Измененный Дрожжи-Two-гибридная система для идентификации белков Взаимодействие с фактор роста Progranulin

Мы модифицировали обычные дрожжи двугибридная скрининга, эффективный генетический средством выявления белковых взаимодействий. Эта модификация значительно сокращает процесс, снижает рабочую нагрузку, и, самое главное, снижает количество ложных срабатываний. Кроме того, этот подход является воспроизводимым и надежно.

Progranulin (PGRN), также известный как granulin epithelin предшественника (ПВС), является 593-амино-кислоты аутокринной фактора роста. PGRN как известно, играет важную роль в различных физиологических и болезненных процессов, в том числе раннего эмбриогенеза, заживление ран ^1, воспаления ^{2, 3} и ⁴ иммунной защиты. PGRN также функционирует как нейротрофический фактор ^5, а мутации в гене PGRN приводит к частичной потере причиной PGRN белка лобно-височной деменции ^{6, 7.} Наши недавние исследования привели к изоляции PGRN как важный регулятор хряща развития и деградации ^8-11. Хотя PGRN, обнаружили почти два десятилетия назад, играет решающую роль во многих физиологических и патологических состояний, усилия, направленные на использование действия PGRN и понять механизмы, участвующие были значительно препятствует нашей неспособности определить его связывание рецепторов (ы). Чтобы решить эту проблему, мы разработали модификациюFied дрожжей двух гибридных (MY2H) подход, основанный на наиболее часто используемые GAL4 основан 2-гибридной системы. По сравнению с обычными дрожжами двугибридная экран, MY2H резко сокращает экране процесс и снижает количество ложных положительных клонов. Кроме того, этот подход является воспроизводимым и надежно, и мы успешно используют эту систему в изоляции связывающих белков различных приманок, в том числе ионный канал ^12, внеклеточный белок матрицы ^{10, 13,} и фактор роста ^14. В этой статье мы описываем эту MY2H экспериментальная процедура подробно использованием PGRN в качестве примера, который привел к идентификации TNFR2 как первый известный PGRN связанных рецепторов ^{14, 15.}

1. Исходная информация

Дрожжей двугибридная система представляет собой мощный генетический метод, используемый для обнаружения белок-белковых взаимодействий ^{16, 17.} Несколько видов 2-гибридных систем, таких как LexA систем, основанных на системе Сос вербовкой, и бактерий или млекопитающих клеточной 2-гибридов, являются коммерческими доступны в настоящем документе особое внимание уделяется модификации наиболее часто используемых GAL4 основанные дрожжей 2-гибридной системы. Одним словом, метод основан на свойствах белка дрожжей GAL4, который состоит из сепарабельных области отвечают за ДНК-связывающих и транскрипционной активации. Приманки белка выражается в слиянии с GAL4 ДНК-связывающий домен (ДНК-BD), в то время как добыча белки экспрессируются как слияния с GAL4 активации домена (AD). Взаимодействие между приманкой и белков добычу слияние приводит к транскрипционной активаций GAL4-связывающие сайты, содержащие репортер гены, которые интегрированы в дрожжах гenome. Принцип Y2H проиллюстрировано на рис. 1 и экспериментальная процедура представлены на рис. 2.

2. Необходимые материалы и решения

1. YPD Средний прирост (смесь пептон, дрожжевой экстракт, и декстрозы в оптимальных пропорциях для выращивания большинства штаммов Saccharomyces CEREVISIAE).
2. Минимальные базисы SD (Минимальная синтетических определен (SD) основаниями являются базой дрожжей азота, сульфат аммония, и источником углерода, декстроза. Падением напряжения (DO) добавки могут быть добавлены к минимальной базы SD, чтобы сделать синтетические, определенной среде отсутствуют указанные питательных веществ).
3. Leu /-Trp падением напряжения (DO) дополнения (содержащих каждый незаменимая аминокислота, за исключением лейцина и триптофана)
4. -His/-Leu/-Trp/-Ura Падением напряжения (DO) Дополнение (содержащих каждый незаменимая аминокислота, за исключением лейцин, триптофан, гистидин и урацил)
5. Лурия бульон (LB) (триптон 10 г / л, дрожжевой экстракт 5 г / л, NaCl 5 г / л)
6. X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид) решение: подготовлены 20 мг / мл маточного раствора в N, N-диметилформамид
7. 10X TE (100 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ ЭДТА, автоклавного)
8. Сельдь ультразвуком или ДНК спермы лосося, вареные (10 мг / мл)
9. 10X LiAc (1 М ацетата лития, автоклавного)
10. 50% ПЭГ-3350 решение, фильтр-стерилизованное
11. 3-амино-1, 2, 4-триазола (3AT)
12. Канамицин
13. Ампициллин
14. ELECTROMAX DH5α клетки
15. Z буфера: 16,1 г Na2HPO4 7H2O (или 8,52 г безводного), 5,5 г NaH2PO4 H2O (или 4,8 ganhydrous), 0,75 г KCl, 0,246 г MgSO4 7H2O (или 0,12 г безводного), растворенных в 1 л автоклаве, дистиллированной воды и доводят до рН 7,0.

3. Приманка поколения (pDBLeu-PGRN)

КДНК PGRN кодирования фрагмент отсутствует сигнального пептида (aa21-588) было направленно клонированы в Сал-я не я сайты pDBLeu вектор (ProQuest две гибридные системы, Invitrogen),сохраняя тот же рамки считывания перевод как GAL4 ДНК-связывающий домен для создания pDBLeu-PGRN.

1. Amplify кДНК фрагмент PGRN описанным выше методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, предназначенных для размещения сайтов рестрикции (Сал я в 5'end а не я на 3'), чтобы в рамке синтеза.
2. Гель очищают ПЦР-продукт, дайджест с рестриктаз Сал Я и Не I.
   Подготовка DB вектор pDBLeu двойным пищеварения ограничение с тем же эндонуклеаз рестрикции.
3. Лигировать фрагмента ограничение PGRN в линеаризованной pDBLeu вектор и превращаются в DH5α с выбором для LB + канамицин при 25 мкг / мл.
4. Убедитесь, коррекция построить путем секвенирования ДНК.

4. Малый масштабного преобразования приманки плазмиды

1. Привить 5 мл YPD с колонией Mav203 (Invitrogen), встряхнуть в течение ночи при 30 ° C.
2. Развести ночной культуры в 50 мл YPD. Расти добавитьitional 2-4 часа.
3. Гранул клеток при 3000 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют гранул в 40 мл в автоклаве, дистиллированная вода.
4. Re гранул клеток. Ресуспендируют в 2 мл раствора I, инкубировать при комнатной температуре 10 мин.
   Решение I: 0,5 мл 10xLiAc, 0,5 мл 10xTE, 4 мл H ₂ O
5. Внесите ДНК для труб: 2-3 мкл pDBLeu-PGRN (0.25μg/μl) и 10 мкл денатурированные, стриженого ДНК спермы лосося (10μg/μl). Добавить 100 мкл клеток дрожжей, тщательно перемешайте.
6. Добавить 700μl решения II, хорошо перемешать. Инкубировать при температуре 30 ° С в течение 30 мин. Решение II: 0,2 мл 10xLiAc, 0,2 мл 10xTE, 1,6 мл 50% PEG3350.
7. Тепловой удар при 42 ° С в течение 15 мин.
8. Гранул в течение 2 мин. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 200 мкл в автоклаве, дистиллированная вода.
9. Пластина подвески на SD-Leu пластин с серийных разведений. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение 2-3 дней.

5. Приманка проверки

Перед выполнением дам с двумя гибридным экраном, тест-pDBLeu PGRN для самостоятельной активации и определения базовых уровней экспрессии HIS3 репортер гена. Этот тест определяет, является ли приманки активации транскрипции и ли самодеятельности может быть нейтрализован ингибиторами. 3-амино-1, 2, 4-триазола (3-В) является конкурентным ингибитором HIS3-генный продукт и может быть использован для титрования минимальный уровень HIS3 выражения, необходимые для роста на гистидин-дефицитных средств массовой информации.

1. Преобразование pDBLeu-PGRN на дрожжах Mav203 напряжения, пластины преобразования на SD-Leu тарелки, и инкубировать в течение 48-72 ч при температуре 30 ° C.
2. Патч колоний друг от трансформации с использованием автоклавного зубочистки на SD-Leu-His пластин, содержащих 3-АТ при концентрации 10 мм, 25 мм, 50 мм, 75 мм и 100 мм. 3-К является конкурентным ингибитором фермента HIS3 и только приманки, которые обладают самостоятельной активации будет иметь возможность расти в присутствии 3-АТ.
3. Приманка штаммы, которые растут на пластинах containiнг 100 мМ 3-АТ, не подходят для использования в двух-гибридным экраном. Для приманок, которые можно использовать, использовать низкие 3-AT концентрации, которая подавляет рост клеток. Во многих случаях, 25 мМ 3-AT используется для скрининга.

6. кДНК, скрининг библиотек

PDBLeu-PGRN плазмиды вводят в MaV203 использованием мелких преобразований, как описано выше. Внести pPC86 библиотеки (Invitrogen) в MaV203 (pDBLeu-PGRN), процедура, описанная ниже обычно дает ~ 4 х 10 ⁴ колонии с 0,5 мкг плазмидной ДНК библиотеки. Таким образом, 2,5 х 10 ⁶ трансформанты дрожжей потребуется ~ 30,0 мкг pPC86-библиотеки кДНК ДНК плазмиды, 25 преобразований, и пятьдесят 10-см пластины (SD-Leu-Trp-His-Ура +3 AT).

1. Подготовьте необходимое количество 10-см SD-Leu-Trp-His-Ура +3 на пластинах (50 за процедуру ниже). Также подготовить по крайней мере четыре 10-см SD-Leu-Trp пластины для оценки числа трансформантов.
2. Преобразование библиотеки вMaV203 содержащие pDBLeu-PGRN в соответствии с процедурой, описанной ниже.
   1. Приостановить несколько изолированных колоний MaV203 (pDBLeu-PGRN) в ~ 100 мкл в автоклаве, дистиллированной воды и распространения их на 10-см SD-Leu пластины. Повторите процедуру для второй SD-Leu пластины. Инкубируйте обе пластины в течение 18-24 ч при температуре 30 ° C.
   2. Очистите и полностью приостановить клеток в 10 мл в автоклаве, дистиллированная вода. Добавить достаточный объем клеточной суспензии в 500 мл жидкости YPD среды в колбе, чтобы дать OD ₆₀₀ ~ 0,1.
   3. Убедитесь, что диаметр ~ 0,1 после прививки.
   4. Встряска при температуре 30 ° С до OD ₆₀₀ достигает ~ 0,4.
   5. Подготовка свежие:
      1. 110 мл 1X TE / LiAc путем объединения 11 мл 10 раз ТЕ, 11 мл 10 раз LiAc и 88 мл воды автоклаве.
      2. 16 мл ПЭГ / LiAc, комбинируя 1,6 мл 10X TE, 1,6 мл 10X LiAc, и 12,8 мл 50% ПЭГ-3350.
   6. Гранул клеток в 3000г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   7. Отменить тон супернатанты и аккуратно ресуспендируют гранул с помощью пипетки вверх и вниз по 100 мл в автоклаве, дистиллированную воду при комнатной температуре.
   8. Центрифуга в 3000 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   9. Удалите супернатант центрифугируют клетки и ресуспендируют осадок клеток в 50 мл 1X TE / LiAc решение.
   10. Центрифуга в 3000 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   11. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендируют осадок в конечном объеме 2,5 мл 1X TE / LiAc решение.
   12. Выполните 25 преобразований. Комбинат 2,5 мл клеток, 125 мкл (10μg/μl) денатурированные, стриженого ДНК спермы лосося и 30 мкг кДНК библиотеки. Осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Добавить 15 мл ПЭГ / LiAc решение и аккуратно перемешать. Алиготе на 25 автоклавного 1,5-мл микроцентрифужных трубы в 700 мкл.
   13. Инкубируйте в течение 30 мин в 30 ° С водяной бане.
   14. Теплового шока в течение 15 мин в 42 ° С водяной бане.
   15. Центрифуга в 6000 г в течение 1 мин при комнатной температуре. Осторожно снимите суперплавающий. Аккуратно ресуспендируют каждую крупинку в 400 мкл в автоклаве, дистиллированной воды с помощью пипетки вверх и вниз.
3. Пластина 200 мкл смеси переход от каждого преобразования на один 10-см SD-Leu-Trp-His-Ура +3 AT (3AT концентрации: 25 мм) пластин использованием распространение бар, так что 25 автоклавного 1,5-мл пробирки микроцентрифужных может сделать 50 пластин (SD-Leu-Trp-His-Ура +3 AT).
4. Инкубируйте пластин в течение 5-10 дней при температуре 30 ° C.
5. Для оценки эффективности трансформации реакции, серийные разведения одной реакции (1:40; 1:400 и 1:4000) высевали на SD-Leu-Trp пластины. После инкубирования в течение 3 дней при температуре 30 ° С, число колоний считается и общее количество трансформантов рассчитаны.

7. X-гал анализа

1. Передача колоний YPD пластины; инкубировать при температуре 30 ° С в течение ночи.
2. Место округлые нитроцеллюлозные мембранные на YPD пластины, убедитесь, что Есть нет пузырьков между мембраной и YPD пластины. Через 1-2 мин, маке, что все колонии передаются мембран (нитроцеллюлозы бумаги).
3. Место стороне мембраны колонии в лодку, сделанную с алюминиевой фольгой бумаги.
4. Поместите мембрану в жидком азоте, ждать двадцать секунд, и погрузить в жидкий азот в течение нескольких минут.
5. Выньте мембраны таять.
6. Между тем сочетание следующих реагентов:
   1,5 мл буфера глубины
   20 мкл X-гал (20 мг / мл)
7. Оставьте Z буфера / X-гал в чашке Петри, место ватман на вершине этого.
8. Аккуратно положите нитроцеллюлозы бумаги поверх бумаги ватман.
9. Инкубировать при температуре 37 ° до синих колоний появится.

8. Retransformation анализа

Prey белков слияния (AD-Y), выделенных из библиотеки скрининг должен сохранить взаимодействие с приманкой гибридный белок (DB-X), чтобы вызвать отчет гены, а retransformation хищных клонов и приманки построить в дрожжи могут продолжить работу по ликвидации ложных срабатываний и облегчить добавитьitional анализа.

1. Изолировать плазмидной ДНК из штаммов дрожжей потенциально содержащие взаимодействующих белков.
2. Преобразование ДНК в E.coli, DH5α клетки, плиты преобразований на LB +100 мкг / мл ампициллина пластин выборочно изолировать pPC86-библиотеки кДНК, и инкубировать в течение ночи при температуре 37 ° C.
3. Выберите несколько колоний от пластины поместить в LB +100 мкг / мл ампициллина бульон.
4. Подготовка miniprep ДНК и изучить двойным анализ ограничений с Сал Я и Не I.
5. Сотрудничество трансформировать добычу плазмиды и приманки плазмиды в MaV203, плиты преобразования смесей на SC-Leu-Trp тарелки, и выдержать в течение 2-3 дней при температуре 30 ° C.
6. Выберите три различных колоний от SC-Leu-Trp пластину, выполнить X-гал анализа.

9. Секвенирование и биоинформатики анализ

Последовательность ДНК плазмиды, которая была изолирована от всего правда положительных клонов, сравнить эти последовательности тем, кто в GenBank использованием БЛАST программы, и определить те два гибридных клонов, которые соответствуют известным генам. Последовательность данных показал, что два из 12 срабатываний, полученные выше, на поверхности клеток TNFR2 (TNFRSF1B/CD120b; Присоединение # NM_130426). Кроме того, взаимодействие между PGRN и TNFR был проверен с использованием различных белок-белковые взаимодействия анализов, в том числе в пробирке Твердофазные связывания, Co-иммунопреципитации, поверхностного плазменного резонанса анализа и проточной цитометрии анализа ^14.

10. Представитель Результаты

Блок-схема скрининга описана на рис. 3. Обычно 50-100 положительные кандидатов клона будут получены в этом шаге. Мы изначально изолированные 54 положительных клонов кандидатов среди 2500 тысяч трансформантов экранированный с PGRN приманки. Положительные кандидатов клон затем были проверены путем проведения X-гал анализа. Обычно около 50% ложноположительных клонов удаляются с помощью X-гал анализа. Мы получили 23 положительных клона откровенные Атеш на этот шаг для приманки PGRN (рис. 4). Retransformation жертвы клонов и приманки построить на дрожжах дальнейшего устранения ложных срабатываний и клоны, которые все еще активировать гены репортер вероятно, представляют собой истинно положительными. Обычно около 50% позитивных кандидатов клон будет удален. Мы, наконец, изолированные 12 положительных клонов, которые взаимодействуют с PGRN в дрожжах.

Рисунок 1. Принцип дрожжей две гибридные системы

Рисунок 2. Трубопровод выявления связывания с белками дрожжей партнеров, использующих две гибридные системы

Рисунок 3. Блок-схема скрининга дрожжей двугибридная библиотеки.rge.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра полноразмерной версии этого образа.

Рисунок 4. Бета-галактозидазы анализ положительных кандидатов клон. , Positive полученных клонов из библиотеки экране были переданы YPD пластины и инкубировали при 30 ° С в течение ночи; B, все колонии на YPD пластины были перенесены на нитроцеллюлозные мембраны и бета-галактозидазы анализ выполняется.

Дрожжи двугибридная скрининга оказалась эффективным инструментом в определении взаимодействия белка ^{16, 17.} По сравнению с другими подходами для идентификации белков-связывающих партнеров, таких как биохимические совместной очистки и белковых чипов, дрожжи две гибридные системы чувствительны генетический подход, который можно использовать для скрининга очень большое число кодирующих последовательностей в относительно простой эксперимент, в Кроме того, он обнаруживает в естественных условиях взаимодействия и не нуждается в сложных очистки белков. Конечно дрожжей двух гибридная система имеет свои недостатки, например, отсутствие необходимых пост-трансляционной модификации, недостаточное складывания и / или стабильности гибридный белок, а также изменения внутриклеточной локализации (белки, привлекались к ядру, и это может Не реальный физиологического состояния). Кроме того, белки, которые демонстрируют ложные активации репортер генов, например, активаторы себе, не могут быть непосредственно использованы в качестве приманки для скрининга добычу сЭН. А. библиотек. Для того чтобы преодолеть этот недостаток, отдельные функциональные области, а не интактных белков, которые обычно используются в качестве приманки следует подтверждений взаимодействий с использованием различных подходов с неповрежденными белки. Например, мы успешно изолированы ADAMTS-7 металлопротеиназы и progranulin фактор роста, как обязательные партнеры COMP использовании EGF-подобный домен из COMP в качестве приманки ^{10, 13.}

Обычные процедуры отбора занимает много времени, так как дрожжи трансформанты высевают на первый минус трех пластин (SD-Leu-Trp-Его +3 AT), чтобы выбрать его + клоны, которые затем передаются Второй минус три пластины (SD -Leu-Trp-Ура +3 AT) для выбора Ура. Кроме того, репликация тысяч положительных клонов нуждается в специальных инструментов, и этот экран процесс часто приводит к большим числом ложных срабатываний. Мы напрямую покрытием дрожжей трансформантов на минус четыре пластины (SD-Leu-Trp-His-Ура +3 AT), а не два MinuS-три пластинки, потому что истинные клоны взаимодействия должны быть в состоянии одновременно активировать все репортер конструкций (например, производство гистидин, и урацил) интегрирован в геном дрожжей и должны выжить на минус четыре пластины (SD-Leu-Trp-His- Ура +3 AT). Эта модификация значительно сокращает процесс (например, обычные процедуры скрининга обычно занимает 10-20 дней, в то время как изменение экрана процедура требуется только 5-10 дней), снижает рабочую нагрузку, и, самое главное, снижает количество ложных срабатываний. Кроме того, этот подход является воспроизводимым и надежно, и мы успешно применили это изменение системы в выделении белков из различных приманок, в том числе натриевых каналов ¹² и внеклеточных белков матрицы ^{10, 13.} В последнее время мы выявили PGRN как роман лигандом рецепторов ФНО использовании этого подхода ^{14, 15,} обеспечивая прочную основу для будущих открытий, связанных с этим фактором роста.

Нет конфликта интересов объявлены.

Эта работа финансировалась исследовательских грантов NIH K01AR053210, R01AR061484 и грант от Национального фонда псориаза.