改良酵母双杂交系统，以确定蛋白与生长因子Progranulin的相互作用

我们已经修改了传统的酵母双杂交筛选，确定蛋白质相互作用的一种有效的遗传工具。此修改的过程明显缩短，减少了工作量，最重要的是，降​​低了误报数量。此外，这种方法是重复的，可靠的。

Progranulin（PGRN），又称granulin epithelin前体（GEP），是一个593个氨基酸的自分泌生长因子。 PGRN是已知的各种生理和疾病过程中发挥了关键作用，包括早期胚胎发育，伤口愈合，炎症^2，3，和主机防御^4。 PGRN也可以作为一种神经营养因子，并在PGRN基因导致部分损失的PGRN蛋白引起的额颞叶^痴呆6，7突变。我们最近的研究作为重要的调节软骨发育和退化^8-11导致PGRN隔离。虽然PGRN，发现近二十年前，起着至关重要的作用，在多种生理和病理条件下，努力开拓PGRN的行动，并了解所涉及的机制已明显阻碍我们无法确定其结合受体（S）。为了解决这个问题，我们开发了莫迪fied酵母双杂交（MY2H）方法的基础上最常使用的GAL4基于2混合动力系统。 MY2H与传统的酵母双杂交屏幕相比，极大地缩短了屏幕的过程，并降低了假阳性克隆数。此外，这种方法是重复的，可靠的，我们已经成功地采用这个系统，在隔离各种诱饵的结合蛋白，包括离子通道，细胞外^{基质蛋白10，13，}和^生长因子14。在本文中，我们详细描述了作为一个例子，LED作为第一个已知的PGRN相关受体^14日，15 TNFR2识别使用PGRN这一MY2H实验过程。

1。背景资料

酵母双杂交系统是一个功能强大的基因技术，用于发现^{蛋白质相互作用16，} 17。 2混合动力系统，如lexA为基础的系统，SOS招聘系统，细菌或哺乳动物细胞为基础的2混合动力车，几种商业可用，本文特别侧重于最常用的GAL4基于修改酵母双杂交系统。简而言之，该方法是基于负责可分离DNA结合和转录激活域组成的酵母GAL4蛋白的属性。诱饵蛋白表达作为一个融合的GAL4 DNA结合结构域（DNA - BD的），而猎物蛋白GAL4激活结构域（AD）的融合表达。诱饵和猎物的融合蛋白之间的相互作用，导致转录激活GAL4 -约束力的网站含有报告基因整合到酵母克enome。 图所示的Y2H原则。图1和实验过程中总结。 2。

2。所需的材料和解决方案

1. YPD生长培养基（融合蛋白胨，酵母提取物，和最佳比例增长最酿酒酵母株葡萄糖）。
2. 最小的SD基地（最小合成（SD）的基地包括一个酵母氮基，硫酸铵，和碳源，葡萄糖差（DO）的补充，可以添加到最小的SD基地，使一种人工合成的，缺乏指定的定义介质营养素）。
3. 亮氨酸/色氨酸差（DO）的补充（含所有必需氨基酸除亮氨酸和色氨酸）
4. -His/-Leu/-Trp/-Ura差（DO）的补充文件（含所有必需氨基酸除亮氨酸，色氨酸，组氨酸，和尿嘧啶）
5. 卢里亚肉汤（LB）（蛋白胨10克/ L，酵母提取物5 g / L的氯化钠5克/升）
6. X-半乳糖（5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚-β- D -半乳糖苷）解决方案：20毫克/毫升原液在N，N -二甲基甲酰胺编写
7. 10X的TE（100毫米的Tris - HCl（pH值7.5），10 mM的EDTA，蒸压）
8. 超声鲱鱼或鲑鱼精DNA，煮沸（10毫克/毫升）
9. 10X LiAc（1个M醋酸锂，蒸压）
10. 50％PEG - 3350溶液，过滤消毒
11. 3 - 氨基- 1，2，4 - 三唑（3AT）
12. 卡那霉素
13. 氨苄青霉素
14. ELECTROMAXDH5α细胞
15. Z缓冲区：16.1克的Na2HPO4 · 7H2O（或8.52 g无水），5.5克磷酸二氢钠水（或4.8 ganhydrous），0.75克氯化钾，0.246克硫酸镁7H2O（或0.12 g无水），在1升高压灭菌蒸馏水溶解和调整，以pH值7.0。

3。诱饵代（pDBLeu - PGRN）

萨尔我不是我的pDBLeu载体的网站（在ProQuest双杂交系统，Invitrogen公司）定向克隆到一个cDNA片段的编码PGRN缺乏信号肽（aa21 - 588），保持相同的翻译为GAL4 DNA结合结构域的阅读框产生pDBLeu - PGRN。

1. 健全的PGRN cDNA片段描述PCR以上使用寡核苷酸引物设计包含的酶切位点（萨尔我在5'端和我的3'end），以便在帧融合。
2. 凝胶纯化PCR产物，消化限制性内切酶萨尔我，不是我。
   准备具有相同的限制性内切酶双酶切的DB载体pDBLeu。
3. 结扎成线性pDBLeu载体的限制PGRN片段，转化到DH5α中选择为LB +卡那霉素25微克/毫升。
4. 验证DNA测序构建的校正。

4。诱饵质粒的小规模改造

1. 接种Mav203（Invitrogen公司）的殖民地的YPD 5毫升，摇匀一夜之间在30 ° C。
2. 稀释在50毫升的YPD培养过夜。长出一个添加itional 2-4小时。
3. 颗粒的细胞在室温下5分钟3000转。蒸压，蒸馏水40毫升的重悬沉淀。
4. 重新颗粒细胞。悬浮在我，在室温10分钟孵育2溶液。
   解决方案：0.5毫升10xLiAc 10xTE，0.5毫升，4毫升H ₂ O
5. 分配管的DNA：2-3μLpDBLeu - PGRN（0.25μg/μl）和10μL变性，剪切鲑鱼精子DNA（10μg/μl）。加入100μL的酵母细胞，拌匀。
6. 加入700μl的解决方案二，拌匀。在30℃孵育30分钟。解决方案二：0.2毫升10xLiAc，10xTE 0.2毫升，1.6毫升50％PEG3350。
7. 热休克在42 ° C为15分钟。
8. 颗粒为2分钟。弃上清。在200μL灭菌蒸馏水重悬沉淀。
9. SD - Leu平板上连续稀释板暂停。在30 ° C孵育板为2-3天。

5。诱饵验证

在执行YEA之前ST双杂交筛选，测试pDBLeu PGRN自激活，并确定HIS3报告基因的基础表达水平。该测试确定是否诱饵激活转录自激活是否可以抑制剂瓦解。 3 -氨基- 1，2，4 -三唑（3 - AT的）是一种HIS3基因产品的竞争性抑制剂，可用于滴定 HIS3表达组氨酸缺陷型媒体的增长所需的最低水平。

1. pDBLeu - PGRN转换成酵母Mav203应变，板到SD - Leu平板的转型，并孵育48-72 h 30 ° C。
2. 使用高压灭菌牙签上，在每个转换补丁的殖民地SD - LEU板含有3 - AT浓度为10毫米，25毫米，50毫米，75毫米，100毫米。 3 - AT的是HIS3酶和展现自我激活的唯一诱饵的竞争性抑制剂，将能够成长中存在的3 - AT。
3. 诱饵菌株生长板containi吴100毫米3 - AT是不适合使用双杂交筛选。对于可使用毒饵，使用的3 - AT的浓度，抑制细胞生长的最低。在许多情况下，3 - AT的25毫米用于筛查。

6。 cDNA文库筛选

如上所述，使用一个小规模的的改造，pDBLeu - PGRN质粒引入MaV203。要引入MaV203（pDBLeu PGRN）pPC86库（Invitrogen公司），下面描述的步骤通常 ​​为〜4 × 10 ⁴菌落质粒文库DNA与0.5微克。因此，将需要2.5 × 10 ⁶酵母转化〜30.0微克pPC86 cDNA文库质粒DNA，25转换，以及50个10厘米的板（SD - LEU - TRP -浦3 AT ）。

1. 板（50以下步骤），准备在适当数量的10厘米SD - LEU -色氨酸，他的浦3。还准备估算转化的数量至少有四个10厘米SD -亮氨酸色氨酸板块。
2. 变换成的图书馆MaV203含有pDBLeu - PGRN按程序介绍如下。
   1. 暂停MaV203几个孤立的殖民地〜100μL灭菌蒸馏水（pDBLeu PGRN），并传播到10厘米的SD - LEU板。 SD - Leu的第二板重复的过程。孵育18-24 h两个板块在30 ° C。
   2. 刮掉，并完全停止在10毫升灭菌蒸馏水细胞。加入足量的细胞悬液500毫升的烧瓶中的液体YPD培养基给外径_600〜0.1。
   3. 验证外径为0.1〜接种后。
   4. 30摇外径_600℃直至达到〜0.4。
   5. 准备好新鲜：
      1. 110毫升1X TE / LiAc相结​​合，11毫升的TE 10X 10X LiAc 11毫升，88毫升灭菌水。
      2. 16毫升PEG / LiAc 1.6毫升的TE 10X，10X LiAc 1.6毫升，12.8毫升50％的PEG - 3350相结合。
   6. 在室温下5分钟沉淀细胞在3000克。
   7. 丢弃吨他上清，轻轻重悬沉淀吹打起来，在100毫升灭菌蒸馏水，在室温下。
   8. 在3000克离心机在室温下5分钟。
   9. 弃掉离心细胞上清，重悬细胞沉淀于50 ml 1X TE / LiAc解决方案。
   10. 在3000克离心机在室温下5分钟。
   11. 取出上清和沉淀重悬在2.5毫升的1X TE / LiAc解决方案的最终体积。
   12. 执行25转换。将2.5毫升的细胞，125μL（10μg/μl）变性，剪切鲑鱼精子DNA，cDNA文库和30微克。轻轻地上下吹打混合。添加15毫升的PEG / LiAc解决方案，并轻轻混匀。分装成25各700μL灭菌的1.5 ml离心管。
   13. 孵育在30℃水浴30分钟。
   14. 热休克在42℃水浴15分钟。
   15. 在6000克离心机在室温下1分钟。小心取出超游泳。轻轻地上下吹打重悬在400μL灭菌蒸馏水每个颗粒。
3. 板200μL改造从改造到10厘米的单SD -亮氨酸色氨酸他浦3 AT（3AT浓度：25毫米）的每个混合板使用的传播栏，使25蒸压1.5毫升的离心管，可以使50板（SD - Leu的色氨酸他浦3 AT）。
4. 5-10天在30 ° C孵育板
5. 为了估计反应的转化效率，一个反应（1:40; 1:400和1:4000）的串行稀释SD -亮氨酸色氨酸板镀。经过连续3天在30℃，计数菌落数和总人数的计算转化的孵化。

7。 X - gal的检测

1. 传输殖民地YPD板;孵育30 ° C过夜。
2. 广场圆润的YPD板上硝酸纤维素膜，确保有膜和YPD板之间无气泡。 1-2分钟后，马柯确保所有殖民地被转移到膜（硝化棉纸）。
3. 船在用铝箔纸将膜殖民地的一面向上。
4. 膜放入液氮，液氮等待一两分钟20秒，并淹没。
5. 取出膜解冻。
6. 同时混合下列试剂：
   1.5毫升ž缓冲区
   X - gal的20μL（20毫克/毫升）
7. 掉落Z缓冲区/ X - gal的培养皿中，最重要的是地方的Whatman纸。
8. 小心地放置在顶部的Whatman纸硝化纤维纸。
9. 在37℃孵育，直到出现蓝色菌落。

8。 Retransformation检测

从库中筛选分离的猎物融合蛋白（AD - Y），应保留诱饵融合蛋白（DB - X）的相互作用，以诱导的报告基因，和猎物的克隆和诱饵retransformation建设成酵母可以进一步消除误报和方便添加itional分析。

1. 隔离酵母菌株的质粒DNA可能含有蛋白质相互作用。
2. 转换成大肠杆菌DNADH5α细胞，在LB板的转换100μg/ mL氨苄青霉素板选择性分离pPC86 cDNA文库，孵育过夜，于37 ° C。
3. 从板块中挑选几个菌落于LB 100μg/ mL氨苄青霉素肉汤。
4. 准备小量DNA和检查由用Sal I和Not一双酶切分析
5. 合作改造的猎物质粒和诱饵质粒进入MaV203，板改造的混合物，SC -亮氨酸色氨酸板，并为2-3天，在30 ° C孵育
6. 选择SC -亮氨酸色氨酸板从三个不同的殖民地，进行X - gal的含量。

9。测序和生物信息学分析

序列可能真阳性克隆中分离的质粒DNA，比较这些序列在GenBank中使用的BLAST程序，并确定这两个杂交对应于已知基因的克隆。测序数据显示，获得上述12阳性细胞表面TNFR2（TNFRSF1B/CD120b加入＃NM_130426）。此外，PGRN和肿瘤坏死因子受体之间的相互作用进行了验证，使用各种蛋白质相互作用的分析，在体外包括固相结合法，免疫共沉淀，表面等离子体共振分析， ^流式细胞仪检测14。

10。代表性的成果

甄别的流程图如图概述 。 3。通常50-100阳性克隆的候选人将获得在这一步。我们初步分离出250万PGRN诱饵筛选转化之间的54个阳性克隆候选人。阳性克隆的候选人，然后通过X - gal的检测验证。通常情况下，约50％的假阳性克隆，通过X - gal的检测中删除。我们获得23坦率积极的克隆阿泰在这一步PGRN诱饵（ 图4）。猎物的克隆和诱饵构建成酵母Retransformation进一步消除误报和克隆，仍然激活基因可能代表真阳性。通常情况下，约50％的阳性克隆的候选人将被删除。我们终于分离出12个阳性克隆，酵母PGRN互动。

酵母双杂交系统的原理图1 。

图2管道确定蛋白用酵母双杂交系统的结合伙伴 。

图3。流量图表筛选酵母双杂交文库。rge.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看一个全尺寸的版本，这个形象。

图4。β-半乳糖苷酶检测阳性克隆的候选人。库屏幕获得一个阳性克隆转移到YPD板，并在30 ° C过夜培养; B，YPD板所有殖民地被转移到硝酸纤维素膜和β-半乳糖苷酶测定执行。

酵母双杂交筛选已被证明是一个有效的工具，在确定蛋白质相互作用^16，17。与其他方法确定蛋白结合的合作伙伴，如生化合作，纯化和蛋白质芯片，酵母双杂交系统是一个敏感的遗传筛选非常高的数字编码序列在一个相对简单的的实验方法，可使用;此外，它在体内相互作用检测，也不需要复杂的蛋白质纯化。当然酵母双杂交系统有其局限性，例如，需要翻译后修饰，融合蛋白折叠的不足和/或稳定，亚细胞定位的改变的情况下（蛋白是细胞核，这可能没有真正的生理状态）。此外，表现出虚假的报告基因，如自我激活，激活的蛋白质不能直接用来作为诱饵筛选猎物CDNA库。为了克服这一缺点，个别功能域，而不是完整的蛋白质，通常用于使用各种方法与完整的蛋白质相互作用的验证的诱饵。例如，我们已经成功地分离ADAMTS - 7金属蛋白酶和progranulin生长因子作为补偿使用的EGF样结构域的补偿作为诱饵^10，13的具有约束力的合作伙伴。

在传统的筛选程序是费时，自的酵母转化是的第一次减，三个板块的SD -亮氨酸，色氨酸，他的3 AT镀选择他+的克隆，这是再转移的第二次减三板（SD亮氨酸，色氨酸，市建局AT）的3市建局选择。此外，数以千计的阳性克隆复制需要特殊的工具，此屏幕​​的过程中，往往在大量的误报结果。我们直接镀上减四大板块（SD - LEU -色氨酸他浦3 AT），而不是两个阿米努酵母转化S -三板，因为真正的互动克隆应该能够同时激活所有记者整合到酵母基因组的结构（即生产组氨酸，和尿嘧啶），应该生存在零下四大板块（SD - LEU - TRP -他，市建局3 AT）。这个修改​​过程中（如传统的筛选过程通常需要10-20天，而修改后的屏幕程序只需要5-10天）明显缩短，减少了工作量，最重要的，减少误报数量。此外，这种方法是重复的，可靠的，我们已经成功地采用这个修改过的系统，在隔离各种诱饵的结合蛋白，包括^钠通道12和细胞外^{基质蛋白10，} 13的。最近，我们发现作为一种新型使用这种方法^14，15，肿瘤坏死因子受体配体PGRN，未来有关这种生长因子的发现提供了一个坚实的基础。

没有利益冲突的声明。

这项工作是由NIH的研究补助金K01AR053210，R01AR061484和国家牛皮癣基金会的赠款。