Modificado levadura sistema híbrido de dos para identificar proteínas que interactúan con el factor de crecimiento progranulina

Hemos modificado la levadura de dos híbridos convencionales de detección, una herramienta eficaz en la identificación genética interacción de proteínas. Esta modificación notable acorta el proceso, reduce la carga de trabajo, y lo más importante, reduce el número de falsos positivos. Además, este método es reproducible y confiable.

Progranulina (PGRN), también conocido como precursor granulina epithelin (GEP), es un factor de crecimiento autocrino 593-amino-ácido. PGRN se sabe que juega un papel crítico en una variedad de procesos fisiológicos y enfermedades, incluyendo principios de la embriogénesis, cicatrización de heridas ^1, la inflamación ^{2, 3} y ⁴ de defensa del huésped. PGRN también funciona como un factor neurotrófico ^5, y las mutaciones en el gen PGRN resultando en la pérdida parcial de la demencia frontotemporal causa PGRN proteínas ^{6, 7.} Nuestros estudios recientes han conducido al aislamiento de PGRN como un importante regulador del desarrollo del cartílago y la degradación de ^8-11. A pesar de PGRN, descubierto hace casi dos décadas, juega un papel crucial en varias condiciones fisiológicas y patológicas, los esfuerzos para aprovechar las acciones de PGRN y entender los mecanismos implicados han sido considerablemente obstaculizada por nuestra incapacidad para identificar su unión al receptor (s). Para solucionar este problema, hemos desarrollado una modiFIED dos híbridos de levadura (MY2H) enfoque basado en el más utilizado GAL4 basada en dos sistema híbrido. En comparación con la levadura convencional de dos híbridos de pantalla, MY2H reduce drásticamente el proceso de la pantalla y reduce el número de falsos positivos clones. Además, este método es reproducible y confiable, y hemos empleado con éxito este sistema en el aislamiento de las proteínas de unión de diversos cebos, incluidos los canales de iones ^12, proteína de la matriz extracelular ^{10, 13, 14} y factor de crecimiento. En este trabajo se describe el procedimiento experimental MY2H en detalle utilizando PGRN como ejemplo, que condujo a la identificación de TNFR2 como el primero conocido PGRN asociada a los receptores ^{14, 15.}

1. Información general

La levadura de dos sistema híbrido es una poderosa técnica genética utilizada para descubrir las interacciones ^{proteína-16, 17.} Varias clases de dos híbridos de sistemas, tales como la serie LEXA-los sistemas basados ​​en el sistema de contratación Sos, y las bacterias o células de mamíferos base-2-híbridos, son comerciales disponibles, en este documento se centra específicamente en las modificaciones de las más utilizadas GAL4 base levadura de dos sistema híbrido. En resumen, el método se basa en las propiedades de la proteína GAL4 de levadura, que consiste en separar los dominios responsables de la activación de unión al ADN y la transcripción. El cebo de proteína se expresa como una fusión de la GAL4 dominio de unión a ADN (DNA-BD), mientras que la presa proteínas se expresan como fusiones al dominio de activación GAL4 (AD). La interacción entre el cebo y presa proteínas de fusión lleva a la activación transcripcional de GAL4 sitios de unión que contiene genes reporteros que se integran en el g de levaduraenome. El principio de Y2H se ilustra en la figura. 1 y el procedimiento experimental se resume en la figura. 2.

2. Los materiales necesarios y las soluciones

1. Medio de crecimiento YPD (una mezcla de peptona, extracto de levadura y dextrosa en proporciones óptimas para el cultivo de la mayoría de las cepas de Saccharomyces cerevisiae).
2. Bases mínimas SD (mínimo sintéticos definidos (SD) son las bases de una base nitrogenada de levadura, sulfato de amonio y una fuente de carbono, dextrosa. Deserción (DO) los suplementos pueden ser añadidos a la base mínima SD para hacer un medio sintético, que se define que carecen de la especificada nutrientes).
3. Leu /-Trp de deserción (DO) suplemento (que contienen todos los aminoácidos esenciales excepto leucina y triptófano)
4. -His/-Leu/-Trp/-Ura De deserción (DO) Suplemento (que contiene todos los aminoácidos esenciales excepto leucina, triptófano, histidina y uracilo)
5. Caldo Luria (LB) (triptona 10 g / L, extracto de levadura 5 g / L, NaCl 5 g / L)
6. X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido): Se prepara como una de 20 mg / ml de solución de archivo de N, N-dimetilformamida
7. TE 10X (100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, autoclave)
8. Arenque sonicado o ADN de esperma de salmón, hervida (10 mg / ml)
9. LiAc 10X (1 M de acetato de litio, autoclave)
10. 50% de PEG-3350 una solución, esterilizada por filtración
11. 3-amino-1, 2, 4-triazol (3AT)
12. Kanamicina
13. Ampicilina
14. Electromax DH5a células
15. Z buffer: 16,1 g Na2HPO4 7H2O (8,52 g, o anhidro), 5,5 g de NaH2PO4 H2O (o 4,8 ganhydrous), 0,75 g de KCl, 0,246 g MgSO4 7H2O (o 0,12 g anhidro), disuelto en 1 litro de agua en autoclave, destilada y se ajusta a pH 7,0.

3. Cebo generación (pDBLeu-PGRN)

Un fragmento de ADNc que codifica PGRN que carecen de péptido señal (aa21-588) se clonó direccionalmente en el Sal I-No me los sitios del vector pDBLeu (ProQuest el sistema de dos híbridos, Invitrogen),mantener el marco de la traducción de lectura que el dominio de unión a ADN GAL4 generar pDBLeu-PGRN.

1. Amplificar el fragmento de cDNA de PGRN descrito anteriormente mediante PCR utilizando oligonucleótidos diseñados para contener sitios de restricción (Sal I en el extremo 5 'y no yo en el extremo 3') para que dentro del marco de la fusión.
2. Gel purificar el producto de PCR, digestión con endonucleasas de restricción Sal I y Not I.
   Prepare la base de datos vector pDBLeu restricción de la digestión doble con las endonucleasas de restricción misma.
3. Ligar el fragmento PGRN restricción en el vector linealizado pDBLeu y se transforman en DH5a con la selección de LB + kanamicina a 25 mg / ml.
4. Comprobar la corrección de la construcción de la secuenciación del ADN.

4. La transformación a pequeña escala de cebo plásmido

1. Inocular 5 ml de YPD con una colonia de Mav203 (Invitrogen), agitar la noche a 30 ° C.
2. Diluir el cultivo de una noche en 50 ml de YPD. Crecer un complementoitional 04.02 horas.
3. Que sedimenten las células a 3000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender el precipitado en 40 ml de agua esterilizada, destilada.
4. Re-precipitar las células. Resuspender en 2 ml de solución I, se incuban a temperatura ambiente 10 min.
   Solución I: 0.5 ml 10xLiAc, 0,5 ml 10xTE, 4 ml de H ₂ O
5. Dispensar el ADN de los tubos: 3.2 l de pDBLeu-PGRN (0.25μg/μl) y 10 l de ADN desnaturalizado, esquilada de esperma de salmón (10μg/μl). Agregar 100μl células de levadura, mezclar bien.
6. Agregar 700μl solución II, mezclar bien. Se incuba a 30 ° C durante 30 min. Solución II: 0,2 ml 10xLiAc, 0,2 ml 10xTE, 1,6 ml de 50% PEG3350.
7. Choque térmico a 42 ° C durante 15 min.
8. Pellet durante 2 min. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 200 l agua esterilizada, destilada.
9. Placa de la suspensión en SD-Leu placas con diluciones seriadas. Incubar la placa a 30 ° C durante 2-3 días.

5. Cebo de validación

Antes de realizar síst dos híbridos de pantalla, prueba pDBLeu-PGRN para la auto-activación y determinar los niveles de expresión basal del gen reportero HIS3. Esta prueba determina si los cebos activar la transcripción y si el auto-activación puede ser neutralizado por los inhibidores. 3-amino-1, 2, 4-triazol (3-AT) es un inhibidor competitivo del producto HIS3-gen y puede ser utilizado para valorar el nivel mínimo de HIS3 expresión necesaria para el crecimiento en la histidina deficiencia de los medios de comunicación.

1. Transformar el pDBLeu-PGRN en la levadura Mav203 cepa, la placa de la transformación en SD-Leu placas e incubar durante 48-72 horas a 30 ° C.
2. Colonias de parches de cada transformación con palillos de dientes en autoclave SD-Leu-Sus placas que contienen 3-AT a concentraciones de 10 mm, 25 mm, 50 mm, 75 mm, y 100. 3-AT es un inhibidor competitivo de la enzima HIS3 y los cebos solo que muestran auto-activación será capaz de crecer en presencia de la 3-AT.
3. Cepas de cebo que crecen en las placas de containing 100 mM 3-AT no son adecuados para su uso en la pantalla de dos híbridos. Para los cebos que se pueden utilizar, el uso más bajo de 3 a una concentración que inhibe el crecimiento celular. En muchos casos, 25 mM de 3-A se utiliza para la detección.

6. selección de la biblioteca de cDNA

El plásmido pDBLeu-PGRN se introduce en MaV203 mediante una transformación a pequeña escala como se describió anteriormente. Introducir pPC86-biblioteca (Invitrogen) en MaV203 (pDBLeu-PGRN), el procedimiento descrito a continuación normalmente da ~ 4 x 10 ⁴ colonias con 0,5 mg de ADN plásmido biblioteca. Por lo tanto, 2,5 x 10 ⁶ transformantes de levadura se requieren ~ 30,0 mg pPC86-cDNA biblioteca de ADN plásmido, las transformaciones de 25 años, y cincuenta platos de 10 cm (SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT).

1. Preparar el número adecuado de 10 cm SD-Leu-Trp-His-Ura 3 en las placas (50 para el siguiente procedimiento). También hay que preparar por lo menos cuatro de 10 cm SD-Leu-Trp placas para estimar el número de transformantes.
2. Transformar la biblioteca enla MaV203 contiene pDBLeu-PGRN de acuerdo con el procedimiento descrito a continuación.
   1. Suspender varias colonias aisladas de MaV203 (pDBLeu-PGRN) en ~ 100μl agua esterilizada, destilada, y las tendían en una de 10 cm SD-Leu plato. Repita el procedimiento con una segunda placa SD-Leu. Incubar ambas placas durante 18-24 horas a 30 ° C.
   2. Raspe y suspender completamente las células en 10 ml de agua en autoclave, destilada. Añadir un volumen suficiente de la suspensión celular a 500 ml de medio líquido YPD en un frasco para dar una OD ₆₀₀ de ~ 0.1.
   3. Verifique que el OD es de ~ 0.1 después de la inoculación.
   4. Agitar a 30 ° C hasta los ₆₀₀ OD alcanza ~ 0,4.
   5. Preparar fresca:
      1. 110 ml 1X TE / LiAc mediante la combinación de 11 ml de 10X TE, 11 ml LiAc 10 veces, y 88 ml de agua esterilizada.
      2. 16 ml de PEG / LiAc mediante la combinación de 1,6 ml de 10X TE, 1,6 ml LiAc 10X, y 12,8 ml de 50% de PEG-3350.
   6. Que sedimenten las células a 3000g durante 5 min a temperatura ambiente.
   7. Deseche tque sobrenadantes y suavemente resuspender el precipitado pipeteando arriba y hacia abajo en 100 ml de agua en autoclave, destilada a temperatura ambiente.
   8. Centrifugar a 3000 g por 5 min a temperatura ambiente.
   9. Descartar el sobrenadante de las células se centrifugaron y resuspender el botón celular en 50 ml de 1X TE / LiAc solución.
   10. Centrifugar a 3000 g por 5 min a temperatura ambiente.
   11. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en un volumen final de 2,5 ml 1X TE / LiAc solución.
   12. Realiza 25 transformaciones. Combinar celdas 2.5 ml, 125 l (10μg/μl) desnaturalizada, el ADN de esperma de salmón cortado, y 30 mg de la biblioteca de ADNc. Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo. Añadir 15 ml de PEG / LiAc solución y mezclar suavemente. Alícuota en 25 autoclave de 1,5 ml tubos de microcentrífuga de 700 l cada uno.
   13. Incubar durante 30 minutos en un baño de 30 ° C el agua.
   14. Choque térmico durante 15 minutos en un baño de 42 ° C el agua.
   15. Se centrifuga a 6.000 g durante 1 minuto a temperatura ambiente. Retire con cuidado el súpersobrenadante. Resuspenda suavemente cada sedimento en 400 l agua esterilizada, destilada con la pipeta hacia arriba y abajo.
3. Placa de la mezcla de 200 l de transformación de cada transformación en solo 10 cm SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT (3AT concentración: 25 mm) placas con una barra de propagación, por lo que 25 autoclave de 1,5 ml tubos de microcentrífuga puede hacer 50 planchas (SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT).
4. Incubar las placas durante 5-10 días a 30 ° C.
5. Para estimar la eficiencia de transformación de la reacción, diluciones en serie de una reacción (1:40; 1:400 y 1:4000) se colocan en SD-Leu-Trp plato. Después de incubar durante 3 días a 30 ° C, el número de colonias contadas y es el número total de transformantes calculado.

7. X-gal ensayo

1. La transferencia de las colonias de la placa de YPD, se incuba a 30 ° C durante la noche.
2. Lugar redondeado membrana de nitrocelulosa sobre la placa de YPD, asegúrese de que no haya burbujas entre la membrana y la placa de YPD. Después de 1-2 minutos, make seguro de todas las colonias se transfirieron a membranas (papel de nitrocelulosa).
3. Coloque el lado de la membrana colonia en barco hecho con papel de aluminio.
4. Poner la membrana en nitrógeno líquido, esperar veinte segundos, y se sumergen en nitrógeno líquido durante un par de minutos.
5. Saque la membrana que se descongele.
6. Mientras tanto, mezclar el reactivo siguiente:
   1,5 ml buffer Z
   20μl X-gal (20 mg / ml)
7. Caída de buffer Z / X-gal en una placa de Petri, lugar de papel Whatman encima de eso.
8. Con cuidado, coloque papel de nitrocelulosa en la parte superior del papel Whatman.
9. Se incuba a 37 ° hasta que las colonias azules aparecen.

8. Retransformación ensayo

Presa proteínas de fusión (AD-Y) aisladas a partir del examen de la biblioteca debe mantener la interacción con la proteína de fusión cebo (DB-X) para inducir los genes informe, y la retransformación de clones de la presa y el cebo en la construcción de la levadura puede además eliminar los falsos positivos y facilitar añadiranálisis itional.

1. Aislar el ADN de plásmido a partir de cepas de levaduras que pueden contener proteínas que interactúan.
2. Transformar el ADN en las células de E. coli DH5a, la placa de las transformaciones en el LB 100 mg / ml ampicilina placas para aislar selectivamente la biblioteca pPC86-cDNA, y se incuba durante la noche a 37 ° C.
3. Elige varias colonias de la placa para poner en LB 100 mg / ml de caldo a la ampicilina.
4. Prepare minipreparación ADN y examinar mediante análisis de restricción doble con Sal I y I. No
5. Co-transformar la presa plásmido y el cebo plásmido en MaV203, la placa de las mezclas de transformación en el SC-Leu-Trp placas y se incuban durante 2-3 días a 30 ° C.
6. Escoger tres diferentes colonias de la placa SC-Leu-Trp, lleve a cabo X-gal de ensayo.

9. Secuenciación y análisis bioinformático

La secuencia del ADN del plásmido que se aisló de los clones positivos probablemente cierto, comparar estas secuencias con las del GenBank utilizando el BLAPrograma de ST, e identificar los clones de dos híbridos que corresponden a los genes conocidos. La secuencia de datos mostró que dos de los 12 positivos obtenidos anteriormente eran de la superficie celular TNFR2 (TNFRSF1B/CD120b; adhesión # NM_130426). Además, la interacción entre PGRN y TNFR se verifica por medio de diversos ensayos de proteína-proteína interacción, incluyendo in vitro en fase sólida ensayo de unión, Co-inmunoprecipitación, análisis de resonancia de plasmones de superficie, y el ensayo de citometría de flujo ^14.

10. Resultados representante

El diagrama de flujo de la proyección se resume en la figura. 3. Por lo general 50-100 candidatos clon positivo se obtuvo en este paso. Inicialmente se aisló 54 candidatos clon positivo entre los 2,5 millones transformantes seleccionados con el cebo PGRN. Candidatos clon positivo fueron posteriormente comprobados por la realización del ensayo X-gal. Por lo general, aproximadamente el 50% de falsos positivos clones se eliminan a través de X-gal ensayo. Se obtuvieron 23 clones positivos franca ates en este paso de la carnada PGRN (Fig. 4). Retransformación de los clones y la construcción de la presa de cebo en la levadura aún eliminar los falsos positivos y los clones que aún activan los genes reportero probablemente representan los verdaderos positivos. Por lo general, aproximadamente el 50% positivo clon candidatos serán eliminados. Finalmente, aislados 12 clones positivos que interactúan con PGRN en la levadura.

Figura 1. Principio de la levadura sistema híbrido de dos

Figura 2. Pipeline de la identificación de socios de unión a proteínas utilizando la levadura sistema híbrido de dos

Figura 3. Diagrama de flujo de la levadura de dos híbridos de selección de la biblioteca.rge.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión en tamaño completo de esta imagen.

Figura 4. Beta-galactosidasa de ensayo de los candidatos clon positivo. A los clones, positivos obtenidos en la pantalla de la biblioteca fueron trasladados a la placa de YPD y se incuba a 30 ° C durante la noche, B, todas las colonias en la placa de YPD se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se realiza la beta-galactosidasa ensayo.

Levadura de dos híbridos de cribado ha demostrado ser una herramienta eficaz en la identificación de la interacción de proteínas ^{16, 17.} En comparación con otros métodos para la identificación de la proteína de unión de la pareja, tales como la purificación bioquímica de proteínas y co-chips, dos híbridos de levadura es un enfoque sensible genética que puede ser utilizado para la detección de un número muy alto de las secuencias codificadoras de un experimento relativamente sencillo, en Además, se detecta la interacción en vivo y no necesita de purificación de proteínas complejas. De levadura curso de dos sistema híbrido tiene limitaciones, por ejemplo, la ausencia de las necesarias modificaciones post-traduccionales, el plegado insuficiente y / o la estabilidad de una proteína de fusión, y la localización subcelular alterada (proteínas son llevados al núcleo y que esta no ser el estado fisiológico real). Además, las proteínas que exhiben la activación de genes reporteros falsos, por ejemplo, activadores de sí mismo, no pueden ser directamente utilizados como cebos para la detección del CD de la presaNA bibliotecas. Con el fin de superar este inconveniente, los dominios funcionales individuales en lugar de proteínas intactas, se suelen utilizar como cebos seguido por las validaciones de las interacciones con distintos enfoques con las proteínas intactas. Por ejemplo, hemos aislado con éxito ADAMTS metaloproteinasa-7 y el factor de crecimiento progranulina como la unión de compañeros de COMP con el dominio EGF-como de la competición como una carnada ^{10, 13.}

El procedimiento de selección convencional es mucho tiempo, ya que los transformantes de levadura se colocan en los primeros menos-tres platos (SD-Leu-Trp-Sus tres A) para seleccionar sus clones +, que luego son transferidos a la segunda menos-tres platos (SD -Leu-Trp-Ura 3 AT) para la selección de Ura. Además, la replicación de los miles de clones positivos necesita de herramientas especiales, y este proceso de la pantalla a menudo resulta en un gran número de falsos positivos. Estamos directamente plateado los transformantes de levadura en menos-cuatro placas (SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT) en lugar de dos minus y tres platos, porque verdaderos clones interacción debe ser capaz de activar de manera simultánea todas las construcciones reportero (histidina es decir, producir, y uracilo), integrado en el genoma de la levadura y deben sobrevivir con menos cuatro placas (SD-Leu-Trp-His- Ura 3 AT). Esta modificación notable acorta el proceso (por ejemplo, el procedimiento de selección convencional suele tardar 10-20 días, mientras que el procedimiento modificado de pantalla sólo necesita de 5-10 días), reduce la carga de trabajo, y, lo más importante, reduce el número de falsos positivos. Además, este método es reproducible y confiable, y hemos empleado con éxito este sistema modificado en el aislamiento de las proteínas de unión de los cebos diferentes, incluyendo ¹² canales de sodio y proteínas de matriz extracelular ^{10, 13.} Recientemente, hemos identificado PGRN como un nuevo ligando de los receptores de TNF con este enfoque ^{14, 15,} proporcionando una base sólida para futuros descubrimientos en relación con este factor de crecimiento.

No hay conflictos de interés declarado.

Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones para la investigación K01AR053210, R01AR061484 y una beca de la Fundación Nacional de Psoriasis.