Essai de superposition des protéines membranaires: Un protocole pour tester l'interaction entre les protéines solubles et insolubles In vitro

Test interaction protéine-protéine est indispensable pour la dissection de la fonctionnalité des protéines. Ici, nous introduisons une In vitro Protéine-protéine test de liaison de sonder une membrane immobilisée protéine avec une protéine soluble. Ce test fournit une méthode fiable pour tester l'interaction entre une protéine insoluble et une protéine en solution.

Validation des interactions entre différentes protéines est essentielle pour l'étude de leurs fonctions biologiques au niveau moléculaire. Il existe plusieurs méthodes, à la fois in vitro et in vivo, pour évaluer la liaison aux protéines, et au moins deux méthodes qui se complètent les lacunes de l'autre devrait être menée afin d'obtenir des données fiables.

Pour un essai in vivo, la complémentation bimoléculaires de fluorescence (BiFC) test représente l'approche la plus populaire et la moins invasive qui permet de détecter les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes, ainsi que d'identifier la localisation intracellulaire de l'interaction des protéines ^1,2. Dans cet essai, non fluorescent moitiés N-et C-terminale de la GFP ou ses variantes sont fusionnés aux protéines testées, et quand les deux protéines de fusion sont réunies en raison des interactions des protéines testées », le signal fluorescent est reconstitué ^3-6 . Parce que son signal est facilement détectable par microscopie à épifluorescence ou confocale, BiFC a émergé comme un puissant outil de choix parmi les biologistes cellulaires pour étudier à propos interactions protéine-protéine dans ³ cellules vivantes. Ce test, cependant, peuvent parfois produire des résultats faux positifs. Par exemple, le signal fluorescent peut être reconstituée par deux fragments GFP réglée autant que 7 nm de l'autre en raison de fermer l'emballage dans un petit compartiment subcellulaire, plutôt qu'en raison d'interactions spécifiques ^7.

En raison de ces limitations, les résultats obtenus à partir des technologies d'imagerie cellulaire direct doit être confirmé par une approche indépendante basée sur un principe différent pour détecter les interactions entre protéines. Co-immunoprécipitation (Co-IP) ou le glutathion transférase (GST) déroulant tests représentent ces méthodes alternatives qui sont couramment utilisées pour analyser les interactions protéine-protéine in vitro. Toutefois, dDans ces essais, cependant, les protéines doivent être testés facilement soluble dans le tampon qui supportsused pour la réaction de liaison. Par conséquent, des interactions spécifiques impliquant une protéine insoluble ne peut être évaluée par ces techniques.

Ici, nous illustrons le protocole pour l'essai de superposition protéine membranaire contraignant, qui contourne cette difficulté. Dans cette technique, l'interaction entre les protéines solubles et insolubles peuvent être testés de manière fiable, car l'une des protéines est immobilisé sur une matrice de la membrane. Cette méthode, en combinaison avec les expériences in vivo, comme BiFC, offre une approche fiable pour étudier et caractériser les interactions entre les protéines fidèlement solubles et insolubles. Dans cet article, liant entre le virus de la mosaïque du tabac (TMV) protéine de mouvement (MP), qui exerce de multiples fonctions au cours virale de cellule à cellule de transport ^8-14, et un interacteur usine récemment identifié cellulaires, tabac ankyrine répétées contenant des protéines (ANK ) ^15, est démontrée en utilisant cette technique.

1. Expression et l'extraction des protéines

1. Différentiellement tag les protéines d'être testés pour leur détection. Étiquette à la protéine d'être immobilisée sur la membrane (ProIM) avec une étiquette de plus grande taille (par exemple, TPS), et la balise sans fusible peut être utilisé comme un contrôle négatif immobilisé (ProIMnc). Étiquette à la protéine d'être utilisé comme une sonde solubles (PROSOL) avec soit une grande ou une petite étiquette. Fusible la même étiquette à une protéine de contrôle négatif appropriés solubles (ProSOLnc) et inclure dans le test d'interaction pour confirmer la spécificité de la liaison détectée.
2. Choisissez le système d'expression de protéines pour exprimer des protéines marquées, à savoir, E. coli, baculovirus, etc, selon l'exigence de modifications post traductionnelles et les rendements potentiels des protéines.
3. Extrait ProIM et ProIM _nc de l'organisme de son choix (étape 1.2) en utilisant un tampon de charge SDS-PAGE (glycérol 20%, 4% SDS, 20 mM Tris-HCI, pH 6,8) contenant un cocktail d'inhibiteur de protéinase. Laisser la suspension cellulaire à température ambiante pendant 15 min, ajouter 0,5% de 2-mercaptoéthanol et faire bouillir pendant 5 min.
4. Extrait PROSOL et PROSOL _nc de l'organisme de son choix (étape 1.2) en utilisant un des protocoles standard de ^16. Ces protéines doivent être facilement solubles dans le tampon de liaison (140 mM NaCl, 10 mM, Tris-HCl pH 7,4, EDTA 2 mM, 2 mM DTT, 1% de BSA, 0,1% Tween 20) utilisé dans l'étape 4.1.
5. Déterminer la concentration de protéines recombinantes utilisant une méthode standard, tels que Bio-Rad kit de dosage de protéines. tels que Bio-Rad kit de dosage de protéines. Si l'extrait brut, plutôt que la protéine purifiée, est utilisée pour le dosage, l'estimation de la concentration de la protéine d'intérêt dans cet extrait en scannant la densitométrie de la bande correspondante sur une SDS-polyacrylamide gel coloré de Coomassie Brilliant Blue R-250 et en utilisant connus Les concentrations de BSA comme référence.

2. Immobilisation de ProIM et ProIMnc sur la membrane

1. Résoudre les deux ensembles d'extraits, chacun contenant 1 ug d'ProIM et ProIM _nc sur un gel SDS-polyacrylamide selon le protocole standard ^16.
2. Après l'électrophorèse, placer le transfert du gel dans 100 ml de tampon de transfert (60 mM de glycine, 10 mM Tris, 0,0006% de SDS, 20% MeOH) et incuber en agitant doucement pendant 20 min à température ambiante.
3. Électrotransfert des protéines contenues dans le gel d'une membrane de nitrocellulose selon le protocole standard ^16.

3. Re-repliement des protéines membranaires

1. Après électrotransfert, incuber la membrane pendant 15 min dans 15 ml de tampon A (30 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,05% Tween 20) avec une agitation douce pour éliminer les résidus de SDS.
2. Après la vidange attentivement, le transfert de la membrane à 25 ml de tampon de dénaturation (7 M chlorhydrate de guanidine, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8,3). et incuber pendant 2 heures à température ambiante avec agitation douce. (Remarque: La membrane de nitrocellulose devient opaque lorsqu'elle est incubée dans le tampon de dénaturation). et incuber pendant 2 heures à température ambiante avec agitation douce.
3. Transférer la membrane à 25 ml de TBS (10 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, pH 7,4) et incuber en agitant doucement pendant 5 min (Note: Durant cette étape, la membrane reprend sa couleur blanche originale).
4. Transférer la membrane à 25 ml de tampon de liaison (voir étape 1.2) et incuber à 4 ° C avec agitation douce pendant la nuit.

4. Sonder les ProIM par PROSOL

1. Couper la membrane en deux bandes, à la fois contenant et ProIM ProIM _nc.
2. Faire les solutions d'hybridation et de PROSOL ProSOLnc par dilution de la préparation avec mg 1-10 de PROSOL soit ou ProSOLnc dans 10 ml de tampon de liaison douce. Transfert chaque membrane dans la solution d'hybridation ou de PROSOL ProSOLnc et incuber pendant 1,5 h à température ambiante avec agitation douce.
3. Retirer les membranes des solutions d'hybridation et rincer trois fois pendant 15 minutes dans chacune des SCT.

5. Visualisation interaction protéine-protéine par immunoblot

1. Bloc de la membrane avec du lait écrémé 2,5% dans TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM de NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) pendant 1 h à température ambiante. Diluer l'anticorps primaire (anti-strepII anticorps polyclonal de lapin) dans le lait écrémé 0,5% dans TBST à la concentration recommandée par le fabricant.
2. Placer les membranes bloquées dans la solution d'anticorps, et incubées pendant 1 h à température ambiante ou pour une nuit à 4 ° C avec agitation douce.
3. Rincer les membranes dans 20 ml TBST pendant 15 min, et deux fois pendant 5 min à température ambiante avec agitation douce.
4. Diluer l'anticorps secondaire (anti-IgG de lapin) conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dans le lait écrémé 0,5% dans TBST à la concentration recommandée par le fabricant. Placer les membranes dans l'anticorps secondairesolution et incuber pendant 1 h à température ambiante avec agitation douce.
5. Rincer les membranes dans 20 ml TBST pendant 15 min, et deux fois pendant 5 min à température ambiante avec agitation douce. Après le rinçage final dans le TBS, de visualiser l'interaction protéine-protéine en utilisant un substrat HRP chimiluminescence (par exemple, Millipore Immobilon ouest chimioluminescence HRP substrat).
6. Sondez les mêmes membranes avec l'anticorps primaire pour l'étiquette fusionnée à ProIM, suivie par l'anticorps secondaire approprié tel que décrit dans les étapes 5.1 à 5.4. Visualisez ProIM et ProIMnc comme décrit dans l'étape 5.5 de valider l'identité des bandes obtenues dans le dosage de superposition des protéines membranaires (étape 5.5). Dans la plupart des cas, le décapage n'est pas nécessaire, parce que le signal obtenu par cette étape est beaucoup plus forte que signal résiduel obtenu à l'étape 5.5.

6. Les résultats représentatifs:

L'interaction ANK-MP a été observée par BiFC dans les cellules de tabac épidermique (figure 1A). Parce que MP est une protéine hautement insoluble lorsqu'il est exprimé dans des bactéries ou des plantes, le dosage de superposition des protéines membranaires a été adoptée afin de valider cette interaction in vitro (figure 1B). Des extraits protéiques contenant 1 ug de GST-MP (ProIM) ou non condensés TPS (ProIM _NC) ont été résolus par SDS-polyacrylamide gel d'électrophorèse, suivie par électrotransfert sur ​​membrane de nitrocellulose. Lorsque ces ProIMs ont été sondés avec solubles ANK-strepII (PROSOL), TPS-MP, mais pas non fusionnée TPS, exposée liaison (figure 1B, les pistes 1, 2, comparer aux lignes 5, 6). En outre, lorsque le même ensemble de ProIMs ont été sondés avec une ProSOLnc indépendantes, c'est à dire, Arabidopsis kinase cytoplasmique NADH taggés strepII (NADH3-strepII), aucune liaison n'a été observée, démontrant la spécificité de l'interaction ANK-MP (figure 1B, les voies 3, 4).

Figure 1. Liaison spécifique de tabac ANK au TMV MP in vivo et in vitro. (A) ANK-MP interaction dans des cellules vivantes du tabac épidermique détectée par BiFC. Forte de signal YFP a été reconstruit en MP et ANK, fusionnée à C-terminale et N-terminale moitiés de la YFP, respectivement, ont été co-exprimés dans l'épiderme du tabac suivants microbombardment de leurs gènes codant. Ce signal BiFC accumulés dans lacrymaux, à la périphérie des cellules, qui sont de diagnostic des plasmodesmes ^15. (B) ANK-MP interaction in vitro, tel que détecté par le dosage des protéines membranaires de superposition. Des extraits protéiques contenant 1 ug de GST-MP (ProIM) ou non condensés TPS (ProIMnc) ont été résolus sur un 15% gel SDS-polyacrylamide, suivie par électrotransfert sur membrane de nitrocellulose. La TPS et la MPProIM GSTProIMnc ont été incubées avec 0,5 pg / ml de ANK-strepII (PROSOL), et ANK contraignante a été détectée en sondant la membrane avec l'anticorps de lapin anti-strepII polyclonaux, suivis par les anti-IgG de lapin + M anticorps secondaire conjugué à la HRP (voies 1 et 2). Ni la TPS ni MPProIM GSTProIMnc interagi avec une protéine non liée, chez Arabidopsis kinase cytoplasmique NADH, fusionnée à la balise strepII (ProSOLnc, pistes 3 ​​et 4). L'identité de la bande observée dans cet essai a été confirmée en sondant la membrane avec anticorps anti-GST (pistes 5 et 6). Lorsque la membrane a été traité avec tampon de dénaturation, sans être lavés avec le tampon A, la liaison de la TPS-MP au ANK est perdu, tandis que les protéines non identifiées contenues dans le TPS-MP et des extraits de protéines contenant leurs TPS réagi avec ANK-strepII, démontrant l'importance de l'étape 3.1, avant le processus de dénaturation (voies 7 et 8).

Cette approche est appropriée pour les tests interactions protéine-protéine entre les combinaisons des protéines, quand au moins un dont les protéines est facilement soluble dans le tampon de liaison, et a été appliquée avec succès à une autre combinaison de protéines ^17,18. Le iInteractions entre les protéines qui sont insolubles dans ces deux conditions ne peuvent pas être testés par ce protocole.

Aussi, le repliement de la réussite ProIM est critique pour le dosage. Rinçage de la membrane dans du TBS, après l'électrotransfert est l'étape clé, car la valeur résiduelle SDS peut altérer le processus de dénaturation / renaturation.

Enfin, pour éviter une liaison non spécifique, la concentration de PROSOL dans le tampon de liaison ne doit pas dépasser 1 ug / ml. PROSOL qui est trop concentrée peut présenter une liaison non spécifique aux ProIM. Aussi, pour bloquer la liaison non-spécifique de protéines de la membrane immobilisée à PROSOL, BSA dans le tampon d'hybridation utilisée pendant l'étape 4.2 peut être substitué au lait écrémé.

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Le travail de notre laboratoire est soutenu par des subventions du NIH, Institut national de l'USDA pour l'alimentation et l'agriculture, de la NSF, BARD, le DOE, et BSF au VC