制备髓源性抑制细胞从幼稚和胰腺癌荷瘤小鼠，用流式细胞仪和自动磁性细胞分选（AutoMACS）（MDSC）

这是一个迅速和全面的免疫髓源性抑制细胞（MDSC）和丰富GR-1的方法 ^-从小鼠脾脏白细胞。这种方法使用流式细胞仪和AutoMACS细胞排序丰富可行的GR-1 ^-白细胞之前使用的MDSC排序，以流式细胞仪在体内和在体外检测。

的MDSC是一个不成熟的巨噬细胞，树突状细胞和粒细胞积聚在病理条件下的淋巴器官，包括寄生虫感染，炎症，创伤后应激，移植物抗宿主病，糖尿病和癌症^1-7异构人口。在小鼠的MDSC明示的Mac-1（细胞CD11b）和GR-1（Ly6G和Ly6C）表面抗原。重要的是要注意的MDSC荷，它们显着扩大在各个主机研究和压制^7-10天真对口相比抗肿瘤免疫反应。然而，根据病理状态，有不同的MDSC亚与不同的机制和抑制^11,12的目标。因此，有效的方法来隔离可行的MDSC人口是重要的，在阐明各自不同的分子机制抑制在体外和体内 。

近日，在Ghansah组报告的MDSC在小鼠胰腺癌模型的扩展。我们的肿瘤轴承的MDSC显示动态平衡的损失，并增加抑制功能比较幼稚的MDSC ^13。的MDSC的百分比显着天真与荷瘤小鼠的淋巴车厢。这是一个重大的警告，这往往阻碍了这些的MDSC准确的比较分析。因此，丰富天真小鼠GR-1 ⁺白细胞荧光激活细胞分选（FACS）前提高纯度，活力和排序的时间显着降低。然而，丰富的GR-1 ⁺荷瘤小鼠的白细胞是可选的，因为这些丰富的排序快速流式细胞仪。因此，在这个协议中，我们描述了一个高效的方法，免疫的MDSC从排序的MDSC及时天真小鼠脾脏和丰富的Gr-1 ⁺白细胞。免疫C57BL / 6小鼠接种小鼠Panc02 CE的LLS皮下而天真的小鼠接受1XPBS。大约30天接种后脾脏被采伐和加工成单细胞悬液采用细胞分离筛。脾然后红细胞（RBC）的裂解，这些白细胞等分对MAC-1和GR-1免疫的MDSC百分比用流式细胞仪使用荧光标记抗体染色。在一个类似的实验，从整个天真的小鼠白细胞染色与荧光标记的GR-1抗体，培养与PE的微珠和正选择使用一个自动化的磁性活化细胞分选（autoMACS）分离。接下来，GR-1 ⁺白细胞等份与Mac-1抗体染色，以确定在使用流式细胞仪的MDSC百分比增加。现在，这些GR1 ⁺丰富的白细胞是准备用于比较分析（天真与荷瘤） 在体内和体外的MDSC排序流式细胞仪

开始之前，请准备以下解决方案：

3％，染色媒体（SM）：

-3％的胎牛血清（FBS），1X的磷酸盐缓冲液（PBS）

磁珠缓存（MB）：

- 牛血清白蛋白（BSA）的0.5％白蛋白在1XPBS

1。收获从小鼠脾脏

1. 皮下注入1.5×10 ⁵小鼠Panc02细胞悬浮在100μL1X PBS 6-8周岁的C57BL / 6小鼠（哈伦）（荷瘤;结核病）。对照组（幼稚）收到100μL1XPBS。
2. 注射后约4周，安乐死小鼠二氧化碳窒息。
3. 收获从小鼠脾脏钝性使用镊子和剪刀剥离，然后重使用平衡。脾脏在不同的地方，打成50毫升含1×PBS的锥形管。

2。生成一个单细胞Suspensio的n的脾脏白细胞

所有程序应在无菌环境下的生物安全罩及细胞和抗体放在冰上。

1. 组装插入朝下方杯开幕丝网细胞分离筛。然后，扣环插入螺纹面积的开槽端和使用环的关键，拧紧固定环，从而控股到位的屏幕。将聚集在一个Petri菜含有10毫升1×PBS筛。
2. 池脾脏和使用玻璃杵研磨脾脏对细胞分离筛的筛网进入培养皿。各治疗组小鼠的重复。
3. 到50毫升锥形管使用70微米的细胞过滤器和5毫升血清移液器过滤细胞悬液。 12,000 RPM（250-300 XG）离心5分钟。
4. 取出5毫升1×每脾红细胞裂解液上清，重悬沉淀。吸取积极向上和向下。在室温下孵育5分钟。停止反应，加入20毫升1×PBS。吸取积极向上和向下。 12,000 RPM（250-300 XG）离心5分钟。
5. 取出20毫升无菌1×PBS上清，重悬沉淀。吸取积极向上和向下。
6. 50μL，相当于5X10 ^{5-1×10 6}细胞（1×10 ⁷细胞/ ml - 2×10 ⁷细胞/ ml）计数细胞，用台盼蓝和血球和所需的浓度在3％的SM重悬。

3。细胞表面染色/使用流式细胞仪免疫表型的MDSC

1. 96 V为控制和补偿控制的实验样品和单污渍底板标注的井（没有污点，生理盐水;的Mac-1-FITC; GR-1装甲运兵车和DAPI）。
2. 添加5X10 ^{5-1×10 6}细胞，相当于50 /脾到各自的井井液在96孔V型底板。离心分离板在5分钟转速12,000 rpm（250-300 XG）。
3. 准备“预混”鼠标BD FC块在3％的SM 1.5毫升离心管上的冰，稀释（大鼠抗小鼠CD16/32单克隆抗体）（MM）。作为一个起点，最终体积为50μL使用1微克，在3％的SM FC块，每口井。
4. 仔细取出上清液从每个井的96-V型底板的快速反相板和背面，不破坏细胞颗粒在一个废物容器或水槽。
5. 涡，短暂离心5秒FC块MM和添加50μL，在96孔V型底板所有颗粒。拌匀，轻轻吹打下来，留在他们的水井样品。孵育15分钟，在黑暗冰板。离心5分钟转速12,000 rpm（250-300 XG）板。
6. 准备“师父混合”（MM）的3％，在冰上的1.5ml离心管中的SM稀释的荧光标记抗体，而样品与FC块孵化。抗体应该被滴定染色程序，以确定最佳的稀释。作为一个起点，在3％的SM结合的Mac的1-FITC 1:25稀释和1:20稀释的GR-1-APC最终体积为50μL，每个样品以及。
7. 从每个井的96-V型底部小心取出上清液，作为先前所描述的。
8. 旋涡，短暂离心5秒共轭荧光染色抗体的MM，添加50μL，对照组和实验颗粒。轻轻吹打上下拌匀。对于单染色的赔偿，添加的Mac的1-FITC 1:25稀释，1:20稀释的GR-1-APC和75毫微克/毫升的DAPI，最终体积为50μL每口井的3％的SM各自的水井。加入50微升3％的SM不染井（无污点）。拌匀孵育细胞在96孔V型底板块在黑暗的冰上30分钟。
9. 标签流式细胞管（5毫升，12毫米×75毫米的聚苯乙烯圆底管）对应到每口井在96孔V型底部的板块。加入200μl3％的SM每个流式细胞仪管。
10. 离心转速12,000 rpm（250-300 XG）板为5分钟，去除上清。洗净加入100微升3％的SM每个颗粒颗粒混合，轻轻吹打上下。离心5分钟转速12,000 rpm（250-300 XG）板。重复洗涤步骤一次。
11. 从每个井的96-V型底部小心取出上清液，作为先前所描述的。每个颗粒和悬浮在100微升3％的SM，拌匀。
12. 转让的96-V型底板，以及从每100μL悬浮颗粒，他们分别标记的流式细胞仪管。
13. 流式细胞仪分析之前，添加75毫微克/毫升的DAPI控制和实验样品和单一的DAPI染色补偿控制。
14. 执行流式细胞仪数据采集的MDSC百分比。使用负（没有的污渍控制）和单阳性对照执行赔偿。设立这样一个点的情节，显示日志规模远期（FSC）与侧散射（SSC），白细胞人口可确定利益。画一个大的门，但不包括所有白细胞最低的前部和侧分散的碎片和团块。从这个父门，创建一个新的散点图显示南南合作的DAPI（直播）细胞与DAPI和门。选择这个新门的人口，并创建一个点图上显示您的双阳性的Mac-1与GR-1和门（MAC-1 ⁺ GR-1 ^+）的MDSC。

4。 GR-1 ⁺白细胞磁富集

1. 等分1×10 ⁷到适当标记的流式细胞仪管和离心机在12000转5分钟（250-300 XG）剩余未染色白细胞。
2. GR-1-PE抗体的MM准备在1.5 ml离心管。高达10 ⁷细胞，用50μLMB的一个GR-1-PE抗体1:10稀释，每个样品。对于更大的手机号码，相应扩展卷。短暂离心5秒钟，流式细胞仪管中的白细胞和孵育15分钟，在4°C黑暗环境中。
3. 加入2毫升的MB流式细胞仪管，离心5分钟转速12,000 rpm（250-300 XG），弃上清。
4. 准备在1.5 ml离心管的反体育微珠MM。高达10 ⁷细胞，用200μLMB的1:4稀释的反PE微珠，每个样品。对于更大的手机号码，相应扩展卷。短暂离心5秒钟，流式细胞仪管中的白细胞和孵育15分钟，在4°C黑暗环境中。
5. 加入2毫升的MB流式细胞仪管，离心5分钟转速12,000 rpm（250-300 XG），弃上清。重悬浮颗粒在3毫升的SB。通过70微米滤网过滤到一个新的，标有50毫升锥形管。
6. 准备和总理汽车磁珠临分离。所有笔芯瓶，如果有必要与适当的解决方案和空废液瓶。打开仪器检查液容器和初始化后列（S）的状态。所有的符号应该是绿色的。在菜单上，选择上“分离”其次是菜单栏“洗”从较低的菜单栏。选择“冲洗”，从弹出的选项“运行”开始启动过程。一旦启动过程成功完成后，仪器将显示，这是“分离”状态“菜单下。
7. 馏分收集和B行负在行C.积极馏分收集的15毫升锥形管排，50毫升锥形管的磁标记细胞选择适合管的尺寸和地方的50毫升锥形管冷冻试管架
8. 选择“POSSEL_S”积极选择敏感的模式，从样品中标记的靶细胞的细胞分离方案。磁标记的靶细胞被保留在自动贩卖机列;未标记的细胞释放到负的馏分收集管行B.在磁铁自动回缩，将标记的靶细胞释放到积极的收集管，行管ç机架。

5。 GR-1 ⁺浓缩白细胞后排序分析

1. 验票GR-1 ⁺和Gr-1 ^-使用台盼蓝和血球的分数。重悬细胞所需的浓度在3％的染色介质，使50μL相当于5X10 ^{5-1×10 6}细胞（1×10 ⁷细胞/ ml - 2×10 ⁷细胞/ ml）和50μL转移到相应标记的流式细胞仪管。
2. 准备仅适用于Mac-1的MM，在3％的SM终体积为50μL样品1:25稀释。染色细胞和单GR-PE，MAC-1 FITC和DAPI染色赔偿准备流式细胞仪分析。加入200微升3％，SM和DAPI可行性染料如前所述。
3. 执行流流式细胞仪的数据采集，以确定GR-1 ⁺和Gr-1 ^-比例也比较的MDSC百分比前和后autoMACS的富集。

6。代表结果

在这里，我们显示ŕ GR-1 ⁺汇集，天真的MDSC（ 图1）排序随后流式细胞仪脾脏白细胞富集autoMACS之代表结果。幼稚白细胞1×10 ⁶的Mac-1-FITC和GR-1-APC抗体染色，以确定使用的BD LSRII仪器的MDSC百分比，前到autoMACS排序。幼稚白细胞1×10 ^7，然后染色，抗GR-1-PE和PE的微珠富集GR-1 ⁺使用一个autoMACS临分离的白细胞抗体。后autoMACS富集，GR-1的百分比GR-1 ⁺和Gr-1 ^-收集馏分使用流式细胞仪进行了评价。 1×10 ⁶ GR-1 ⁺白细胞被拆除的Mac-1-FITC抗体进行分析和比较丰富的MDSC百分比，汇集非丰富，汇集通过流式细胞仪检测荷瘤白细胞的幼稚白细胞染色。

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图1。朴素GR-1 ⁺排序的MDSC流式细胞仪白细胞AutoMACS富集。胰腺癌荷瘤和天真的小鼠脾脏收获并加工成单细胞悬液。幼稚白细胞表面流与Mac-1和GR-1荧光标记的抗体染色流式细胞仪分析，autoMACS富集（一）前。流流式细胞仪分析GR-1 ^+（乙）和GR-1 - ^（）分数后autoMACS GR-1 ⁺细胞GR-1-PE抗体和抗PE的微珠染色汇集天真leuckocytes的富集。流仪分析的MDSC和Gr-1 ⁺百分比后GR-1-autoMACS富集汇集幼稚白细胞（四^）+细胞相比，非浓缩汇集来自荷瘤小鼠的白细胞（五）（天真的小鼠，每组5荷瘤小鼠，N = 3）。门代表的等高线图和直方图的MDSC和GR-1的百分比。

这是一个详细的方法处理和immunophentyping的MDSC人口，是适用于各种动物模型不同的淋巴组织。特别，autoMACS富集，可用于各种白细胞的人口，包括GR-1枯竭脾^4，从脾和淋巴结肿大⁵粒细胞亚群的净化，分 ​​离骨髓中性粒细胞¹⁴和纯化的CD8 ⁺ T细胞从脾隔离和淋巴结^15。无论所需的淋巴组织产生白细胞的单细胞悬液的细胞群体的利益，需要最佳表面染色，流式细胞仪分析，autoMACS富集和流式细胞仪分选。在这个协议中，我们采用机械分离，以创建一个单细胞悬液的白细胞。然而，使用胶原酶ð如消化酶也是一个适当的替代协议增加脾脏或其他淋巴器官白细胞的产量。

流式细胞仪是一种免疫白细胞的重要技术。因此，流式细胞仪和丰富充足的准备，也需要适当的缓冲区，悬浮细胞和抗体试剂稀释使用。胎牛血清和BSA之间的替代许多协议，准备染色媒体和磁珠缓冲区。然而，这些试剂是市面上​​如eBioscience，BD Pharmingen公司和天旎生物技术公司。由美天旎生物技术和eBioscience解释，BSA和胎牛血清染色与荧光标记的抗体的白细胞时防止非特异性结合。更重要的是，这些动物的血清蛋白的低比例保持活力，防止白细胞聚集^16。然而，从我们的经验，BSA的工作更好的最佳染色和更好的分辨率为autoMACS富集比胎牛血清是recommenDED中所描述的协议。

在这个协议中，我们的特点小鼠的MDSC细胞CD11b-FITC和GR-1-APC荧光标记的抗体和流式细胞仪。滴定这些抗体前使用，以减少高背景荧光染色，以防止非最优的结果，这是势在必行。此外，选择多色流式细胞仪分析的抗体时，可能的荧光光谱重叠也是另一个关键的因素要考虑^17,18。因此，补偿控制在每个利息或补偿珠fluorochome抗体的形式单一颜色的污渍，可以纠正^18个光谱重叠的问题。精确的流式细胞仪检测结果的另一个重要的考虑因素是使用的可行性染料。死细胞非特异性结合的抗体，从而造成假阳性结果^19。在这个协议中，我们使用作为可行性染料核酸染色，DAPI从我们的分析中排除的死细胞，因为它最好的补充，以最小的光谱重叠使用荧光标记的抗体面板。然而，其他7-Aminoactinomycin的D类（7-AAD）的碘化丙啶（PI）的可行性，如染料，可用于与所述染色方法取决于面板使用的抗体。目前，也有一些可修复的死细胞的污渍允许不失歧视的可行性（Invitrogen公司）的能力固定和透染细胞的。总体而言，其他染色技术也很重要，精确的流式细胞仪分析。例如，在这个协议中，使用96-V型底板允许小，大量的MDSC和白细胞的百分比，使用流式细胞仪分析细胞和试剂的集中。主混合（MM）的使用方法也是一个平等的免疫荧光标记在小体积的白细胞显着的技术，使用96 V型底部PLATES或流式细胞仪管。这些技术减少样品交叉污染的风险，保持无菌抗体和减少使用的试剂和抗体的数量。

autoMACS临分离，允许从多个样品的细胞群，在任何物种，高效和自动隔离。在这个协议中，间接使用GR-1-PE抗体和磁性体育微珠白细胞磁标签用于autoMACS GR-1 ⁺白细胞的浓缩。这个过程可以被修改为使用其他荧光标记，生物素和游离抗体微珠富集的各种细胞群²⁰ autoMACS分离。然而，在此过程中，我们强烈建议使用PE标记的抗体和抗PE的微珠作为反对以FITC标记为例，在PE分子据说有多个结合位点，从而导致更强，更好的磁标签（美天旎生物技术）。另一个Possible本协议的修改是直接磁标签的使用也有各种各样的人类，小鼠和大鼠的白细胞（美天旎生物技术）的隔离磁珠微珠。然而，间接磁性标记，用荧光标记的抗体，而不需要额外的染色允许流量仪白细胞组分浓缩或贫化评价。磁珠分离但autoMACS临分离系统是有利的，因为它允许高速自动分拣多达六个样本手册磁珠分离比较温和的选择高度可行的白细胞，也有多种。然而，手动磁珠分离，如果有合适的替代品的autoMACS临分离。为了进一步丰富天真的GR-1 ⁺白细胞，一个潜在的修改，该协议将重新运行正收集的部分上使用临分离autoMACS一个新autoMACS列。丰富GR-1 ⁺荷瘤白细胞使用autoMACS临分离不建议，因为这个结果在GR-1的分数恢复显着减少，因为这些细胞往往坚持在比较幼稚白细胞富集过程中的列在本协议。因此，这个协议强烈建议汇集随后的流式细胞仪肿瘤轴承白细胞的，可行的MDSC排序。

预富集，汇集了幼稚的白细胞和汇集肿瘤轴承白细胞，可以为未来的应用，如低速的MDSC种群隔离的分选流式细胞仪。该协议是专门设计的MDSC排序从天真的小鼠，这是由于显着降低的百分比的MDSC规避繁琐的和及时的流式细胞仪。 AutoMACS GR-1 ⁺从天真的小鼠白细胞富集，然后允许及时，便捷，高效的流式细胞仪，其在体内的使用排序可行的和功能的MDSC在体外实验。低表达的细胞群，如天真的MDSC直接排序是非常低效的过程冗长排序时间长，成本高，并减少细胞的恢复和生存能力。从天真的小鼠autoMACS GR-1 ⁺白细胞富集制备及大约需要45分钟，并增加超过4倍（ 图1）的MDSC百分比。这富集降低了时间约12小时的非富硒白细胞分类，约20-30分钟从幼稚白细胞汇集隔离至少1×10 ⁶可行的，丰富的MDSC的流式细胞仪。然而，流式细胞仪可行的MDSC排序从非浓缩，汇集从荷瘤小鼠的白细胞会需要更少的时间，由于大量肿瘤负担的MDSC百分比增加。重要的是要注意，然后，可以使用两种功能检测在混合白细胞反应（MLR），如排序的MDSC和其他白细胞 ^{4和21 在体内的过继转移实验以及非功能性的检测，包括定量RT-PCR，Western Blot检测23和细胞离心涂片/显微镜分析14。总体而言，该协议可以修改的免疫和免疫抑制和其他从小鼠，大鼠和人类的淋巴组织或外周血白细胞在体内和体外实验中使用了大量的丰富。}

没有利益冲突的声明。

我们承认USF流式细胞仪核心设施。我们想感谢丹尼斯库珀博士资源共享。我们也想感谢他们的协助玛雅科恩，劳拉·彭德尔顿和戴安娜拉图尔建立和拍摄这部影片。神经网络的支持NSF FG-LSAMP桥博士奖学金人力资源开发＃0929435。这项工作是由美国癌症学会院校研究资助＃93-032-13/Moffitt癌症中心颁发到TG。