Выбор Plasmodium тропической Паразиты для Cytoadhesion для мозга человека эндотелиальных клеток

В пробирке Модели церебральной малярии поглощения описывается ¹. Plasmodium тропической Инфицированных красных кровяных клеток, выбранных для привязки к увековечен человеческий мозг микрососудистых эндотелиальных клеток. Отдельных паразитов шоу различных фенотипа. Процесс отбора может быть применен с использованием различных П. тропической Штаммов и эндотелиальных клеточных линий.

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain^2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in ⁵). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body^{2, 3}. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.

The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier⁶. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.

A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.

In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs⁷.

Общие рекомендации

Мозг человека микрососудистых эндотелиальных клеток (HBEC-5i) культура была ранее описана в ^{6, 8.} P. тропической паразитов культивировали как и в ^9. Оба HBEC-5i и П. паразита тропической культуры должны храниться в стерильных условиях в любое время. Все реагенты должны быть предварительно нагревают при 37 ° C. Мы рекомендуем регулярно проверять на микоплазму загрязнения ¹⁰ методом ПЦР (Minevera Биолабс, инструкции следующие производителя). Протокол приведены на рисунке 1.

1. Эндотелиальная клетка культуры рутинной

1. Подготовка необходимых реагентов.

2. Культура HBEC-5i в вентилируемом 25 см ² колбу с 10 мл DMEM полной среды в 37 ° C инкубаторе с 5% CO _2.
3. Прохождение клетки, когда они становятся вырожденным. Удалите старый среды всасывания и мыть дважды используя DMEM неполным средним или культуры тканей класса PBS (Ca ^{2 +} и Mg ^{2 +} бесплатный) предварительно нагревают до 37 ° C.
4. Добавить 1 мл подогретого Попробуйтеpsin-ЭДТА (0,025% трипсина, 0,5 мм ЭДТА), вихря, чтобы покрыть полностью из колбы и инкубировать в течение ~ 2 мин при 37 ° C.
5. Проверьте под инвертированным микроскопом, что по крайней мере 90% клеток были отделены. В случае необходимости, осторожно постучать дне колбы, чтобы сместить прилипшие клетки. Добавить 10 мл DMEM полной среде, чтобы блокировать трипсина и передачи клеток в 15 мл коническую трубку. Центрифуга в течение 4 мин при 300 г при комнатной температуре (RT).
6. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок с 10 мл DMEM полной среде. Внесите решение вверх и вниз, тщательно ресуспендирования клеток.
7. Добавьте 1 или 2 мл клеточной суспензии в новую культуру колбу и добавляют 8 мл свежей среды для поддержания культуры. Оценка роста культуры каждый день под инвертированным микроскопом и изменение среды каждые 2 или 3 дня до его желтеет.

2. Подготовка эндотелиальных клеток для выбора

1. За два дня до дня selectio п, добавить фибронектина разводят в стерильном PBS (2 мкг / см ²⁾ в одной (или более) 60 мм чашки Петри. Инкубируйте блюдо от 5 до 20 мин при 37 ° С, а затем удалить фибронектина решение, которое может храниться при температуре 4 ° С в течение месяца и повторно использовать один раз.
2. Прохождение клетки, как это описано в разделах 1.3. до 1,5. Предполагая, 100% вырожденная клетки были отделены и ресуспендировали в 10 мл DMEM полной среде (раздел 1.6., Ресуспендируют с эквивалентного объема среды, если слияния ниже, например, ресуспендируют с 8 мл, если слияния было 80%), добавить 1,5 мл взвешенных клеткам фибронектина покрытием чашке Петри, а другая из 1,5 мл DMEM полной среде.
3. Место блюдо посеяны Петри в инкубаторе. Примечание: В идеале, слияния составит около 90% на момент отбора через два дня.
4. Необязательно. Для активации HBEC-5i, добавьте TNF (фактор некроза опухоли) цитокинов в конечной концентрации 50μg/ml за 24 часа до выбора.

1. Подготовьте необходимые реагенты (см. таблицу здесь, под). Подготовка человека красных кровяных телец (эритроцитов) путем отделения цельной крови (группа O +) при прохождении через фильтр лейкоцитов истощения (см. «Методы исследований в области малярии" публикации ¹¹ для общего культивирования малярийных паразитов). Вымойте РБК дважды центрифугированием при 400 г в течение 5 мин и ресуспендирования их с 10 мл RPMI неполным. Держите мыть РБК при 4 ° С при неполном среде при 50% гематокрита.

2. Культура P. тропической инфицированных РБК со RPMI полной среде на уровне 2% гематокрита и инкубировать при температуре 37 ° C с 3% CO _2, 1% O _2, и 96% N _2. Сделать Гимзе мазка ¹¹ ежедневно для оценки стадии развития паразитов (рис. 2).
3. Регулярно (примерно раз в неделю) синхронизировать культуры сорбитол лечение ^12. День до выбора теста, стремиться к кольцу-сценической культуры на уровне 5% паразитемии или более (в идеале, по крайней мере 10%).

4. Выбор P. тропической для cytoadhesion в эндотелиальных клетках

1. В день теста, культуры паразита должна быть не пигментированные этапе трофозоит (рис. 2) (в идеале 10% паразитемии), а HBEC-5i культура должна быть от 50 до 100% слияния (в идеале 90%). 30μl гематокрита культуры паразита необходимо в HBEC-5i чашке Петри.
2. Вымойте паразитов в два раза путем центрифугирования (500 г в течение 5 мин) 1,5 мл культуры возбудителя. Удалите супернатант и ресуспендируйте с 10 мл свежеприготовленного, потеплела DMEM неполной среде. Повторите мыть второй раз. Ресуспендируют 30μl гематокрита с 1,5 мл из неполных DMEM с 1% BSA.
3. Вымойте HBEC-5i покрытием чашке Петри в два раза аспирационных средних и добавление 3 мл неполного DMEM.
4. Добавить решение паразитов HBEC-5i блюдо и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 75 мин. Ресуспендируют паразитов в два раза (после 30 и 60 мин) в течение инкубационногоосторожно покачайте его блюдо в четырех направлениях, а также по часовой стрелке и против часовой стрелки.
5. После инкубации, мыть блюда в 5 раз по аспирационных среды, использованием пластиковой пипетки Пастера добавить 3 мл теплой DMEM неполных средних и нежный качания. Если многие блюда используются, держать их на теплую поверхность, например, большой колбе с водой при температуре 37 ° C.
6. Проверьте блюдо под инвертированным микроскопом. Если многие неинфицированных РБК еще видны, делать больше моет, как описано выше. Ручка чашки Петри очень тщательно, чтобы избежать любого риска загрязнения.
7. Удалить среды от блюдо и добавить 3 мл теплой RPMI полной среде с 40μl гематокрита свежих УрБК.
8. Место блюдо в герметичной камере инкубации, газ в течение 3 мин и место камеры в термостат при температуре 37 ° С в течение ночи.
9. На следующий день после, урожай паразитов промывкой RPMI неполной среды, таким же образом, как описано в разделе 4.4. но более энергично. Кир всех средних используется (содержащие ресуспендировали РБК) в 15 мл коническую трубку. Проверьте под инвертированным микроскопом, что все РБК были удалены из тарелки.
10. Гранул паразитов, отбросить супернатант, ресуспендируют в 5 мл полной среды RPMI и место смеси в колбе для нормального культивирования.

5. Представитель Результаты

Невыбранная паразитов показать низкий уровень связывания с HBEC-5i (рис. 3А). Таким образом, после первого тура отбора, очень мало паразитов будет собрано, и это может занять до месяца культивирования достичь паразитемии достаточным для второго тура отбора. После каждого раунда отбора, все больше и больше паразитов связываются с эндотелиальные клетки и выбор может быть повторен в более короткие промежутки времени. После 4-5 раундов отбора, высоких обязательными популяций паразита получены (рис. 3).

В наших руках, связывание HB3-HBEC к HBEC-5i или TNF активированный HBEC-5i был симilar уровне (данные не представлены).

Протокол, описанный здесь, был испытан с 4 P. тропической штаммов: HB3, IT/FCR3, 3D7 и DD2 (табл. 1). Только последнее оказалось не способны связываться с HBEC-5i, даже после 5 раундов отбора.

HB3 паразиты были также отобраны для cytoadherence для кожи человека и легких микрососудистой эндотелиальных клеток (HDMEC и HPMEC). После 4 тура отбора, используя метод, описанный здесь, высокого обязательными населения было получено с обеих HDMEC и HPMEC (рис. 4).

Рисунок 1. Обзор процесса отбора.

Рисунок 2. Этапы развития P. тропической инфицированных красных кровяных телец. Гимза мазков визуализируются под микроскопом на 1000X увеличения.

Рисунок 3. Типичный пример паразитов привязки к HBEC-5i. (А) синий слой HBEC-5i фиксированной глутаральдегидом и окрашивали Гимза, визуализируются под микроскопом при увеличении 1000X. Фотографии были сделаны после УрБК и несвязанные iRBC были смыты. Левая панель показывает одном П. тропической HB3 (не выделен) паразит связан с HBEC-5i. В правой панели HB3-HBEC паразиты были отобраны в течение 5 раундов. (B) Данные, представляет собой среднюю из двух независимых экспериментов, каждый выполнена в двух экземплярах. Число паразитов связаны в эндотелиальных клеток было подсчитано.

Таблица 1. Резюме Plasmodium штаммов тропической которые были успешно выбраны для привязки к HBEC-5i. Обратите внимание, что HB3 был также выбран на ФНО-активированной HBEC-5i. После 5 раундов отбора, DD2 штамма показали никакого увеличения привязки к HBEC-5i по сравнению с невыбранные-DD2.

Рисунок 4. Связывание П. тропической HB3 паразиты кожи (HDMEC) и легочная (HPMEC) эндотелиальных клеток, до и после 4 тура отбора. Хотя питательной среды для HDMEC и HPMEC немного отличается (см. инструкции поставщика), протокол, используемый для выбора была такая же, как с HBEC-5i. Снимки, сделанные на 400X увеличении.

Таблица 2. Материалы

Отличительной чертой церебральной малярии является секвестрация П. тропической iRBC в мозге ^{2 микрососудов, 3.} Тем не менее, в пробирке культур P. тропической только плохо cytoadhere к HBEC-5i, модель для человеческого эндотелия капилляров мозга. Здесь мы разработали простой анализ для обогащения населения за связывание с HBEC-5i, более «в естественных условиях, как« фенотип. Три из 4 P. тропической штаммы были успешно выбраны с помощью этого метода. Кроме того, HB3 был также выбран на HDMEC и HPMEC, указывая, что этот протокол может быть использован для различных паразитов и эндотелиальных типов клеток.

Различные гипотезы могут объяснить отсутствие связывания с DD2 напряжение. Скорее всего, является тот факт, что эта линия паразит knobless, который глубоко препятствует cytoadherence ^{13, 14.}

Мы рекомендуем культивирования невыбранные паразитов вместе с выбором пропроцессом обеспечить контроль для сравнения. Это позволит, например, сравнение транскриптом обязательных и необязательных паразитов, с надеждой на обнаружение паразитов кандидатов лиганда.

ФНО цитокинов найти на высоком уровне в церебральной малярии и пациентов было показать индуцируют экспрессию многих белков поверхности HBEC-5i (Claessens и др., в подготовке и ^{8, 15, 16).} В этом случае количество связанного iRBC была одинаковой в нормальном HBEC-5i по сравнению с активированным HBEC-5i.

Этот «секвестр модель" также может быть использован для изучения молекулярного взаимодействия между iRBC и эндотелиальных клеток, а также влияние предполагаемых анти-cytoadherence наркотиков. В этом случае, мы рекомендуем покрытие HBEC-5i в небольших скважин, такие как "8-а камера скользит» (BD 354 628) или "CultureWell" (Sigma C7735-20EA).

Нам нечего раскрывать.

Мы благодарим Франциско Candal, CDC трансфера технологий Office, Атланте Грузии HBEC-5i клеток. Эта работа финансировалась Wellcome Trust (4 года кандидат студенчества к сети переменного и старший стипендий в основных биомедицинских наук в JAR, номер гранта 084 226).