الفحص البروتين تراكب الأغشية : بروتوكول لاختبار التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في المختبر

لا غنى عن اختبار البروتين البروتين التفاعل لتشريح وظيفة البروتين. هنا ، نحن بتقديم و في المختبر البروتين البروتين فحص ملزمة ليشمل التحقيق في غشاء من البروتين ثبتوا مع بروتين قابل للذوبان. هذا الاختبار يوفر طريقة موثوق بها لاختبار التفاعل بين البروتينات غير قابلة للذوبان وبروتين في الحل.

التحقق من التفاعلات بين البروتينات المختلفة أمر حيوي لتحقيق وظائفها البيولوجية على المستوى الجزيئي. هناك أساليب عدة ، سواء في التجارب المختبرية والحية ، لتقييم ملزمة البروتين ، وينبغي أن تجرى على الأقل طريقتين التي تكمل بعضها البعض أوجه القصور في الحصول على رؤى وثوقية.

لمقايسة في الجسم الحي ، وتكامل ثنائي الجزيء مضان (BiFC) مقايسة يمثل النهج الأكثر شعبية والأقل الغازية التي تمكن للكشف عن البروتين البروتين التفاعل داخل الخلايا الحية ، وكذلك تحديد توطين الخلايا من ^1،2 البروتينات المتفاعلة. في هذا الاختبار ، وتنصهر غير الفلورسنت N - C ومحطة GFP - نصفي أو مشتقاته للبروتينات اختبار ، وعندما يتم إحضارها بروتينات اندماج اثنين معا بسبب تفاعلات البروتينات اختبار "، يتم إعادة تشكيل إشارة الفلورسنت ^3-6 . بسبب اشارة غير قابلة للكشف بسهولة عن طريق الفحص المجهري أو epifluorescence مبائر ، برز BiFC كأداة قوية من الاختيار بين علماء الأحياء خلية لدراسة عن بروتين تفاعلات البروتين في الخلايا الحية ^3. هذا الاختبار ، ومع ذلك ، يمكن ان تنتج في بعض الأحيان إلى نتائج إيجابية كاذبة. على سبيل المثال ، يمكن تشكيل لإشارة الفلورسنت بشظايا GFP two رتبت بقدر 7 نانومتر من بعضها البعض بسبب إغلاق التعبئة والتغليف في المحفظة أ التحت خلوية صغيرة ، وأنه بدلا بسبب تفاعلات معينة ^7.

بسبب هذه القيود ، يجب تأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من تقنيات التصوير الخلية الحية بنهج مستقل يقوم على مبدأ مختلفة للكشف عن تفاعلات البروتين. شارك في مناعي (المشارك IP) أو الجلوتاثيون ترانسفيراز (GST) المنسدلة المقايسات تمثل هذه الطرق البديلة التي يشيع استخدامها لتحليل التفاعلات بين البروتينات والبروتين في المختبر. ومع ذلك ، IIN هذه المقايسات ، ومع ذلك ، يجب أن تكون قابلة للذوبان البروتينات اختبارها بسهولة في المنطقة العازلة التي supportsused للتفاعل ملزمة. لذا ، لا يمكن أن تنطوي على تفاعلات معينة غير قابلة للذوبان البروتين يتم تقييمها بواسطة هذه التقنيات.

هنا ، نحن لتوضيح بروتوكول للتراكب فحص غشاء بروتين ملزمة ، والتي تلتف على هذه الصعوبة. في هذه التقنية ، يمكن التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان اختبار موثوق لأنه يجمد واحد من البروتينات على مصفوفة الغشاء. هذا الأسلوب ، في تركيبة مع التجارب المجراة في مثل BiFC ، يقدم نهجا موثوق بها للتحقيق في وتوصيف التفاعلات بين البروتينات بإخلاص للذوبان وغير القابلة للذوبان. في هذه المقالة ، الربط بين فيروس موزاييك التبغ (TMV) البروتين حركة (MP) ، التي تمارس وظائف متعددة أثناء النقل الخلية الى خلية الفيروسية ^8-14 ، والنباتات التي تم تحديدها مؤخرا interactor الخلوية ، والتبغ ankyrin تكرار المحتوية على البروتين (عنخ ويتجلى) ¹⁵ ، وذلك باستخدام هذه التقنية.

1. التعبير واستخراج البروتينات

1. العلامة بالتفاوت في البروتينات لفحصها للكشف عنها. تسمية البروتين ليكون ثبتوا على الغشاء (ProIM) مع علامة من حجم أكبر (على سبيل المثال ، ضريبة المبيعات) ، ويمكن استخدام البطاقات غير مدمجة والسيطرة على سلبية أداء وظائفها (ProIMnc). تسمية البروتين لاستخدامها كمركز التحقيق القابلة للذوبان (بروسول) مع كبير إما أو علامة صغيرة. فتيل نفس العلامة لمراقبة البروتين السلبية المناسبة القابلة للذوبان (ProSOLnc) ، وتدرج في مقايسة التفاعل لتأكيد خصوصية ملزمة الكشف عنها.
2. اختيار النظام للتعبير عن بروتين تعبير البروتينات المفتاحية ، أي ، إي. القولونية ، الفيروسة العصوية ، وما إلى ذلك ، اعتمادا على شرط آخر التعديلات المحتملة متعدية والغلة من البروتينات.
3. استخراج ProIM _وNC ProIM من الكائن المختار (الخطوة 1.2) باستخدام SDS - PAGE العازلة تحميل (الجلسرين 20 ٪ ، 4 ٪ SDS ، 20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، pH6.8) التي تحتوي على بروتين كوكتيل المانع. ترك التعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، إضافة 0.5 ٪ من المركابتويثانول - 2 ويغلي لمدة 5 دقائق.
4. استخراج بروسول _وNC بروسول من الكائن المختار (الخطوة 1.2) باستخدام البروتوكولات القياسية ^16. وينبغي أن تكون هذه البروتينات القابلة للذوبان بسهولة في المخزن ملزمة (كلوريد الصوديوم 140 ملم ، 10 ملم ، ودرجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك تريس - 7.4 ، 2 مم EDTA ، 2 مم DTT ، BSA 1 ٪ ، 0.1 ٪ توين 20) المستخدمة في خطوة 4.1.
5. تحديد تركيز البروتينات المؤتلف باستخدام الطريقة القياسية ، مثل بيو راد البروتين طقم الفحص. مثل بيو راد البروتين طقم الفحص. إذا تم استخدام استخراج النفط الخام ، بدلا من البروتين النقي ، للفحص ، وتقدير تركيز البروتين من الاهتمام في هذا المستخلص عن طريق مسح قياس كثافة من الفرقة المقابلة على SDS - هلام بولي أكريلاميد الملون مع Coomassie بريليانت الأزرق R - 250 والمعروف به تركيزات BSA كمرجع.

2. تجميد ProIM وProIMnc على الغشاء

1. حل مجموعتين من المقتطفات ، يحتوي كل منها على 1 ميكروغرام من ProIM _وNC ProIM على جل SDS - بولي أكريلاميد وفقا لبروتوكول قياسي ^16.
2. بعد الكهربائي ، ومكان لنقل جل لفي 100 مل من نقل العازلة (60 ملي جليكاين ، 10 ملي تريس ، 0.0006 ٪ SDS ، MeOH 20 ٪) ، واحتضان مع الإثارة لطيف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. Electrotransfer البروتينات الموجودة في هلام لغشاء النيتروسليلوز وفقا لبروتوكول قياسي ^16.

3. إعادة للطي من البروتينات غشاء محدد

1. بعد electrotransfer ، احتضان الغشاء لمدة 15 دقيقة في 15 مل من العازلة A (30 ملي تريس - pH7.4 حمض الهيدروكلوريك ، 0.05 ٪ توين 20) مع لطيفة لإزالة التحريض SDS المتبقية.
2. بعد افراغ بعناية ، ونقل الغشاء الى 25 مل من العازلة تمسخ (7 هيدروكلوريد الجوانيدين M ، 2 مم EDTA ، 50 ملي DTT ، 50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك 8.3 درجة الحموضة). واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف. (ملاحظة : غشاء النيتروسليلوز عتامة عندما حضنت تمسخ في المنطقة العازلة). واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف.
3. نقل الغشاء الى 25 مل من TBS (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، كلوريد الصوديوم 150 ملم ، ودرجة الحموضة 7.4) ، واحتضان مع الإثارة لطيف لمدة 5 دقائق (ملاحظة : خلال هذه الخطوة ، الغشاء يستعيد لونه الأبيض الأصلي).
4. نقل الغشاء الى 25 مل من العازلة ملزمة (انظر الخطوة 1.2) ، واحتضان عند 4 درجة مئوية مع الإثارة لطيف ليلة وضحاها.

4. سبر ProIM بواسطة بروسول

1. قطع الغشاء الى قطعتين ، وكلاهما يحتوي على ProIM _وNC ProIM.
2. جعل الحلول والتهجين بروسول ProSOLnc بواسطة تمييع إعداد مع أي من 10-10 ميكروغرام بروسول أو ProSOLnc في 10 مل من العازلة ملزمة جديدة. نقل كل الغشاء الى حل التهجين أو بروسول ProSOLnc واحتضان لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف.
3. إزالة الأغشية من التهجين وحلول شطف ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة في كل TBS.

5. تصور البروتين البروتين التفاعل immunoblotting

1. كتلة الغشاء مع الحليب الخالي من الدسم 2.5 ٪ في TBST (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، كلوريد الصوديوم 140 ملم ، 20 توين 0.05 ٪ ، ودرجة الحموضة 7.4) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تمييع الضد الابتدائي (المضادة للأجسام المضادة strepII الأرنب النسائل المتعددة) في الحليب الخالي من الدسم 0.5 ٪ في TBST في التركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
2. مكان الأغشية المحظورة في حل الأضداد ، وحضنت لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف.
3. شطف في الأغشية TBST 20 مل لمدة 15 دقيقة ، ومرتين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف.
4. تمييع الضد الثانوية (المضادة للأرنب مفتش الضد) مترافق مع البيروكسيداز الفجل (HRP) في الحليب الخالي من الدسم 0.5 ٪ في TBST في تركيز موصى بها من قبل الشركة المصنعة. مكان الأغشية في الضد الثانويةالحل واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف.
5. شطف في الأغشية TBST 20 مل لمدة 15 دقيقة ، ومرتين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. بعد شطف النهائي في TBS ، تصور تفاعل البروتين البروتين باستخدام الركيزة معان كيميائي HRP (على سبيل المثال ، ميليبور Immobilon الغربية الركيزة HRP chemiluminescent).
6. المسبار الأغشية نفسه مع الضد الأولية للعلامة لتنصهر ProIM ، تليها الضد الثانوية المناسبة كما هو موضح في الخطوات 5،1-5،4. تصور ProIM ProIMnc وكما هو موضح في الخطوة 5.5 إلى التحقق من هوية الفرق التي تم الحصول عليها في تراكب فحص غشاء بروتين (الخطوة 5.5). في معظم الحالات ، وتجريد ليست ضرورية ، لأن الإشارات التي حصلت عليها هذه الخطوة هي أقوى بكثير من الإشارات المتبقية التي تم الحصول عليها من الخطوة 5.5.

6. ممثل النتائج :

وقد لوحظ التفاعل من قبل النائب كرانك BiFC في خلايا البشرة التبغ (الشكل 1A). لأن النائب هو بروتين غير قابلة للذوبان للغاية عندما أعرب في البكتيريا أو في النباتات ، واعتمد تراكب غشاء فحص البروتين للتحقق من صحة هذا التفاعل في المختبر (1B الشكل). تم حل مقتطفات من البروتين تحتوي على 1 ميكروغرام من GST - MP (ProIM) أو ضريبة السلع والخدمات غير مدمجة (ProIM _NC) بواسطة بولي أكريلاميد - SDS الكهربائي للهلام ، تليها electrotransfer لغشاء النيتروسليلوز. عندما تم بحث هذه ProIMs مع ذوبان كرانك strepII (بروسول) ، GST النائب ، ولكن لا ضريبة السلع والخدمات غير مدمجة ، عرضت ملزمة (1B الشكل ، الممرات 1 ، 2 ، مقارنة الممرات 5 ، 6). وعلاوة على ذلك ، عندما تم بحث نفس مجموعة ProIMs مع ProSOLnc لا علاقة لها ، أي Arabidopsis كيناز NADH هيولي strepII الموسومة (NADH3 - strepII) ، لم يلاحظ أي الملزمة ، مما يدل على مزيد من التحديد للتفاعل كرانك النائب (1B الشكل ، والممرات 3 ، 4).

الشكل 1. عنخ ملزمة محددة من التبغ إلى النائب TMV في الجسم الحي وفي المختبر. (A) كرانك النائب تفاعل الخلايا الحية في الكشف عن التبغ البشرة كما BiFC. أعيد بناؤها قوية YFP عند إشارة النائب وكرانك ، تنصهر فيها إلى C - N - محطة ومحطة نصفي YFP ، على التوالي ، وكانت في البشرة coexpressed التبغ microbombardment التالية من الجينات ترميز الخاصة بهم. هذه الإشارة BiFC المتراكمة في نقاط وعلى هامش الخلية ، والتي هي من التشخيص رابطات هيولية ^15. (ب) كرانك النائب التفاعل في المختبر الكشف عن بروتين الغشاء كما مقايسة تراكب. تم حل مقتطفات من البروتين تحتوي على 1 ميكروغرام من GST - MP (ProIM) أو ضريبة السلع والخدمات غير مدمجة (ProIMnc) على جل SDS - بولي أكريلاميد 15 ٪ ، تليها electrotransfer على غشاء النيتروسليلوز. وحضنت ضريبة السلع والخدمات ، وMPProIM GSTProIMnc مع 0.5 ميكروغرام / مل من كرانك strepII (بروسول) ، وكان الكشف عن عنخ ملزمة التحقيق الغشاء مع الأضداد المضادة للأرنب strepII النسائل المتعددة ، تليها المضادة للأرنب مفتش الأضداد M + الثانوية لمترافق HRP (حارات 1 و 2). لا ضريبة السلع والخدمات ، ولا MPProIM GSTProIMnc تفاعلت مع البروتين لا علاقة لها ، Arabidopsis كيناز NADH حشوية ، تنصهر فيها إلى العلامة strepII (ProSOLnc ، الممرات 3 و 4). وتم تأكيد هوية الفرقة التي لوحظت في هذا الاختبار من قبل الذين يحققون في الغشاء المضادة للضريبة السلع والخدمات الأضداد (حارات 5 و 6). عندما كان يعالج في الغشاء مع العازلة تمسخ دون غسلها مع العازلة ألف ، يتم فقدان الملزم للضريبة السلع والخدمات إلى النائب عنخ ، بينما البروتينات مجهولين الواردة في GST النائب ومقتطفات GST البروتين contining تفاعلت مع كرانك strepII ، مما يدل على أهمية من الخطوة 3.1 قبل عملية تمسخ (حارات 7 و 8).

هذا النهج هو مناسبة لاختبار البروتين البروتين التفاعلات بين مجموعات من البروتينات ، عندما تم تطبيقها بنجاح واحد على الأقل من البروتينات التي تذوب بسهولة في المخزن ملزمة ، ومجموعة أخرى من البروتينات ^17،18. لا يمكن iInteractions بين البروتينات التي هي غير قابلة للذوبان على حد سواء في ظل هذه الظروف يمكن اختباره من قبل هذا البروتوكول.

أيضا ، refolding ProIM الناجح هو أمر حاسم لمقايسة. الشطف في الغشاء TBS بعد electrotransfer هو خطوة رئيسية ، لأن SDS المتبقية يمكن أن يعوق عملية تمسخ / استعادة الطبيعة.

أخيرا ، لتجنب غير محددة وملزمة ، وينبغي تركيز بروسول في المنطقة العازلة ملزم لا يتجاوز 1 ميكروغرام / لتر. قد بروسول التي تتركز أيضا المعرض غير محددة وملزمة لProIM. أيضا ، يمكن لمنع الربط غير محددة من البروتينات إلى غشاء يجمد بروسول ، جيش صرب البوسنة في المنطقة العازلة التي استخدمت خلال التهجين الخطوة 4.2 لتكون بديلا الحليب الخالي من الدسم.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويدعم العمل في المختبر لدينا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ، وزارة الزراعة والمعهد الوطني للأغذية والزراعة ، وجبهة الخلاص الوطني ، بارد ، وزارة الطاقة ، والبنك السعودي الفرنسي لVC