיות נמשכות, השתמש גרם סיליקון פחותrease למפרידים מדביקים על השקופית.

הערה: חלק מחבילות תוכנת confocal לאפשר מעקב תא, אך באופן כללי, עדיף לזנוח את ההדמיה של ביציות נסחפו ובמקום להשתמש בפריט נוסף.

2. אין סימנים של זרימה - אם ההזרמה לא ברורה, סביר להניח בשל אחת משתי סיבות: או שמישור המיקוד ללכידת תמונה הם לא נכונים (בדרך כלל עמוק מדי לתוך הפנים של הביצית) או הביצית פגומה. זמן ותרגול יכולים למזער שתי טעויות.

הדמיה של חלבוני ה-GFP שכותרת-תשתנה בהתאם לכמה חזק החלבון מתויג מתבטא. ביצית אמצע במה להביע reticulon דמוי 1 (Rtnl-1), אקסון מתויג עם GFP ^8,9 מייצרת איתות חזקה. Rtnl-1 מופיע לשיתוף לוקליזציה עם microtubules הנוכח במהלך הזרמת ooplasmic ¹⁰ (איור 1 א ') הארוך. Rtnl-1 הוא סמן טוב להתבוננות הזרמה, וגם חיווי של ארגון microtubule בביציות בשלב מאוחרות.

הזרמת Ooplasmic בתא ביצת wildtype ניכרה כתנועה מורגשת של שלפוחית ​​החלמון autofluorescent בעת שימוש בשיעור לכידה של פריים אחד בכל 10 (תרשים 1B) שניות. היטל מקסימאלי של חמש מסגרות יכול להיות שנוצר כדי לסמן את הנתיב של שלפוחית ​​מרגשת.

איור 1. חי הדמיה של שניהם autofluorescent וGFP-tagged מבנים.) תמונת זמן לשגות אחת של 11 ביצית במה להביע Rtnl1-GFP ב400x. סיבי Rtnl1-GFP לנוע בתנועה גלית בביציות זרימה. B) 5 היטל מרבי מסגרת של תא ביצת 10B שלב שבו שלפוחית ​​החלמון autofluorescent הייתה צלם כל 10 שניות לסך 50 שניות, בהגדלה של 400x. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר

ביציות תסיסנית הן מערכת מודל תכליתית לטיפול במגוון רחב של שאלות הקשורות לתפקיד ולארגון של תאים ורכיבי subcellular. הבנה מלאה של תפקוד חלבון דורשת ניטור של שני היבטי מרחב ובזמן של התנהגות חלבון. התקדמות בשתי מערכות הדמיה ואת הכלים העומדים לרשות Drosophilists הגנטיים מאפשר למעבדות קטנות אפילו לבצע ניסויי הדמיה באיכות גבוהה בביציות חיים. כאן אני מתאר פרוטוקול כדי לנתח את ההתנהגות של חלבונים ומבנים GFP מתויגים או autofluorescent במהלך אמצע ל- oogenesis מאוחר שיכול לשמש בשילוב עם מגוון רחב של רקע גנטי כדי לחקור תפקוד חלבון.

בפרוטוקול זה אני מתאר את התהליך שבו ביציות מוכנות להדמיה ואת הגדרות confocal הבסיסיות שתאפשרנה רכישת זמן לשגות וידאו של חלבונים ומבני ניאון. detai נוסףls על הכנת ביצית מתוארים על ידי וייל ואח'. ⁶ מגוון רחב של זני זבובים מבטאים חלבונים שתויגו endogenously דרך אקסון לוכדים זמינים ^8, ואין ספור גרסות חלבון יכולות להיות מהונדסות והחזירו לזבובים.

בעבודה עם רקמת חיה, בריאות מהדגימות היא בעלת חשיבות עליונה. תאי ביצית מ10B הבמה יכולים להשלים oogenesis באופנת מהות אוטונומית ^11, מה שהופך אותם אידיאליים למחקרי הדמיה לטווח קצרים. יש להקפיד בכמה שלבים עיקריים כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה. במהלך נתיחה חשובה לתמרן שחלות וביציות קטנים ככל האפשר, וכדי למזער את כמות הזמן בין נתיחה וההשלמה של הדמיה. באופן אידיאלי, תחנת נתיחה קטנה צריכה להיות ממוקמת באותו החדר שבו שוכן היקף confocal, ורק כמה תאי ביצה בכל פעם צריכים להיות צלם. המספר מומלץ כאן (5-8) מבטיח שזמן הנתיחה ממוזער תוך מיקסום הסבירות לקבלת תמונות באיכות טובה. אני ממליץ לכידת סדרה קצרה של תמונות כדי להעריך את איכות תמונה ולאשר כי ללכוד הגדרות מותאמות, לפני צילום רצף זמן פקיעה ארוך יותר. רוב התוכנות מאפשרות מסגרות בודדות כדי להינצל, והתמונות הללו אז יכולות להיות מנותחות במגוון דרכים באמצעות ¹² ImageJ או תוכנה אחרת.

אין לי מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי מענק GM096076 מתכנית AREA-NIH.