フローサイトメトリーおよび自動化された磁気活性化細胞選別（AutoMACS）を使用して、ナイーブ膵腫瘍を有するマウスからミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）の調製

これは、ミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）をイムノおよびGr-1を豊かにし、迅速かつ包括的な方法です ^{+白血球。このメソッドは、実行可能なGR-1に濃縮するために選別フローサイトメトリーとAutoMACSセルを使用しています +白血球と in vitroでアッセイ。}

MDSCは、寄生虫感染、炎症、外傷後ストレス、移植片対宿主病、糖尿病や癌^1から7を含む病理学的条件下でリンパ系器官に蓄積される未熟なマクロファージ、樹状細胞および顆粒球の不均一な集団である。マウスでは、MDSCエクスプレスMAC-1（CD11bを）とGR-1（Ly6GとLy6C）の表面抗原^7。 MDSCはよくそれらが大幅に拡大し^、7月10日ナイーブな対応に比べて抗腫瘍免疫応答を抑制されている各種担癌宿主内で研究されていることに注意することは重要です。しかし、病態に応じて、抑制^11,12の別個のメカニズムやターゲットとMDSCの異なる亜集団が存在する。したがって、実行可能なMDSC集団を分離するための効果的な方法は、in vitroおよび in vivo で抑制のそれぞれ異なる分子メカニズムの解明において重要である。

最近、Ghansahグループは、マウスの膵臓癌モデルでMDSCの拡大を報告しています。私たちの担癌MDSCは、恒常性の損失を表示し、ナイーブなMDSC ¹³に比べて抑制機能を増加させた。 MDSC割合はナイーブ対担癌マウスのリンパ系のコンパートメントで有意に少なくなります。これは、しばしばこれらのMDSCの正確な比較分析を妨げている主要な警告です。したがって、前の蛍光活性化セルソーティング（FACS）にナイーブマウスからのGr-1 ⁺白血球を豊かにすると、純度、生存率を高め、大幅にソート時間が短縮されます。これらはソートクイックFACSのために豊富にありますしかし、担癌マウスからのGr-1 ⁺白血球の濃縮はオプションです。したがって、このプロトコルでは、我々はMDSCをイムノタイムリーにMDSCをソートするためのナイーブマウスの脾臓からのGr-1 ⁺白血球を濃縮する非常に効率的な方法を説明します。免疫C57BL / 6マウスは、マウスPanc02 CEを接種するナイーブなマウスは、1XPBSを受け取るのに対し、皮下LLS。約30日後に接種、脾臓細胞解離ふるいを使用して単一細胞懸濁液に収穫し、処理されます。脾細胞は、その後赤血球（RBC）を溶解し、これらの白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いた免疫表現型MDSC割合にMac-1とGR-1に対する蛍光標識抗体を用いて染色されています。平行実験で、ナイーブマウスからの全白血球は蛍光標識のGr-1抗体、PE-MicroBeadsでインキュベートし、積極的に自動化された磁気活性化細胞選別（autoMACS）プロ区切り記号を使用して、選択した状態で染色されています。次に、GR-1 ⁺白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いてMDSC割合の増加を識別するためにMac-1抗体で染色されています。今、これらのGR1 ⁺濃縮白血球は 、in vivo および in vitro での比較分析（ナイーブ対担癌）で使用するMDSCのソートFACSの準備ができている

開始する前に、次の解決策を準備します。

3％の染色メディア（SM）：

1Xリン酸緩衝生理食塩水で3％ウシ胎児血清（FBS）（PBS）

MACSバッファー（MB）：

- 1XPBSでウシ血清（BSA）から0.5％アルブミン

1。マウスから収穫脾臓

1. 皮下に100μlの1X PBS（; TB担癌）に懸濁し、1.5×10 ⁵マウスPanc02細胞と年齢C57BL / 6マウス（Harlan）の6-8週間を注入します。コントロールマウス（ナイーブ）100μlの1XPBSを受信します。
2. 約4週間ポスト噴射、二酸化炭素窒息によりマウスを安楽死させる。
3. 鉗子とハサミを用いて鈍的切開によるマウスから収穫の脾臓は、バランスを使用して重量を量る。別の場所の脾臓では、1×PBSを含む50 mlのコニカルチューブにラベルを付けました。

2。シングルセルサスペンシオを生成します。脾臓から白血球のn

すべての手順は、生物学的安全フードや氷上で保存細胞および抗体の下で無菌環境で実行する必要があります。

1. 底に向かってカップの開口部にメッシュスクリーンを挿入することにより、細胞解離ふるいを組み立てます。次に、このような場所に画面を保持し、マイナス側でスレッドの領域に保持リングを挿入し、固定リングを締めリングキーを使用します。 10ミリリットル1×PBSを含むペトリ皿の中で組み立てられたふるいを置きます。
2. プールの脾臓および細胞解離ふるいのメッシュスクリーンに対しても、ペトリ皿に脾臓を挽くためにガラスの乳棒を使用しています。マウスの各治療群に対して、この手順を繰り返します。
3. 70μmのセルストレイナーと5ミリリットル血清ピペットを用いて50 mlコニカルチューブにフィルターを細胞懸濁液。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）で遠心します。
4. 脾臓あたり5ミリリットル×1 RBC溶解緩衝液上清とペレットを再懸濁しを削除します。。精力的に上下にピペッティング。室温で5分間インキュベートします。 1×PBS 20 mlを加えて反応を停止します。精力的に上下にピペッティング。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）で遠心します。
5. 20ミリリットル滅菌1×PBSで上清とペレットを再懸濁しを削除します。精力的に上下にピペッティング。
6. 50μlのは^{5×5×10 6個の}細胞（ - 2×10 ⁷細胞/ mlの1×10 ⁷細胞/ ml）と等価になるようにトリパンブルーと3％のSMの所望の濃度で再懸濁し血球を用いて細胞をカウントします。

3。フローサイトメトリーを用いてMDSCの細胞表面染色/免疫表現型

1. （; MAC-1-FITC、GR-1-APCとDAPIはありませんステイン、NS）制御と補償コントロールの実験試料と単一の汚れのために96ウェルVボトムプレートのウェルにラベルを付けます。
2. 96ウェルV底プレートのそれぞれのウェルに脾細胞を50μl/ウェルに相当する^{5×5×10 6個の}細胞を追加します。遠心分離5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）でプレート。
3. 氷上で1.5 mlのマイクロ遠心チューブに、3％のSMで希釈したマウスのBDのFcブロック（ラット抗マウスCD16/32モノクローナル抗体）の "マスターミックス"（MM）を準備します。出発点として、1ウェルあたり50μlの最終容量に対して3％のSMで1μgのFcのブロックを使用しています。
4. 慎重に細胞ペレットを中断することなく廃棄物の容器やシンクの上に、プレート上にバックをすばやく反転させ、96ウェルV底プレートの各ウェルから上清を除去します。
5. Vortexは、簡単に5秒間のFcブロックMMを遠心分離し、96ウェルV底プレート内のすべてのペレットに50μlを加える。静かに彼らのウェルにサンプルを残して、上下にピペッティングでよく混ぜる。氷上、暗所で15分間プレートをインキュベートします。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心分離します。
6. サンプルは、Fcブロックでインキュベートしながら、氷の上で1.5ml微量遠心チューブに3％のSMで希釈した蛍光標識抗体の "マスターミックス"（MM）を準備します。抗体は、滴定されるべき染色手順のための最適な希釈を決定します。出発点として、よくサンプルあたり、50μlの最終容量に対して3％のSMで1時25 MAC-1-FITCの希釈およびGr-1-APCの1:20希釈を兼ね備​​えています。
7. 前述のように慎重に、96ウェルV底の各ウェルから上清を除去します。
8. Vortexは、簡単に5秒間蛍光標識染色抗体のMMを遠心分離や制御、実験ペレットに50μlを加える。優しく上下にピペッティングでよく混ぜる。単染色補正のために、ウェルあたり50μlの最終容量の3％のSMは、Mac-1-FITC、GR-1-APCの1:20希釈およびDAPIの75 ng / mlで、1:25希釈を追加するそれぞれのウェルに。 （ステインはありません）も無染色に50μlの3％のSMを追加します。よく混ぜ、氷上、暗所で30分間、96ウェルV底プレートで細胞をインキュベートします。
9. 96ウェルV底プレートの各ウェルに対応するラベルのFACSチューブ（5ミリリットル、12ミリメートル×75 mmのポリスチレン丸底チューブ）。各FACSに200μlの3％のSMを追加します。チューブ。
10. 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心し、上清を除去します。各ペレットに100μlの3％のSMを追加することによってペレットを洗浄し、優しく上下にピペッティングでよく混ぜる。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心分離します。もう一度手順洗浄を繰り返します。
11. 前述のように慎重に、96ウェルV底の各ウェルから上清を除去します。 100μlの3％のSMの各ペレットを再懸濁し、よく混ぜる。
12. 96ウェルV底プレートの各ウェルからのそれぞれ標識したFACSチューブにペレットを再懸濁し、100μlを転送します。
13. 前のフローサイトメトリー分析には、制御と実験試料とDAPI染色、単一の補償制御を75 ng / mlのDAPIを追加します。
14. MDSC割合のフローサイトメトリーのデータ収集を実行します。負（無染色コントロール）と単一の陽性コントロールを使用して補正を行います。そのように、ログスケールの前方（FSC）対側方散乱（SSC）が表示され、ドットプロットを設定するの白​​血球集団興味を識別することができます。破片と最低前方と側方散乱の塊を除く、全ての白血球に大きなゲートを描画します。この親ゲートから、DAPI-（ライブ）細胞上でSSC対DAPIとゲートを表示する新しいドットプロットを作成します。この新たにゲート人口を選択し、ダブルポジティブ上のMac-1とGR-1とゲートが表示されます。ドットプロットを作成する（Mac-1 ⁺ GR-1 ^+）MDSC。

4。 GR-1 ⁺白血球の磁気濃縮

1. 5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で適切に標識されたFACSチューブと遠心分離機にアリコート^{1×10 7}残りの染色白血球。
2. 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内でのGr-1-PE抗体のMMを準備します。 10 ^7個の細胞までについては、サンプルあたり50μlのMB、にのGr-1-PE抗体の1:10希釈を使用しています。大きなセル番号については、それに応じてボリュームをスケールアップ。簡単に言うと、5秒間遠心FACSチューブ内の白血球に加え、4℃、15分暗所でインキュベートします。
3. 、FACSチューブにMBの2ミリリットルを追加し、5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で遠心し、上清を捨てる。
4. 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに抗PE MicroBeadsはMMの準備をします。 10 ^7個の細胞までは、サンプルごとに、200μlのMBでの抗PE MicroBeadsでの1:4希釈を使用しています。大きなセル番号については、それに応じてボリュームをスケールアップ。簡単に言うと、5秒間遠心FACSチューブ内の白血球に加え、4℃、15分暗所でインキュベートします。
5. 、FACSチューブにMBの2ミリリットルを追加し、5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で遠心し、上清を捨てる。 SBの3 mlのペレットを再懸濁します。新しい、標識された50 mlコニカルチューブに70μmのストレーナーを介してフィルタリングします。
6. 作成し、内閣総理オートMACSプロセパレータ。適切なソリューションと空の廃液ボトルと詰め替えはすべてのボトルは、必要に応じて。楽器の電源を入れ、初期化後に液体容器や列（s）の状態を調べる。すべてのシンボルは緑色でなければなりません。メニューには、上部から "分離"を選択してくださいメニューバーには、下のメニューバーから "今すぐ洗い"が続く。プライミング処理を開始するために "実行"に続いてポップアップオプションから "すすぎ"を選択します。プライミング処理が正常に完了すると、測定器は、それが[ステータス]メニューの下の "分離のための準備"であることが表示されます。
7. 行Bの否定的なフラクションコレクションと行のCの肯定的なフラクションコレクションのために15 mlコニカルチューブの行、50 mlコニカルチューブに磁気標識した細胞をチューブのサイズと場所に適した冷却したチューブのラック50mlコニカルチューブを選択します。
8. サンプルから区別するモードで標識した標的細胞のポジティブセレクションのための "POSSEL_S"細胞分離プログラムを選択します。磁気標識した標的細胞をオートカラムに保持されます。非標識細胞は磁石の自動後退の行Bに負の分数のコレクションチューブに放出され、標識した標的細胞は、チューブの行Cで正のコレクションチューブに放出されます。ラック。

5。 GR-1 ⁺充実した白血球のポストソート分析

1. GR-1 ⁺とGR-1を再集計^-トリパンブルーと血球計を使用した画分を。 3％の染色培地中の所望の濃度で再懸濁した細胞を50μlの^{5×5×10 6個の}細胞（1×10 ⁷細胞/ ml - 2×10 ⁷細胞/ ml）と等価であるように、それに応じて標識されたFACSチューブに50μlを転送します。
2. サンプルあたり50μlの最終容量の3％のSMで1:25希釈で、唯一のMac-1のMMを準備します。細胞を染色し、フローサイトメトリー分析用G​​R-PEは、Mac-1 FITCおよびDAPIの単一の染色補正を準備します。前述のように200μlの3パーセントのSMとDAPI生存染料を追加します。
3. パーセンテージもMDSC割合事前·事後autoMACS濃縮を比較する^{- GR-1 +}とGR-1を決定するためにフローサイトメトリーのデータ収集を実行します。

6。代表的な結果

ここでは、rを示す MDSC（ 図1）の並べ替え、その後のFACSのためにプールされた、ナイーブ脾臓からのGr-1 ⁺白血球のautoMACS濃縮用epresentative結果。 ^{1×10 6}ナイーブ白血球前autoMACSのソートに、BD LSRII器を使用してMDSC割合を識別するには、Mac-1-FITCとGr-1-APC抗体で染色した。 ^{1×10 7}ナイーブ白血球はその後autoMACS Proの区切り記号を使用して、GR-1 ⁺白血球の濃縮のためにAnti-Gr-1-PE抗体およびPE-MicroBeadsを用いて染色した。ポストautoMACSの濃縮は、GR-1 ⁺とGR-1 GR-1の割合^-収集した画分はフローサイトメトリーを用いて評価した。 1×10 ⁶のGr-1 ⁺白血球は、フローサイトメトリーによって腫瘍を白血球をプールし、非濃縮する濃縮のMDSC割合、プールされたナイーブな白血球を分析し、比較するには、Mac-1-FITC抗体で除去し、染色した。

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ソートMDSC FACS用ナイーブGR-1 ⁺白血球の図1。AutoMACS濃縮。脾臓、膵臓腫瘍を有するとナイーブなマウスから採取し、単一細胞懸濁液に加工された。ナイーブな白血球表面のフローサイトメトリー分析の前autoMACS濃縮（）には、Mac-1とGR-1蛍光標識抗体で染色した。 GR-1 ^+（B）とGR-1のフローサイトメトリー分析^{- GR-1-PE}抗体と抗PE MicroBeadsで染色し、プールされたナイーブleuckocytesからのGr-1 ⁺細胞の（C）分画のポストautoMACS濃縮。 MDSCおよびGR-1のフローサイトメトリー分析のGr-1 ⁺の割合はポストautoMACS濃縮担癌マウス（E）から非濃縮プールされた白血球（ナイーブマウス、n = 5の場合と比較して、プールされたナイーブな白血球（D）から⁺細胞、担癌マウス、n = 3）で。 MDSCおよびGr-1の割合は、代表的なコンタープロットとヒストグラムのゲートがあります。

これは、様々な動物モデルから別のリンパ組織にも適用可能であるMDSC集団を処理し、immunophentypingの詳細な方法です。特に、autoMACSの濃縮は、脾細胞⁴のGR-1の枯渇、脾臓細胞、リンパ節⁵から骨髄のサブセットの精製、CD8の骨髄好中球¹⁴の単離および精製⁺脾臓からT細胞を含む種々の白血球集団の分離に使用することができますとリンパ節^15。かかわらず、興味のある細胞集団の、所望のリンパ系組織から白血球の単細胞懸濁液を生成し、最適な表面染色、フローサイトメトリー分析、autoMACS濃縮およびFACSソーティングに必要とされています。このプロトコルでは、白血球の単細胞懸濁液を作成するために機械的な解離を使用していました。しかし、このようなコラゲナーゼDなどの酵素消化を使用して増やすことも、このプロトコルに適切な代替手段です。脾臓または他のリンパ器官⁵から白血球の収量。

フローサイトメトリーは、免疫表現型の白血球のための重要なテクニックです。したがって、フローサイトメトリーと濃縮のための適切な製剤はまた、細胞懸濁液と抗体試薬の希釈のために適切なバッファを使用する必要があります。染色メディアとMACSバッファーを調製するためのFBSとBSA間の代替の多くのプロトコル。しかし、これらの試薬は、ベイバイオサイエンス、BD Pharmingen社とミルテニーバイオテク社などの企業からも市販されている。ミルテニーバイオテク社とベイバイオサイエンスで説明したように、蛍光標識抗体を用いて白血球を染色する際、BSAとFBSの両方が、非特異的結合を防ぐことができます。さらに重要なことは、これらの動物の血清蛋白質の低割合は生存性を維持し、白血球の¹⁶の凝集を防ぎます。しかしながら、我々の経験から、BSAは、最適な染色およびFBSよりautoMACS濃縮のためのより良い解決のために良い作品とrecommenです記述されたプロトコルでDED。

このプロトコルでは、CD11bを-FITCとGr-1-APC蛍光標識抗体とフローサイトメトリーを用いてマウスMDSCを特徴とする。これは、非最適な結果を防ぐために、高いバックグラウンドの蛍光染色を低減するために使用する前にこれらの抗体を滴定することが不可欠です。さらに、多色フローサイトメトリー分析用の抗体を選択する際に、蛍光色素のスペクトルの重複可能性も^17,18に考慮すべき別の重要なファクターです。したがって、利益または報酬ビーズの各fluorochome標識抗体の単一色の染みの形で補償制御、スペクトルのオーバーラップ¹⁸の問題を修正することができます。正確なフローサイトメトリーの結果のもう一つの重要な考慮事項は、可能性染料を使用することである。死んだ細胞は、非特異的にこのように偽陽性の結果^19を作成^し 、抗体に結合することができます。このプロトコルでは、我々に生存率の染料として染色核酸、DAPIを使用しそれは最高の最小限のスペクトルの重複で使用蛍光標識抗体のパネルを補完するように我々の分析から死細胞を除外します。しかし、このような7 Aminoactinomycin D（7-AAD）とヨウ化プロピジウム（PI）などの他の可能性染料が使用される抗体のパネルに応じて説明した染色法で使用される可能性があります。現在、染色した細胞は生存率（Invitrogen）を識別する能力を失うことなく、固定、膜透過できるように利用できる固定可能死細胞染色の数もあります。全体として、他の染色技術は、正確なフローサイトメトリー分析のためにも重要である。たとえば、このプロトコルでは、96ウェルV底プレートを使用すると、細胞とフローサイトメトリーを用いてMDSCおよび白血球百分率の分析に使用する試薬の小、濃縮されたボリュームを可能にします。マスターミックス（MM）アプローチの使用はまた、いずれかの96ウェルV底のPLを使用して少量の白血球の平等な免疫蛍光ラベリングのための重要なテクニックですATEまたはFACSチューブ。これらの技術は、サンプルのクロスコンタミネーションのリスクを軽減する無菌の抗体を維持し、使用する試薬や抗体の量を減らすことができます。

autoMACS Proのセパレータは、任意の種で、複数のサンプルからの細胞集団の効率的かつ自動化された分離が可能になります。このプロトコルでは、GR-1-PE抗体と磁気PE MicroBeadsを用いて白血球の間接磁気標識は、GR-1 ⁺白血球のautoMACSの濃縮に使用されます。このプロシージャは、様々な細胞集団²⁰の濃縮のための他の蛍光標識、ビオチン化と抱合した一次抗体にMicroBeadsを用いてautoMACS分離のために変更することができます。 PE分子は複数の結合部位を持っていると言われしかし、この手順では、我々は非常にこのように強く、優れた磁気標識（Miltenyi Biotec社で、その結果として、例えば、FITCとは対照的に、PE標識抗体と抗PE-マイクロビーズを使用することをお勧めし。）別のカテゴリーヒト、マウス、ラットの白血球の分離（Miltenyi Biotec社）のためのMACS MicroBeadsは、さまざまながありますので、このプロトコルにossible変更が直接磁気標識の使用です。しかし、蛍光標識一次抗体を用いて間接磁気標識には、追加染色を必要とせずに濃縮または枯渇白血球分画のフローサイトメトリーの評価が可能になります。そこに利用できるMACSセパレーターの様々なもあるが、それは非常に現実的な白血球の穏やかな選択のための6つのサンプルまでの高速、自動化されたソートを可能にするとしてautoMACS Proのセパレータシステムは、マニュアルMACSセパレーターに比べて、有利である。可能であればただし、手動MACSセパレーターは、autoMACS Proのセパレータに適した選択肢です。さらにナイーブGR-1 ⁺白血球を豊かにし、このプロトコルに潜在的な変更は、autoMACS Proのセパレータに新しいautoMACS列を使用して、再実行して積極的に収集した画分になります。充実これらの細胞はナイーブ白血球と比較して濃縮時に列に ​​固執する傾向があるので、GR-1のautoMACS Proのセパレータを使用して⁺腫瘍を白血球がGR-1画分の回収が大幅に減少、この結果から、このプロトコルで推奨されていません。したがって、このプロトコルは強く可能なMDSCのソート、その後のFACSプーリング担癌白血球をお勧めします。

プレ濃縮、プールされたナイーブ白血球およびプールされた腫瘍を白血球はそのようなMDSC集団を単離するためのソート低速FACSなど、将来のアプリケーションに使用できます。このプロトコルは、特にMDSCの有意に低い割合によるものであるナイーブマウスからMDSCのソート退屈かつタイムリーなFACSを回避するために設計されています。ナイーブマウスからのGr-1 ⁺白血球のAutoMACS濃縮は、in vivoでのそれらの使用のために実用的で機能的なMDSCのソートは、プロンプト便利で効率的なFACSを可能にし、in vitroの実験インチそのようなナイーブなMDSCとして卑しい発現する細胞集団の直接のソートは、ソート長い時間、高コストと低細胞の回復と生存率と非常に非効率的なプロセスです。ナイーブマウスから調製とGR-1 ⁺白血球のautoMACS濃縮は約45分、4倍（ 図1）よりMDSC割合以上に増加します。この濃縮は、プールされたナイーブな白血球から少なくとも1×10 ^6個の生存、濃縮MDSCを単離するための約20-30分に非濃縮白血球の約12時間からソートFACSの時間が短縮されます。ただし、非濃縮の可能なMDSCのソートFACSは、担癌マウスからプールされた白血球は腫瘍負荷に応答して、MDSCの割合の増加が豊富のために少ない時間を必要とします。ソートMDSCおよび他の白血球はそのような混合白血球反応（MLR）などの機能アッセイの両方で使用することができますことに注意することは重要です ^{4 および in vivoの養子移入実験21と同様に定量RT-PCR 22、ウェスタンブロット23およびサイトスピン/顕微鏡分析14を含む、非機能的アッセイインチ全体的に、このプロトコルは、免疫表現型および in vivoとin vitroアッセイの過多に使用されるマウス、ラットおよびヒトのリンパ組織や末梢血から免疫抑制および他の白血球の濃縮のために変更することができます。}

利害の衝突が宣言されません。

我々は、USFのフローサイトメトリーコアファシリティを認める。我々は、リソースを共有するためにドクターデニス·クーパーに感謝します。また、設定とこのビデオの撮影に、その支援のためのMayaコーエン、ローラペンドルトンとダイアナラトゥールに感謝します。 NNは博士号フェローシップHRD＃0929435にNSF FG-LSAMPブリッジによってサポートされています。この仕事はTGに授与米国癌学会機関研究助成＃93-032-13/Moffittがんセンターによって資金を供給された。