Подготовка миелоидного Производные супрессоров (MDSC) от наивного и опухоли поджелудочной железы мышей использованием проточной цитометрии и автоматизированных магнитных активированный сортировки клеток (AutoMACS)

Это быстрый и всеобъемлющий метод иммунофенотипирования миелоидного Производные супрессоров (MDSC) и обогащению Gr-1 ⁺ Лейкоцитов из селезенки мышей. Этот метод использует проточной цитометрии и сортировки клеток AutoMACS обогатить жизнеспособных Gr-1 ⁺ Лейкоцитов до FACS сортировки MDSC для использования В естественных условиях И В пробирке Анализ.

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer^1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens⁷. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to naïve counterparts^7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression^11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.

Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to naïve MDSC ¹³. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of naïve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1⁺ leukocytes from naïve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1⁺ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1⁺ leukocytes from spleens of naïve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas naïve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from naïve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1⁺ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1⁺ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (naïve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Перед началом, подготовить следующие решения:

3% Окрашивание Media (SM):

-3% Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в 1X фосфатного буфера солевым раствором (PBS)

MACS буфера (МБ):

- 0,5% альбумина из бычьей сыворотки (BSA) в 1XPBS

1. Урожай из селезенки мышей

1. Подкожно вводят 6-8 недельного возраста C57BL / 6 (Харлан) с 1,5 х 10 ⁵ клеток мышиной Panc02 приостановлены в 100 мкл 1x PBS (опухоль, туберкулез). Контрольные мыши (наивно) получают 100 мкл 1XPBS.
2. Приблизительно 4 недели после инъекции, усыпить мышей углерода удушья газом.
3. Урожай из селезенки мышей тупой диссекции с помощью щипцов и ножниц, то весят использованием баланса. Место селезенки в отдельных, обозначенных 50 мл конические пробирки, содержащие 1 х PBS.

2. Создание единой клеток Suspensioп Лейкоциты из селезенки

Все процедуры должны выполняться в стерильных условиях под биологической безопасности Гуд и клеток и антител держится на льду.

1. Соберите клеточная диссоциация сито, вставив сито в открытии чашку ко дну. Затем вставьте стопорное кольцо в резьбовое области с прорезями вверх и использовать кольцо ключ для затяжки стопорного кольца, тем самым удерживая экран на месте. Поместите собранный сито в чашку Петри, содержащую 10 мл 1 х PBS.
2. Бассейн селезенки и пестик использование стекла для измельчения селезенки с сеткой ячейки сита и диссоциации в чашке Петри. Повторите для каждой группы мышей.
3. Фильтры клеточной суспензии в 50 мл коническую трубку использованием 70 мкм фильтр клетке и 5 мл серологические пипетки. Центрифуга при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин.
4. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл 1 х лизиса буфера в селезенке. Внесите вверх и вниз энергично. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин. Остановить реакцию, добавив 20 мл 1 х PBS. Внесите вверх и вниз энергично. Центрифуга при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин.
5. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 20 мл стерильной 1 х PBS. Внесите вверх и вниз энергично.
6. Граф клеток с использованием трипанового синего и hemacytometer и ресуспендируют в нужной концентрации в 3% SM, так что 50 мкл эквивалентно 5x10 ^{5-1x10 6} клеток (1х10 ⁷ клеток / мл - 2х10 ⁷ клеток / мл).

3. Cell-поверхность окрашивания / Иммунофенотипирование из MDSC использованием проточной цитометрии

1. Этикетка лунки 96-луночного В нижней панели для управления и опытных образцов и одного пятна на компенсацию управления (нет пятен, NS, Mac-1-FITC, Gr-1 БТР и DAPI).
2. Добавить 5x10 ^{5-1x10 6} клеток, эквивалентную 50 мкл / лунку спленоцитов в свои скважины в 96-и V-дно тарелки. Центрифугироватьпластины при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин.
3. Подготовить «Мастер Mix" (ММ) Мышь BD Fc Block (Крыса анти-мышиных моноклональных антител CD16/32) разводят в 3% SM, в 1,5 мл микроцентрифужных трубы на льду. В качестве отправной точки используется 1 мкг Fc Блока в 3% СМ для конечного объема 50 мкл, в каждую лунку.
4. Осторожно удалите супернатант из каждой скважины из 96-и V-нижней пластины быстро обращения пластинку снова и обратно, за контейнер для отходов или раковины без разрушения клетки гранулы.
5. Vortex, кратко центрифуги Fc Блок ММ в течение 5 секунд и добавить 50 мкл для всех гранул в 96-и V-дно тарелки. Хорошо перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз, оставляя образцы в скважинах. Инкубируйте пластины в течение 15 минут в темноте на льду. Центрифуга пластины при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин.
6. Подготовить «Мастер Mix" (ММ) флуорохромом конъюгированных антител разводят в 3% SM в 1,5 мл трубки микроцентрифужных на льду, в то время как образцы с инкубации Блок Fc. Антитела должна подбиратьсядля определения оптимального разведения для окрашивания процедур. В качестве отправной точки, объединить 1:25 разбавления Mac-1-FITC и 1:20 разбавления Gr-1-APC в 3% СМ для конечного объема 50 мкл, в лунки.
7. Осторожно удалите супернатант из каждой скважины из 96-и V-вниз, как описано выше.
8. Vortex, кратко центрифуги ММ флуоресцентных антител, конъюгированных окрашивания в течение 5 секунд и добавить 50 мкл до контрольной и экспериментальной гранул. Хорошо перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз. Для одного пятна компенсаций, добавить 1:25 разбавления Mac-1-FITC, 1:20 разбавления Gr-1 БТР и 75 нг / мл DAPI, в 3% СМ для конечного объема 50 мкл на лунку их соответствующие лунки. Добавить 50 мл 3% SM к незапятнанным хорошо (нет пятен). Хорошо перемешать и инкубировать клетки в 96-и V-нижнюю пластину в течение 30 минут в темноте на льду.
9. Этикетка FACS труб (5 мл, 12 мм х 75 мм полистирола труб с круглым дном), чтобы соответствовать в каждую лунку в 96-и V-дно тарелки. Добавить 200 мкл 3% SM каждого FACSтрубы.
10. Центрифуга пластины при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 минут и удалить супернатантах. Вымойте гранул путем добавления 100 мкл 3% SM каждой гранулы и хорошо перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз. Центрифуга пластины при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин. Повторите шаг вымыть еще раз.
11. Осторожно удалите супернатант из каждой скважины из 96-и V-вниз, как описано выше. Ресуспендируйте каждый шарик в 100 мкл 3% СМ и хорошо перемешать.
12. Передача 100 мкл ресуспендировали гранул из каждой лунки 96-и V-нижнюю пластину к их соответственно помечены трубки FACS.
13. До Проточная цитометрия анализ, добавить 75 нг / мл DAPI контролировать и опытных образцов и DAPI одного пятна контроль компенсации.
14. Выполните проточной цитометрии приобретения данных MDSC проценты. Выполните компенсацию с использованием отрицательной (не пятна контроля) и одного положительного контроля. Настройка точки сюжета, который отображает вперед (FSC) в зависимости от стороны рассеяния (SSC) в логарифмической шкале, так что лейкоцитов населенияинтерес может быть идентифицирован. Нарисуйте большой ворот на все лейкоциты, кроме мусора и комков с низким вперед и стороны разбегаются. Из этого родители ворот, создать новый сюжет точки, который отображает SSC против DAPI и ворота на DAPI-(живой) клеток. Выберите этот недавно закрытого населения и создание точки сюжета, который отображает Mac-1 по сравнению с Gr-1 и ворота на двойной положительный (Mac-1 ⁺ Gr-1 ⁺⁾ MDSC.

4. Магнитное обогащение Gr-1 ⁺ Лейкоциты

1. Алиготе 1x10 ⁷ оставшихся неокрашенных лейкоцитов в соответствующей маркировкой FACS труб и центрифуги при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин.
2. Подготовить ММ Gr-1-PE антител в 1,5 мл микроцентрифужных трубку. До 10 ⁷ клеток, используют разведение 1:10 Gr-1-PE антитела в 50 мкл Мб, в образце. Для большего количества клеток, расширению объемов соответственно. Кратко центрифуги в течение 5 секунд, добавить в лейкоцитах в трубах FACS и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С в темноте.
3. Добавить 2 мл Мб FACS трубы, центрифуги при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин и супернатант отказаться.
4. Подготовить ММ Anti-PE микрошариков в 1,5 мл микроцентрифужных трубку. До 10 ⁷ клеток, используют разведение 1:4 анти-PE микрошариков в 200 мкл Мб, в образце. Для большего количества клеток, расширению объемов соответственно. Кратко центрифуги в течение 5 секунд, добавить в лейкоцитах в трубах FACS и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С в темноте.
5. Добавить 2 мл Мб FACS трубы, центрифуги при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин и супернатант отказаться. Ресуспендируют осадок в 3 мл СО. Фильтрация через 70 мкм фильтр в новый, помеченный 50 мл коническую трубку.
6. Подготовка и премьер-Авто MACS Pro сепаратор. Refill все бутылки с соответствующими решениями и пустые бутыли с отходами, в случае необходимости. Включите инструмент и рассмотрим то состояние жидкости контейнеров и столбца (ы) после инициализации. Все символы должны быть зеленого цвета. В меню выберите пункт "Разделение" из верхнегоменю, затем "Промыть Now" из нижнего меню. Выберите "Полоскание" из всплывающего вариант, затем "Выполнить", чтобы начать процесс грунтования. После грунтовки процесс успешно завершен, прибор будет показывать, что он "готов на разделение" по статусу меню.
7. Выберите подходящий охлажденной стойки трубы для труб размеры и место 50 мл коническую трубку с магнитным меченых клеток в строке, 50 мл коническую трубку для отрицательных сбор фракции в строке B и 15 мл коническую трубку для положительных сбор фракции в строке C.
8. Выберите "POSSEL_S" ячейки разделение программы на положительный выбор меченых клеток-мишеней в чувствительный режим образца. Магнитное меченых клеток цель сохраняется в столбце автоматов; немеченого клетки попадают в отрицательную пробирки часть в строке B. На автоматизированных опровержение магнита, меченые клетки-мишени будет выпущен в положительную пробирки в строке C трубки стойку.

5. После сортировки Анализ Gr-1 ⁺ Лейкоциты Обогащенный

1. Пересчет Gr-1 ⁺ и Гр-1 ^- фракции с использованием трипанового синего и hemacytometer. Ресуспендирования клеток в нужной концентрации в 3% окрашивания средних, так что 50 мкл эквивалентно 5x10 ^{5-1x10 6} клеток (1х10 ⁷ клеток / мл - 2х10 ⁷ клеток / мл) и перенести 50 мкл соответственно помечены FACS труб.
2. Подготовить ММ Mac-1 только в разведении 1:25 в 3% СМ для конечного объема 50 мкл на пробу. Пятно клетки и подготовить одного пятна компенсаций Gr-PE, Mac-1 FITC и DAPI для анализа потока цитометрии. Добавить 200 мкл 3% СМ и DAPI жизнеспособность красителя, как описано выше.
3. Выполните проточной цитометрии сбора данных для определения Gr-1 ⁺ и Гр-1 ^- процент и также сравнить MDSC процентов пред-и пост-autoMACS обогащения.

6. Представитель Результаты

Здесь мы показываем, т epresentative результаты autoMACS обогащения Gr-1 ⁺ лейкоцитов из объединения, наивно селезенки для последующей сортировкой FACS MDSC (рис. 1). 1x10 ⁶ лейкоцитов наивно окрашивали Mac-1-FITC и Gr-1-APC антитела для выявления MDSC процент использования инструмента BD LSRII до сортировки autoMACS. 1x10 ⁷ наивных лейкоцитов затем окрашивали анти-Gr-1-PE антитела и PE-микрошарики для обогащения Gr-1 ⁺ лейкоциты использованием сепаратора autoMACS Pro. После autoMACS обогащения, Gr-1 процент в Gr-1 ⁺ и Гр-1 ^- собрал фракции оценивали с помощью проточной цитометрии. 1x10 ⁶ Гр-1 ⁺ лейкоциты были удалены и окрашивали Mac-1-FITC антител для анализа и сравнения MDSC процент обогащенного объединения наивно лейкоцитов, не обогащенный, объединенный с опухолями лейкоцитов методом проточной цитометрии.

fig1.jpg "/>
Рисунок 1. AutoMACS обогащения Наивные Gr-1 ⁺ лейкоциты для MDSC FACS сортировки. Селезенки были собраны из поджелудочной железы опухоль и наивно мышей и обрабатываются в одной клеточной суспензии. Проточная цитометрия анализу наивный поверхности лейкоцитов окрашиваются Mac-1, Gr-1 люминесцентная конъюгированных антител, до autoMACS обогащения (A). Проточная цитометрия Анализ Gr-1 ⁺ (B) и Gr-1 ^- (C) фракции после autoMACS обогащения Gr-1 ⁺ клеток от объединения наивно leuckocytes окрашивали Gr-1-PE антитела и анти-PE микрошарики. Проточная цитометрия Анализ MDSC и Gr-1 ⁺ проценты после autoMACS обогащения Gr-1 ⁺ клеток от объединения наивно лейкоцитов (D) по сравнению с не-обогащенного объединенных лейкоцитов из опухоли мышей (E) (наивный мышей, п = 5 , опухоли мышей, п = 3). MDSC и Gr-1 проценты в закрытом представитель участков контура и гистограммы.

Это подробный метод для обработки и immunophentyping MDSC населения, которые применимы к различным лимфоидной ткани различных животных моделях. В частности, autoMACS обогащения может быть использован для выделения различных групп населения, включая лейкоцитарную Gr-1 истощения спленоцитов ^4, очистка миелоидной подмножеств из селезенки и лимфатических узлов ^5, изоляция нейтрофилов костного мозга ¹⁴ и очистки CD8 ⁺ Т-клетки селезенки и лимфатических узлов ^15. Вне зависимости от популяции клеток интересов, создание одноклеточных суспензий лейкоцитов от желаемого лимфоидной ткани необходимы для оптимального окрашивания поверхности, анализа проточной цитометрии, autoMACS обогащения и FACS сортировки. В этом протоколе, мы использовали механический диссоциации создать единую суспензии клеток лейкоцитов. Однако, использование ферментов пищеварения, таких как коллагеназы D также является адекватной альтернативой этому протоколу увеличитьвыхода лейкоцитов из селезенки или других лимфоидных органов ^5.

Проточная цитометрия является важной техникой для иммунофенотипирование лейкоцитов. Таким образом, надлежащим образом подготовиться к проточной цитометрии и обогащение также требует использования соответствующих буферов для клеточной суспензии и разведение антител реагенты. Многие протоколы поочередно FBS и BSA подготовки окрашивания СМИ и MACS буфера. Тем не менее, эти реагенты также коммерчески доступны от таких компаний, как eBioscience, BD Pharmingen и Miltenyi Biotec. Как пояснил Miltenyi Biotec и eBioscience, как BSA и FBS предотвращения неспецифического связывания, когда окрашивание лейкоцитов с флуорохромом конъюгированных антител. Более того, низкий процент этих животных белков сыворотки поддерживать жизнеспособность и предотвращения слипания лейкоцитов ^16. Тем не менее, исходя из нашего опыта, BSA работает лучше для оптимального окрашивания и лучшее разрешение для обогащения autoMACS чем FBS и рекомендациямДед в описанном протоколе.

В этом протоколе мы характеризуется использованием мышиных MDSC CD11b-FITC и Gr-1-APC флуоресцентных антител, конъюгированных и проточной цитометрии. Крайне важно, чтобы титровать эти антитела до использовать для снижения высокой окрашивания флуоресценции фон для предотвращения неоптимальным результатам. Кроме того, при выборе антитела для анализа многоцветной проточной цитометрии, возможно спектрального перекрытия флуорохромами еще один важный фактор следует рассматривать ^17,18. Таким образом, компенсация элементов управления в виде отдельных пятен цвета для каждого fluorochome конъюгированных антител процентов или компенсации бусы, можно исправить по вопросам спектрального перекрытия ^18. Еще одним важным фактором для получения точных результатов проточной цитометрии является использование жизнеспособность красителей. Мертвые клетки могут неспецифически связываются с антителами, создавая ложные положительные результаты ^19. В этом протоколе, мы используем нуклеиновой кислоты, пятно, DAPI как жизнеспособность краскиисключить мертвые клетки из нашего анализа, как это лучше всего дополняет панель флуорохромом конъюгированных антител используется с минимальными спектрального наложения. Однако, другие красители жизнеспособность таких как 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) и пропидия йодид (PI) могут быть использованы с описанными методами окрашивания в зависимости от панели антител используется. В настоящее время существует также ряд поправимо мертвые пятна клетки доступны, которые позволяют окрашенные клетки должны быть установлены и проницаемыми, не теряя способность различать жизнеспособность (Invitrogen). В целом, другие методы окрашивания также важны для точного анализа проточной цитометрии. Например, в этом протоколе, использование 96-и V-днища позволяет маленьким, концентрированной объемы клеток и реагенты, которые будут использоваться для анализа MDSC и лейкоцитов проценты методом проточной цитометрии. Использование Master Mix (ММ) подход также является важным техника за равный иммунофлюоресценции маркировки лейкоцитов в небольших объемах, используя либо 96-и V-нижний плТочные или FACS трубы. Эти методы снижения риска перекрестного загрязнения образцов, поддерживать стерильную антител и уменьшения количества реагентов и антител используется.

Сепаратор autoMACS Pro позволяет эффективно и автоматизированных изоляции клеточных популяций из нескольких образцов, в любой вид. В этом протоколе, косвенные магнитной маркировки лейкоцитов использованием Gr-1-PE антитела и микрошариков магнитного PE используется для обогащения autoMACS Gr-1 ⁺ лейкоциты. Эта процедура может быть модифицирована для использования autoMACS разделение микрошарики других флуорохромом сопряженных, биотинилированного и неконъюгированного первичных антител для обогащения различных клеточных популяций ^20. Тем не менее, в этой процедуре, мы настоятельно рекомендуем использовать PE-конъюгированных антител и анти-PE-микрошариков в отличие от FITC например, молекулы полиэтилена, как говорят, есть несколько сайтов связывания, в результате чего сильнее и лучше магнитной маркировки (Miltenyi Biotec ). Другой рossible модификации этого протокола является использование прямой магнитной маркировки, поскольку есть большое разнообразие MACS микрошарики для изоляции человека, мыши и крысы лейкоцитов (Miltenyi Biotec). Тем не менее, косвенное использование магнитной маркировки флуорохромом сопряженных первичных антител позволяет проточной цитометрии оценки обогащенные или обедненные фракции лейкоцитов без необходимости дополнительного окрашивания. Есть также целый ряд MACS сепараторы доступны, но сепаратор autoMACS Pro система выгодна, так как позволяет на высокой скорости, автоматическую сортировку до шести образцов для нежной выбор весьма жизнеспособной лейкоцитов по сравнению с ручной MACS сепараторы. Тем не менее, руководство MACS сепараторы соответствующие альтернативы сепаратор autoMACS Pro, если таковые имеются. Для дальнейшего обогащения наивно Gr-1 ⁺ лейкоциты, потенциал модификации этого протокола будет повторно запустить положительно собираемой фракции с использованием новой колонке autoMACS на autoMACS Pro сепаратор. ОбогащениеОг-1 ⁺ опухолями лейкоцитов помощью сепаратора autoMACS Pro не рекомендуется в этот протокол, так как это приводит к значительному снижению восстановления Gr-1 фракции, поскольку эти клетки, как правило, придерживаются колонны во время обогащения по сравнению с наивным лейкоцитов . Таким образом, этот протокол настоятельно рекомендует объединения опухоль лейкоцитов для последующей сортировкой FACS жизнеспособных MDSC.

Предварительно обогащенный, объединенных наивно лейкоцитов и объединенный с опухолями лейкоцитов может использоваться для будущих приложений, таких как низкая скорость FACS сортировки для выделения MDSC населения. Этот протокол разработан специально, чтобы обойти утомительный и своевременно FACS сортировки MDSC от наивных мышей, который должен существенно снизить процент MDSC. AutoMACS обогащения Gr-1 ⁺ лейкоцитов из наивных мышей затем позволяет оперативно, удобно и эффективно FACS сортировки жизнеспособного и функционального MDSC для использования их в естественных условиях и вВ лабораторных экспериментах. Прямая сортировка скромный выразил клеточных популяций, такие как наивные MDSC очень неэффективный процесс длительный раза рода, высокой стоимости и снижения восстановления клеток и жизнеспособность. Подготовка и autoMACS обогащения Gr-1 ⁺ лейкоцитов из наивных мышей занимает около 45 минут и увеличивает MDSC процентов больше чем в 4 раза (рис. 1). Это обогащение сокращает время FACS сортировки примерно 12 часов, не обогащенную лейкоцитами примерно 20-30 минут для выделения по крайней мере, 1x10 ⁶ жизнеспособным, обогащенный MDSC от объединения наивно лейкоцитов. Тем не менее, FACS сортировки жизнеспособных MDSC из не обогащенная, объединенных лейкоцитов из опухоли мышей потребует меньше времени, в связи с повышенным обилием MDSC процентов в ответ на опухоли. Важно отметить, что отсортированы MDSC и других лейкоцитов может быть использована как функциональный анализы, такие как смешанные лейкоцитарной реакции (MLR) 4, а в естественных условиях приемными экспериментов передачи ^21, а также в нефункциональных тестов в том числе QRT-PCR ^22, Western Blot ²³ и цитоспин / микроскопии анализ ^14. В целом, этот протокол может быть модифицирована для иммунофенотипирование и обогащение иммуносупрессивных и других лейкоцитов из лимфоидной ткани или периферической крови у мышей, крыс и людей, которые будут использоваться во множестве в естественных условиях и в пробирке тестов.

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы признаем цитометрии USF ядро ​​потока фонда. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дениз Купер для совместного использования ресурсов. Мы также хотели бы поблагодарить майя Коэн, Лаура Пендлтон и Диана Латур за помощь в создании и съемках этого видео. Н.Н. поддержке NSF FG-LSAMP мост доктора стипендий HRD # 0929435. Эта работа финансировалась American Cancer Society институциональных исследований грант № 93-032-13/Moffitt онкологический центр награжден TG.