Белки мембранные наложения Пробирной: протокол для тестирования Взаимодействие растворимых и нерастворимых белков В пробирке

Тестирование белок-белковые взаимодействия является необходимым условием для вскрытия белка функциональности. Здесь мы вводим В пробирке Белок-белковых связывания для исследования мембранного белка с иммобилизованным растворимого белка. Этот препарат обеспечивает надежный метод для проверки взаимодействия между нерастворимых белков и белков в растворе.

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights.

For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins ^1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins’ interactions, the fluorescent signal is reconstituted^3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells ³. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions⁷.

Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.

Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport^8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) ¹⁵, is demonstrated using this technique.

1. Выражение и извлечения белков

1. Дифференциально теги белки должны быть проверены на их обнаружение. Этикетка белка для иммобилизованных на мембране (ProIM) с тегом больших размеров (например, стоимость), а неконденсированное тег может быть использован в качестве иммобилизованных отрицательного контроля (ProIMnc). Этикетка белков для использования в качестве растворимых зонд (ProSol) либо с большим или небольшим тегов. Предохранитель же тег в соответствующий негативный контроль растворимого белка (ProSOLnc) и включить в анализ взаимодействия для подтверждения специфичности обнаружены обязательными.
2. Выбор системы экспрессии белка, чтобы выразить меткой белки, то есть, Е. палочка, бакуловирус и т.д., в зависимости от требований потенциальных сообщение поступательные изменения и урожайность белков.
3. Извлечение ProIM и ProIM _пс из организма выбора (шаг 1,2) с помощью SDS-PAGE загрузки буфера (20% глицерина, 4% SDS, 20 мМ Трис-HCl, pH6.8), содержащий протеиназы коктейль ингибитора. Оставьте клеточной суспензии при комнатной температуре в течение 15 мин, добавить 0,5% 2-меркаптоэтанола и кипятите в течение 5 мин.
4. Извлечение ProSol и ProSol _пс из организма выбора (шаг 1,2), используя стандартные протоколы ^16. Эти белки должны быть хорошо растворимы в связывающем буфере (140 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT, 1% БСА, 0,1% Твин-20), используемых в шаге 4.1.
5. Определить концентрацию рекомбинантных белков с использованием стандартного метода, например, Bio-Rad комплект анализа белка. такие как Bio-Rad комплект анализа белка. Если сырой экстракт, а не очищенный белок, используется для анализа, оценки концентрации белка интерес в этом экстракте методом сканирующей денситометрии соответствующей зоны на SDS-полиакриламидном геле окрашивали Кумасси Brilliant Blue R-250 и с помощью известных концентрации БСА в качестве справочных.

2. Иммобилизация ProIM и ProIMnc на мембране

1. Resolve два набора экстрактов, каждый из которых содержит 1 мкг ProIM и ProIM _пс на SDS-полиакриламидном геле в соответствии со стандартным протоколом ^16.
2. После электрофореза, место передачи геля в 100 мл буфера передачи (60 мМ глицина, 10 мМ Трис, 0,0006% SDS, 20% метанола) и инкубировать при легком помешивании в течение 20 мин при комнатной температуре.
3. Электропереноса белки, содержащиеся в геле для нитроцеллюлозы мембраны в соответствии со стандартным протоколом ^16.

3. Re-складывания мембраной белков

1. После электропереноса, инкубировать мембраны в течение 15 минут в 15 мл буфера (30 мМ Трис-HCl pH7.4, 0,05% Твин-20) с нежным агитацию, чтобы удалить остатки SDS.
2. После слива тщательно, передача мембраны до 25 мл буфера денатурации (7 М гуанидина гидрохлорида, 2 мМ EDTA, 50 мМ DTT, 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3). и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре при легком помешивании. (Примечание: нитроцеллюлозные мембраны становится непрозрачной, когда инкубировали в денатурации буфера). и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре при легком помешивании.
3. Передача мембраны до 25 мл TBS (10 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,4) и инкубировать при легком помешивании в течение 5 мин (Примечание: На этом этапе, мембрана восстанавливает свою первоначальную белого цвета).
4. Передача мембраны до 25 мл буфера для связывания (см. шаг 1.2) и инкубируют при 4 ° С с нежным агитацией за одну ночь.

4. Зондирование ProIM по ProSol

1. Вырезать мембраны на две полосы, каждая из которых содержит ProIM и ProIM _пс.
2. Сделать ProSol и ProSOLnc решения гибридизации путем разведения препарата с 1-10 мкг либо ProSol или ProSOLnc в 10 мл свежего буфера для связывания. Передача каждого мембрану в ProSol или ProSOLnc гибридизации раствора и инкубировать в течение 1,5 ч при комнатной температуре при легком помешивании.
3. Удалить мембраны от гибридизации решений и промыть три раза в течение 15 минут в каждом из TBS.

5. Визуализация белок-белковых взаимодействий с помощью метода иммуноблоттинга

1. Блок мембраны с 2,5% обезжиренного молока в TBST (10 мМ Трис-HCl, 140 мМ NaCl, 0,05% Твин-20, рН 7,4) в течение 1 часа при комнатной температуре. Развести первичного антитела (анти-strepII поликлональных антител кролика) в 0,5% обезжиренного молока в TBST при концентрации, рекомендованные производителем.
2. Место заблокированный мембраны в раствор антител и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С при легком помешивании.
3. Промыть мембраны в 20 мл TBST в течение 15 минут, и дважды в течение 5 мин при комнатной температуре с нежным агитации.
4. Развести вторичные антитела (анти-IgG антитела кролика), сопряженных с пероксидазой хрена (HRP) в 0,5% обезжиренного молока в TBST при концентрации, рекомендованные производителем. Место мембран в вторичными антителамиРешение и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре с нежным агитации.
5. Промыть мембраны в 20 мл TBST в течение 15 минут, и дважды в течение 5 мин при комнатной температуре с нежным агитации. После окончательного полоскания в TBS, визуализировать белок-белковые взаимодействия с использованием субстрата ПХ хемилюминесценции (например, Millipore Immobilon западной хемилюминесцентный HRP подложки).
6. Зонд же мембран с первичными антителами для тега, слитый с ProIM, после чего соответствующие вторичные антитела, как описано в шагах 5,1 до 5,4. Визуализируйте ProIM и ProIMnc как описано в шаге от 5,5 до проверки личности полосы, полученные в наложения мембранного белка анализа (шаг 5.5). В большинстве случаев, зачистки не нужно, потому что сигнал получен этот шаг гораздо сильнее, чем остаточная сигнала, полученного на шаге 5.5.

6. Представитель Результаты:

АНК-MP взаимодействия наблюдался BiFC в табачных клеток эпидермиса (рис. 1А). Потому что депутат высоко нерастворимый белок, выраженных в бактерии или в растениях, наложения мембранного белка анализа было принято для проверки этого взаимодействия в пробирке (рис. 1В). Белки экстракты, содержащие 1 мкг GST-MP (ProIM) или неконденсированное GST (ProIM _пс) решались путем SDS-электрофореза в полиакриламидном геле, а затем электропереноса на нитроцеллюлозные мембраны. Когда эти ProIMs были исследованы с растворимыми АНК-strepII (ProSol), GST-MP, но не неконденсированное GST, выставлены обязательными (рис. 1Б, дорожки 1, 2, по сравнению с полосы 5, 6). Более того, когда же набор ProIMs были исследованы с несвязанными ProSOLnc, т.е. Arabidopsis цитоплазматической киназы NADH меткой strepII (NADH3-strepII), нет привязки не наблюдалось, дальнейшие демонстрации специфики АНК-MP взаимодействия (рис. 1Б, дорожки 3, 4).

Рисунок 1. Специфическое связывание табака АНК к ВТМ МП в естественных условиях и в пробирке. () АНК-MP взаимодействия в живых табака клеток эпидермиса, обнаруженных BiFC. Сильный сигнал YFP был реконструирован, когда депутат и АНК, слитый с С-концевым и N-терминал половинки YFP, соответственно, были coexpressed в табачных эпидермиса следующие microbombardment их гены, кодирующие. Это BiFC сигнал, накопленный в puncta на периферии клетки, которые являются диагностика плазмодесмами ^15. (B), АНК-MP взаимодействия в пробирке, обнаруженных белков анализ наложения оболочки. Белки экстракты, содержащие 1 мкг GST-MP (ProIM) или неконденсированное GST (ProIMnc) были решены на 15% SDS-полиакриламидном геле с последующей электропереноса на нитроцеллюлозные мембраны. GST-MPProIM и GSTProIMnc инкубировали с 0,5 мкг / мл АНК-strepII (ProSol) и АНК обязательным был обнаружен с помощью зондирования мембраны с анти-strepII кролик поликлональных антител, а затем анти-IgG кролика + М вторичными антителами конъюгированных с HRP (дорожки 1 и 2). Ни GST-MPProIM ни GSTProIMnc взаимодействовали с несвязанными белка, Arabidopsis цитоплазматической киназы NADH, слитый с strepII тегом (ProSOLnc, полосы 3 и 4). Идентичность группы наблюдалось в данном исследовании было подтверждено с помощью зондирования мембраны с анти-GST антител (полосы 5 и 6). Когда мембраны обрабатывали денатурации буфера без промывают буфером, связывание GST-депутата АНК потеряно, в то время как неизвестные белки, содержащиеся в GST-МП и GST contining экстракты белка взаимодействует с АНК-strepII, что свидетельствует о важности от 3,1 до шаг процесса денатурации (дорожки 7 и 8).

Этот подход подходит для тестирования белок-белковых взаимодействий между комбинациями белков, когда по крайней мере один из которых белки хорошо растворим в связывающем буфере, и была успешно применена к другим сочетанием белков ^17,18. IInteractions между белками, которые являются нерастворимыми в этих условиях не может быть проверено этим протоколом.

Кроме того, успешное рефолдинг ProIM имеет решающее значение для анализа. Промывка мембран в TBS после электропереноса является ключевым шагом, потому что остаточная SDS может нарушить денатурации / ренатурации процесса.

Наконец, во избежание неспецифического связывания, концентрация ProSol в связывании буфера не должен превышать 1 мкг / мл. ProSol который слишком сосредоточены могут проявлять не-специфического связывания с ProIM. Кроме того, для блокирования неспецифического связывания мембранных белков иммобилизованных ProSol, BSA в гибридизации буфер, используемый на шаге 4.2 можно заменить на обезжиренное молоко.

Нет конфликта интересов объявлены.

Работа в нашей лаборатории проводится при поддержке грантов от NIH, Министерство сельского хозяйства США Национального института сельского хозяйства и продовольствия, NSF, BARD, Министерство энергетики и Черноморского флота к VC