선정 Plasmodium falciparum 기생충

체외에서 모델이 설명되어 있습니다 ¹. Plasmodium falciparum 감염된 적혈구는 영원히 인간의 뇌 microvascular 내피 세포에 바인딩을 위해 선택됩니다. 선택한 기생충은 별개의 표현형을 보여줍니다. 선정 과정은 다양한 사용하여 적용할 수 P. falciparum 변종과 내피 세포 라인.

대부분의 인간의 말라리아 사망자는 혈액 단계 Plasmodium falciparum의 기생충에 의해 발생합니다. 대뇌 말라리아, 질병의 가장 생명을 위협하는 합병증은 뇌 ^2-4 microvasculature에 색소 trophozoite 단계에서 Plasmodium falciparum 감염 적혈구 (iRBC)의 축적이 특징입니다. 이 microvessel 방해 (격리)는 산증, hypoxia 해로운 염증 크린 시토킨 ⁽⁵ 검토)로 연결됩니다. 격리는 또한 인체 ^{2, 3} 대부분의 microvascular 조직에서 발견된다. iRBC은 혈관 벽에 부착되는 메커니즘은 아직 제대로 이해됩니다.

불후의 인간 두뇌 microvascular 내피 세포 라인 (HBEC - 5i)은 혈액 뇌 장벽 ⁶ 체외 모델로 사용되고 있습니다. 그러나, Plasmodium falciparum iRBC은 빽빽한 sequestrat 달리 체외에서 HBEC - 5i에만 제대로 첨부대뇌 말라리아 케이스에서 발생 이온. 따라서 (풍부) 다양한 P.을 선택 패닝 분석을 개발 HBEC - 5i에 부착을위한 falciparum의 변종 높은 바인딩 기생충, 생체내에서 발생하는 것을 더 대리인의 인구를 얻기 위해서 인치

색소 trophozoite 단계에서 기생충 문화의 샘플 (iRBC과 감염되지 않은 RBC의 혼합물)는 페트리 접시에서 성장 HBEC - 5i의 레이어에 세탁하고 incubated입니다. 부화 후 요리가 부드럽게 uRBC와 언바운드 iRBC에서 무료로 세탁합니다. 신선한 uRBC는 HBEC - 5i와 incubated 하룻밤에 연결된 몇 iRBC에 추가됩니다. schizont 무대 기생충이 버스트로 reinvade RBC 이러한 링 단계 기생충은 다음날 수확 아르 merozoites. 충분한 자료 얻은 것입니다 (일반적으로 2-4주)과 선택의 새로운 원형을 수행할 수있을 때까지 기생충이 양식입니다. P.에 따라 falciparum 변형, 선택의 4-7 라운드는 인구를 위해 필요한대부분의 기생충은 HBEC - 5i에 바인딩 어디에. 바인딩 표현형은 점차적 따라서 HBEC - 5i에 대한 일반 선택이 표현형을 유지하기 위해 필요한, ​​변형 표면 항원 유전자 발현에 스위치를 나타내는 몇 주 후에 손실됩니다.

요약에서 우리는 선택 분석 렌더링에게 P.을 개발 falciparum은 기생충보다 "대뇌 말라리아 접착제"표현형합니다. 우리는 4 P. 3를 선택할 수 있었다 HBEC - 5i에 falciparum의 변종. 이 분석은 또한 성공적으로 인간의 피부와 폐의 내피 세포에 바인딩에 대한 기생충을 선택하는 데 사용되었습니다. 중요한 것은,이 방법은 뇌의 내피에 바인딩을위한 후보 기생충의 리간드를 확인하기 위해 조직을 특정 기생충의 인구를 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 분석은 putative 방지 격리 마약 ⁷ 화면으로 사용할 수 있습니다.

일반적인 권고 사항

인간 두뇌의 microvascular 내피 세포 (HBEC - 5i) 문화는 이전에 다음 ID로 ^{8, 6} 설명되었습니다. P.가 falciparum의 기생충은 ^9로 교양되었습니다. HBEC - 5i와 P. 모두 falciparum 기생충 문화는 항상 무균 상태에서 보관해야합니다. 모든 시약은 37 ° C.에 미리 예열한다 우리는 정기적으로 PCR (Minevera Biolabs, 다음과 같은 제조 업체의 지침)에 의해 mycoplasma 오염 ¹⁰ 확인하는 것이 좋습니다. 프로토콜은 그림 1에 요약됩니다.

1. 내피 세포 일상 문화

1. 필요한 시약을 준비합니다.

2. 문화 5 % CO _2와 37 ° C 배양기에서 10ml DMEM 완전한 매체와 통풍 25cm ² 플라스크에 HBEC - 5i.
3. 통로 세포들이 합류된다. 흡입에 의해 기존의 미디어를 제거하고 두 번 DMEM 불완전 매체 또는 조직 문화 학년 PBS (CA ^{2 +} 및 MG ^{2 +} 무료) 37 미리 예열 ° C.를 사용하여 세척
4. 사전 예열 시도의 1ml 추가플라스크의 전체를 커버하고 37 ~ 2 분 부화 psin - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.025 % 트립신, 0.5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 소용돌이 ° C.
5. 세포의 최소 90 %가 분리되었다는 거꾸로 현미경으로 확인합니다. 필요한 경우, 부드럽게 점착 성의 세포를 이동시키다하는 술병의 바닥을 물릴. 15ml 원뿔 튜브에 트립신 및 전송 세포를 차단하는 DMEM 완료 매체의 10ml를 추가합니다. 실온 (RT)에서 300g에 4 분 원심 분리기.
6. 뜨는을 취소하고 DMEM 전체 매체의 10ml로 펠렛을 resuspend. 철저하게 세포를 resuspend에 대한 해결책을 피펫 아래.
7. 새로운 문화 플라스크에 세포 현탁액 1 또는 2 ML을 추가하고 문화를 유지하기 위해 새로운 매체의 8ml를 추가합니다. 거꾸로 현미경으로 매일 문화의 성장을 평가하고 노란색 변하기 전에 매 2 또는 삼일 매체를 변경합니다.

2. 선택에 대한 내피 세포를 준비

1. 전에 selectio의 하루 이틀 N 하나 (혹은 이상) 60mm 페트리 접시에 무균 PBS (2 μg / cm ^2)에 희석 fibronectin을 추가합니다. 37 5-20 분 요리를 품어 ° C, 그럼 한달 동안 4 ° C에서 저장하고 한번 다시 사용할 수있는 fibronectin 솔루션을 제거합니다.
2. 통로 세포는 섹션 1.3에서 설명한. 1.5. 가정 백퍼센트 합류 세포 분리 및 10ml DMEM 전체 매체 (섹션 1.6., confluency이 낮은 경우 매체의 동등한 볼륨 resuspend, confluency는 80 % 였다면 예 8ml와 resuspend)에 resuspended 있었다 정지의 1.5ml 추가 fibronectin 코팅된 배양 접시와 DMEM 전체 매체의 다른 1.5ml로 세포.
3. 인큐베이터에있는 씨앗을 페트리 접시를 놓습니다. 참고 : 이상적으로, confluency 이틀 후에 선택의 시간을 90 % 정도됩니다.
4. 선택 사항입니다. HBEC - 5i 활성화하려면, 사전 선택에 50μg/ml 24 시간 최종 농도에서 TNF (Tumour의 괴사 팩터) 시토킨를 추가합니다.

1. 필요한 시약을 (여기 아래 표 참조) 준비합니다. 백혈구 고갈 필터 (일반 말라리아 기생충의 culturing에 대한 출판 ¹¹ "말라리아 연구의 방법"참조)을 통해 통과하여 전체 혈액 (그룹 O +)를 분리하여 인간의 적혈구 (RBC)를 준비합니다. 5 분 400g에 centrifuging 10 ML RPMI 불완전한 그들을 resuspending하여 두 번 RBC 씻으십시오. 4 세탁 RBC 계속 ° C를 불완전 매체 50 %의 혈소판에서.

2. 문화 P. 37 2 %의 혈소판과 부화에 RPMI 완료 매체 ° C 3퍼센트 CO _2, 1 % O _2, 96% N _2.와 falciparum에 감염된 RBC 기생충 (그림 2)의 개발 단계를 평가하기 위해 Giemsa의 얼룩 ¹¹ 매일합니다.
3. 정기적으로 (약 일주일에 한 번) sorbitol 치료 ¹² 문화를 동기화할 수 있습니다. 일 이전에 선택 분석, 5 % parasitaemia 이상에서 반지 무대 문화에 대한 목표 (이상 최소 10 %).

4. P.의 선택 내피 세포에 cytoadhesion위한 falciparum

1. HBEC - 5i 문화 (이상 90%) 50~100%에서 confluency되어야하는 동안 분석의 날, 기생충 문화 색소 trophozoite 단계 (그림 2) (이상 10 % parasitaemia)에 있어야합니다. 기생충 문화의 30μl 포장 셀 볼륨 HBEC - 5i 페트리 접시마다 필요합니다.
2. centrifuging (5 분 500g) 기생충 문화의 1.5ml로 두 번 기생충 씻으십시오. 뜨는 갓 만든, 예열, DMEM 불완전 매체 10ml로 resuspend 폐기하십시오. 세척에게 두 번째 시간을 반복합니다. 1 % BSA와 함께 불완전한 DMEM의 1.5ml와 30μl 모여 셀 볼륨을 Resuspend.
3. 두 매체 aspirating 및 불완전 DMEM의 3ml를 추가 HBEC - 5i 코팅 페트리 접시를 씻으십시오.
4. 37 HBEC - 5i 요리와 부화 기생충의 솔루션 ° 75min C를 추가합니다. 부화 기간 동안 (30 및 60 분 후) 두 번 기생충 Resuspend부드럽게 네 개의 방향뿐만 아니라, 시계 방향과 반 시계 방향으로 접시를 락을하여.
5. 부화 후, 3 따뜻한 DMEM 불완전 매체의 ML, 부드러운 흔들어 추가하는 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체를 aspirating하여 접시에게 5 번 씻는다. 많은 요리가 사용되는 경우, 그러한 37 물이 담겨있는 대형 플라스크 ° C.로 따뜻한 표면에 그들을 계속
6. 거꾸로 현미경 접시를 확인합니다. 많은 감염되지 않은 RBC 아직도 볼 수있다면, 위에서 설명한대로 더 세척 해. 오염의 위험을 피하기 위해 매우 조심스럽게 페트리 접시를 취급하고 있습니다.
7. 접시에서 매체를 제거하고 신선한 uRBC의 40μl 포장 셀 볼륨 따뜻한 RPMI 전체 매체의 3ml를 추가합니다.
8. 밀폐 챔버 잠복기에있는 접시, 3 분 가스를 놓고 37 ° C 야간에 인큐베이터에있는 챔버를 놓습니다.
9. 그날 이후, 섹션 4.4에서 설명한대로 유사한 방식으로, RPMI 불완전 매체로 세탁하여 기생충을 수확. 하지만 더 적극적으로. 키P 모든 매체 15ml 원뿔 튜브 (resuspended RBC를 포함)의 사용. 모든 RBC는 접시에서 제거된 것을 거꾸로 현미경으로 확인합니다.
10. 펠렛 기​​생충, 5ml RPMI 완료 매체와 장소 정상 culturing에 대한 플라스크에 혼합물에 resuspend 뜨는을 버리고.

5. 대표 결과

선택하지 않은 기생충 HBEC - 5i (그림 3A)에 바인딩의 낮은 수준을 보여줍니다. 따라서, 선택의 첫 라운드 이후 거의 기생충이 수확되고 그것은 선택의 두 번째 라운드에 대한 충분한 parasitaemia에 도달 culturing의 달 소요될 수 있습니다. 선택 각 라운드마다, 점점 더 많은 기생충은 내피 세포에 바인딩하고 선택은 짧은 시간 간격으로 반복 수 있습니다. 선택 4-5 라운드 후, 높은 바인딩 기생충의 인구는 (그림 3) 얻을 수 있습니다.

우리 손에, HBEC - 5i 또는 TNF 활성화 HBEC - 5i에 HB3 - HBEC의 바인딩은 시뮬레이션을했습니다ilar 수준 (데이터가 표시되지 않음).

프로토콜은 여기에서 설명한 4 P. 함께 테스트되었습니다 falciparum의 변종 : HB3, IT/FCR3, 3D7 및 Dd2 (표 1). 오직 후자도 선택 5 라운드 후 HBEC - 5i에 바인딩할 수 없습니다이었다.

HB3 기생충은 또한 인간의 피부와 폐 Microvascular 내피 세포 (HDMEC 및 HPMEC)에 cytoadherence이 선택되었습니다. 방법을 사용하여 선택 4 라운드가 여기에 설명된 후, 높은 바인딩 인구는 HDMEC 및 HPMEC (그림 4) 모두에 얻은 것입니다.

그림 1. 선정 과정의 개요.

P.의 그림 2. 개발 단계 falciparum은 적혈구를 감염. Giemsa의 얼룩은 1000X 확대 현미경 시각.

그림 3. HBEC - 5i에 바인딩 기생충의 전형. (A) 파란색 레이어는 Giemsa와 글루 타 알데히드와 스테인드와 HBEC - 5i 고정 1000X 확대 현미경 시각. uRBC 및 언바운드 iRBC가 씻겨 나서 사진을 촬영했다. 왼쪽 패널은 단일 P.을 보여줍니다 falciparum HB3 (선택되지 않은) 기생충은 HBEC - 5i에 바인딩. 오른쪽 패널에서 HB3 - HBEC 기생충은 5 라운드를 위해 선택했다. (B) 데이터는 두 개의 독립적인 실험, 중복으로 수행 각각의 평균을 나타냅니다. 내피 세포 당 행 기생충의 수를 계산했다.

표 1. 성공적으로 HB3 또한 TNF - 활성 HB에서 선택한 것을 HBEC - 5i. 참고로 바인딩 선정되었다 Plasmodium falciparum의 종자의 요약EC - 5i. 선택 5 회진 후, Dd2 긴장이 선택되지 않은 - Dd2에 비해 HBEC - 5i에 바인딩에 증가했다 없습니다.

그림 4. P.의 바인딩 HDMEC 및 HPMEC에 대한 문화 매체 약간 차이가 있지만 이전과 선택 4 라운드 후 피부 (HDMEC)와 폐 (HPMEC) 내피 세포에 falciparum HB3 기생충. (업체의 지침을 참조) 선택에 사용되는 프로토콜과 마찬가지로 동일했습니다 HBEC - 5i. 사진은 400X 배율에서 찍은.

표 2. 재료

대뇌 말라리아의 특징은 P.의 격리입니다 두뇌 microvasculature ^{2, 3} 시간 falciparum iRBC. 그러나, P.의 체외 배양에 HBEC - 5i, 인간 두뇌 microvascular의 내피를위한 모델 falciparum은 제대로 cytoadhere. 여기 표현형보다 "처럼 - 생체내"HBEC - 5i에 바인딩을위한 인구를 풍성하게하는 직접적인 분석을 개발했습니다. 4 P. 중 3 falciparum의 변종이 성공적으로이 방법을 사용하여 선택되었습니다. 또한, HB3 또한이 프로토콜은 다양한 기생충 및 내피 세포 유형에 사용할 수 나타내는 HDMEC 및 HPMEC에 선정되었습니다.

다른 가설은 Dd2 변형과 바인딩의 부족을 설명할 수 있습니다. 이 기생충 라인 knobless이라는 사실되는 대부분, 이것은 깊이 cytoadherence ^{13, 14을} 막아.

우리는 선택 프로와 함께 culturing 선택되지 않은 기생충을 권장비교를위한 컨트롤을 제공하기 위해 세금. 이것은 기생충 리간드 후보를 발견의 희망과 함께, 바인딩 및 구속력이 기생충의 transcriptome를 비교 예를 들어, 수 있습니다.

TNF는 대뇌 말라리아 환자의 높은 수준에서 찾을 시토킨이며 HBEC - 5i (Claessens 동부 표준시 준비에 알, ^{8, 15, 16)의} 많은 표면 단백질의 표현을 유도하기 위해 공연을하고 있습니다. 이 경우, 행 iRBC의 양은 활성화 HBEC - 5i에 비해 일반 HBEC - 5i와 비슷한되었습니다.

이 "격리 모델은"또한 iRBC와 내피 세포 사이의 분자 상호 작용뿐만 아니라, putative 방지 cytoadherence 약물의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 경우, 우리는 "8 자 챔버 슬라이드"(BD 354628) 또는 "CultureWell"(시그마 C7735 - 20EA)와 같은 작은 우물에서 HBEC - 5i 도금 권장합니다.

우리는 공개 아무것도 없어.

우리는 HBEC - 5i 전지 시스코 Candal, CDC 기술 이전 사무소, 아틀란타 조지아 감사합니다. 이 작품은 Wellcome 트러스트 (AC 및 JAR에 기본 의생명 과학 수석 원정대에 사년 박사 학생이기, 부여 번호 084226)에 의해 재정 지원되었다.