Экспресс-диагностики вируса птичьего гриппа у диких птиц: Использование портативных-ПЦР и сублимированные реагенты в поле

Это исследование описывает диагностики птичьего гриппа у диких птиц с помощью портативного-ПЦР системы. Метод использует лиофилизированной реагентов для скрининга диких птиц в не лабораторных условиях, характерных для вспышки сценарию. Использование молекулярных инструментов обеспечивает точные и чувствительные альтернатив для экспресс-диагностики.

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.

Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.

The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

1. Дикие птицы захвата использованием тумана сетей

1. Для захвата shorebird, создать туман сети на активную нагула сайт, например, болото, береговой линии, или грязь квартиры.
2. Слайд мережа линии петли один конец тумана сеть вокруг полюса и полюса вставить вертикально в грязи.
3. Протяни сети, вставить второй полюс через петли мережа на другом конце сети и тумана вертикально вставить полюс в грязь, убедившись, что мережа линии учат.
4. Как только птица в плен, экстракт птица из сети и вернуться в полосы станции.

2. Клоаки тампоном выборки

1. Сбор мазки из клоаки сразу после съемки
2. Найдите клоаки и использование пальцев отодвинуть окружающие перья
3. Unwrap стерильной дакрона или полиэстер наконечником тампоном, стволовые конце первого, и смочить кончик стерильным вирусных транспортное средство для большего удобства в моечные. После увлажнения, вся глава тампоном аккуратно вставляется в клоаку. Тампон внутренней окружности клоаки Медленно крутит тампоном и удалите тампон из клоаки.
4. Вставка кончик тампона непосредственно в вирусную флаконе транспортной образцов носителей; вращать тампон вал между большим и указательным пальцами в то время как тампон в средствах массовой информации. Попросите помощника завершить процедуру, потянув за кончик тампона назад со дна флакона ~ 1 см и разрезать вал тампоном с ножницами так кончик тампона остается в пузырек и вал не мешает крышка закрытия. Закрыть сосуд крышкой плотно. Лечить ножницы с алкоголем в тампоном между режущими валами.
5. Место флаконов в морозильной камере коробку или сухого льда или пакеты со льдом.

3. Ротоглотки выборки тампоном

1. Аккуратно откройте клюв птицы так, чтобы хоан щель видна
2. Берем чистый тампон из упаковки, стволовые конце первого, и смочить наконечник с вирусными транспортное средство для большего удобства в моечные
3. Не касаясь кончиком к любой другой поверхности, вставьте его в рот и тампоном хоан отверстие на верхней челюсти и продолжают назад к ротоглотки или гортани регионе
4. Поместите кончик тампона непосредственно в вирусную флаконе транспортной среды. Поворот тампоном вал между большим и указательным пальцами в то время как тампон в средствах массовой информации. Как и выше, у помощника вытащить кончик тампона назад со дна флакона ~ 1 см и разрезать вал тампоном с ножницами так кончик тампона остается в пузырек и вал не мешает с крышкой закрытия. Закрыть сосуд крышкой плотно. Лечить ножницы с алкоголем в тампоном между режущими валами.
5. Место флаконов в морозильной камере коробку с сухим льдом или пакеты со льдом.

4. Обработке птицы и выпуска

1. Вернуться птиц к месту захвата и освобождения своевременно (<20 минут). Обработчики должны знать принципы защиты животных и быть начеку на признаки птицы страдания во время отбора проб (то есть ссадины, миопатии, гипо-или гипертермия). Основные аптечка должна быть включена в перечень экипировки.

5. Тестирование объектов

1. Образцы могут быть проверены в любом закрытом пространстве, например, прицепа исследований или палатке, с блоком питания (напряжение регулируемой мощности генератора), чтобы запустить блок ПЦР и придает компьютеру.

6. Выделения РНК

1. Выделения РНК проводили с RNeasy Мини комплект с незначительными изменениями, инструкции изготовителя следующие Спакман и др. ^1.
2. Vortex среду тампоном в течение 3-5 с и передачи 350 мкл до 2 мл микроцентрифужных трубки. Примечание: Следует остальные образцы на льду в случае ПЦР-положительных образцов должны быть rescreened или H5 тест должен быть запущен.
3. Добавить 350 мкл буфера RLT (с β-я) и вихревые течение 5 с
4. Добавить 350 мкл РНК классе 70% этанола.
5. Центрифуга на 5000 мкг в течение 5 мин.
6. Добавить 600 мкл надосадочной чтобы спина колонке помещены в 2 мл пробирки. Сохраните оставшиеся образца в испытательный стенд трубки.
7. Центрифуга в течение 20 с на высоте 10000 мкг и отбросить проточные.
8. Повторите шаги 17-18, пока все образец был принят в форме выделения колонки.
9. Место спин колонки в 2 мл чистой трубки коллекции.
10. Добавить 700 мкл буфера для RW1 спина колонны и центрифуги 25 с при 10000 х g. Отменить проточные.
11. Добавить 500 мкл буфера ПЭС в колонну спина и центрифуги в течение 25 с при 10000 х g. Отменить проточные.
12. Повторите шаг 22 для в общей сложности два промывок НПП буфера.
13. Центрифуга спин колонки для дополнительных 2 минут при 14000 х g. Отменить сбор трубки.
14. Место спин колонки в чистые 1,5 трубки микроцентрифужных мл и добавляют 50 мкл нуклеазы без воды. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 с
15. Элюции РНК, крутя в течение 60 с на высоте 10000 XGFили 60 с Место очищенные образцы на льду.

7. Подготовка отрицательного контроля

1. Лиофилизированный реагентов были подготовлены для использования в ПЦР в соответствии с инструкциями из лиофилизированной Айдахо Технологии Kit Обнаружение Реагент для TaqMan зонды гриппа Задача 1 (Асей-ASY-0109).
2. Центрифуга отрицательные флакон реагента контроля (красный) в течение 3 с для обеспечения гранулы в нижней части.
3. Снять крышку, визуально убедиться, что гранулы в нижней части.
4. Добавьте 20 мкл буфера 2 X Восстановление и 20 мкл воды класса реагентов.
5. Отчет и вихревые в течение 5 с при максимальной скорости.
6. Центрифуга в течение 3 с, чтобы принести жидкости на дно флакона.
7. Визуально проверьте гранул имеет регидратации, если не повторить шаги 31-32.
8. Внесите 19 мкл гидратированных смесь в LightCycler капиллярная трубка, повторите шаг пипетки во вторую капиллярную получить дубликат.

8. Подготовка тестовых образцов

1. Центрифуга неизвестные флакон реагента (синий) на 3 секунды, чтобы обеспечить гранулы в нижней части.
2. Снять крышку, визуально убедиться, что гранулы в нижней части.
3. Добавить 40 мкл очищенной РНК.
4. Отчет и вихревые в течение 5 с при максимальной скорости.
5. Центрифуга в течение 3 с, чтобы принести жидкости на дно флакона.
6. Визуально проверьте гранул имеет регидратации, если не повторить шаги 38-39.
7. Внесите 19 мкл гидратированных смесь в LightCycler капиллярная трубка, повторите шаг пипетки во вторую капиллярную получить дубликат.

9. Подготовка положительного контроля

1. Центрифуга положительные флакон реагента контроля (зеленый) в течение 3 с для обеспечения гранулы в нижней части.
2. Снять крышку, визуально убедиться, что гранулы в нижней части.
3. Добавьте 20 мкл буфера 2 X Восстановление и 20 мкл воды класса реагентов.
4. Отчет и вихревые в течение 5 с при максимальной скорости.
5. Центрифуга в течение 3 с, чтобы принести жидкости на дно флакона.
6. Визуально проверьте гранул имеет регидратации, если не повторить шаги 45-46.
7. Внесите 19 мкл гидратированных смесь в LightCycler капиллярная трубка, повторите шаг пипетки во вторую капиллярную получить дубликат.

10. Центрифугирование капилляров

1. Как только все капиллярные трубы для партии были подготовлены загружать их в мини-центрифуга оснащена капиллярной адаптеров.
2. Центрифуга на минимальное значение, удерживая нажатой кнопку пульс в течение 1 сек Это переводов жидкости на дно в рамках подготовки к тестированию.

11. Операционная RAPID

1. Создать новый файл. Этикетка положительного контроля, отрицательного контроля и образцов (по их идентификационный номер).
2. Программа 1: Подготовка образцов РНК Удерживайте
   1. Циклы = 1
   2. Анализ Режим = Нет
   3. Целевая температура = 40
   4. Инкубационный Время = 30 мин
   5. Оценить температуру перехода = 20 ° С / с (по умолчанию)
   6. Вторичная целевая температура = 0 (по умолчанию)
   7. Шаг Размер = 0 (по умолчанию)
   8. Шаг Delay = 0 (по умолчанию)
   9. Приобретение Mode = Нет (по умолчанию)
3. Программа 2: РНК Денатурация
   1. Циклы = 1
   2. Анализ Режим = Нет
   3. Целевая температура = 94
   4. Инкубационный Время = 120 с
   5. Оценить температуру перехода = 20 ° С / с (по умолчанию)
   6. Вторичная целевая температура = 0 (по умолчанию)
   7. Шаг Размер = 0 (по умолчанию)
   8. Шаг Delay = 0 (по умолчанию)
   9. Приобретение Mode = Нет (по умолчанию)
4. Программа 3: Усиление РНК
   1. Циклы = 45
   2. Анализ Mode = Auto Анализ
   3. Целевая температура, Сегмент 1 = 94; Сегмент 2 = 60
   4. Инкубационный период, Сегмент 1 = 0 с, Сегмент 2 = 20 с
   5. Температура перехода Rate, Seg 1 & 2 = 20 ° С / с (по умолчанию)
   6. Вторичные Целевая температура, Seg 1 & 2 = 0 (по умолчанию)
   7. Шаг Размер, Seg 1 & 2 = 0 (по умолчанию)
   8. Шаг Delay, Seg 1 & 2 = 0 (по умолчанию)
   9. Приобретение режиме Сегмент 1 = нет; Сегмент 2 = один
5. Параметры флуоресценции
   1. Режим отображения: флуоресценция канал 2 (канал 2 / 1)
      Доходы:
      1. Ч. 1 (F1) = 1
      2. Ч. 2 (F2) = 8
      3. Ч. 3 (F3) = 1
   2. Для отображения в режиме реального времени флуоресценции данных для каждого образца, выберите образец интерес и нажмите кнопку "Показать график" в нижней части экрана
6. Для каждого капилляра, результаты включают в себя следующее:
   • # - Определяет положение карусель карусель
   • Пример имя - предоставляет имя образца
   • Контроль - идентифицирует тип пробы для каждого образца
   • Оценка - рассчитывается с использованием отношения между флуоресценции образца и уровень фоновой флуоресценции в образце
   • Результат - отображает общий результат для образца

12. Представитель результаты:

Возможные результаты включают в себя следующее:
Присутствовали: "настоящее" вызов красный для испытаний и / или неизвестных образцов показывает, что цель была выявлена ​​в том, что пробы и контроля были успешными.
Не обнаружено: "не обнаружен" назвать зеленым испытаний и / или неизвестных образцов показывает, что цель не была, определенных в этом образце и тест контроля были успешными.
Пожалуйста, повторите: "пожалуйста, повторите 'показывает, что положительный или отрицательный контроль не удалось.

Примером успешного анализа RAPID 7200 показана на рисунке 4. Положительный контроль усиливается и создает обнаружить флуоресценции (оси ординат) примерно 25 циклов (оси Х). Цикл порог (КТ)> 35, согласились отсечки для большинства лабораторий ВГП, ссылки. Таким образом, положительного контроля для этого метода производится флуоресцентного сигнала в рамках принятой число циклов (0-35) для обнаружения ВГП. В отличие от отрицательного контроля не генерирует флуоресцентный сигнал, даже после 45 циклов. Кроме того, двенадцать образцов, взятых из западных куликов не генерировать флуоресцентный сигнал о том, что птицы были отрицательными для AIV. Последующие испытания всех положительных проб в традиционной лаборатории рекомендуется обеспечить, чтобы без ложных срабатываний ошибочно производится.

Рисунок 1. Shorebird захвата использованием тумана сетей.

Рисунок 2. Сборник клоаки и ротоглотки образцы из наименее куликов.

Рисунок 3. Программирование RAPID 7200 для амплификации РНК.

Рисунок 4. Флюорограмма порожденных RAPID 7200 портативный-ПЦР, показывающие, как положительный и отрицательный контроль должен появиться в успешной анализа. Щелкните здесь для просмотра полного размера изображения

Метод экспресс-диагностики, представленные здесь облегчает эффективный по времени и точное тестирование образцов диких птиц для наблюдения ВГП. Гораздо менее строгие требования к хранению образцов переносного-ПЦР подходят для удаленных ситуациях, когда поддержание холодовой цепи может оказаться нецелесообразным, если жидкость грузоотправителей азота или сухого льда не доступен. Кроме того, мы обнаружили, что анализ образцов с лиофилизированной реагентов был достаточно простым, чтобы быть выполнена поле биологи с минимальным знанием лабораторных молекулярного анализа. Техника пришло время эффективных и экономически рентабельным. С одним оператором, что практически можно запустить три партии, в результате чего 42 фильмов для ВГП, каждый день в поле настройки. Мы оценили, что все материалы, необходимые для запуска этой системы может быть доведена до любого места и методология может научить оператора в течение дня. Ограничивающим фактором в отдаленных ситуаций поле питания, необходимые для запуска портативной-ПЦР единицы и придает компьютеру, однако, это может быть смягчен за счет использования регулируемого напряжения портативный электрический генератор энергии. Кроме того, последовательность извлеченные РНК или исходного образца возможно только в случаях, когда холодовой цепи может быть временно сохраняется до доставки в лабораторию.

Наш предыдущий анализ показал, что портативный-ПЦР единицы имели одинаковые специфичность (100%) и сопоставимой чувствительности (98%) до выделения вируса выполняется в лаборатории setting2. Предыдущие исследования проверки показали, что ложные негативы Самая распространенная ошибка при ОТ-ПЦР из-за большой потенциал для неправильного приготовления образца, наличие ингибиторов ПЦР в фекалии или деградации лиофилизированного реагента ^1,3-4 шарик. Другим недостатком метода является чувствительность лиофилизированные реагенты с учетом появляющихся новых штаммов ВГП. Вирус находится в постоянном состоянии геномной перестановки там, где хостов перекрываются, что подтверждается результатами многочисленных исследований филогенетических ^5-8. Следовательно, праймеры и зонды выпускаемая для использования с портативными-ПЦР требует постоянного повторного подтверждения. Например, реагенты, специфичные для американской и евразийской линий из подтипов H5 и H7 теперь рекомендуется из-за расхождения вирус в соответствии с биогеографического региона ^9. Как и во всех других полевых испытаний, подозреваемых HPAIV срабатываний должны быть доставлены в утвержденный объекта для окончательного тестирования подтверждение с VI по высокой специфичностью и чувствительностью ^10.

В заключение, данное исследование показало, что портативный-ПЦР подходит для скрининга клоаки образцы от диких птиц к ВГП, в не лабораторных условиях. Основным преимуществом этого метода является для ускорения диагностики диких птиц, увеличивая шансы содержащие вспышки в удаленном месте с более быстрым временем отклика. Портативная-ПЦР также представляет собой прорыв для исследователей, которые стремятся раскрыть роль диких птиц в распространении ВГП. Возможность диагностировать состояние хоста в момент выборки позволяет собрать биологическую информацию для решения ключевых вопросов о иммунологических и физиологических реакций ^{от 11} до инфекции, или генетических характеристик, связанных с естественной резистентности у диких птиц ^12. Более того, развертывание дорогостоящих передатчиков спутника подтвердили хостов, чтобы отследить их движение будет иметь неоценимое значение для определения того, какие виды выступают в качестве междугородних перевозчиков ВГП, а также оценки их миграционного производительности, среде обитания предпочтения и уровни взаимодействия с домашней птицей. Будущее опытной эксплуатации в районах, имеющих международное значение для HPAIV, например, в Центральной и Южной Азии, ^13, будет окончательно определить, как быстро-ПЦР единиц выступать под вспышки сценариев, когда диагноз большое количество положительных проб срочных.

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы хотели бы поблагодарить М. Скаллион и Р. Крисп Айдахо технологии для технической поддержки и USGS западных экологических исследований Центра финансирования (С. Шварцбах) и помощь (К. Spragens, Т. Грэм). Это исследование проводилось под эгидой Центра инновационных технологий - Институт по вопросам обороны и Национальная Безопаность (www.idhs.org), в поддержке Министерства обороны и Исследовательская лаборатория ВВС. Животное обработки протоколов следуют утвержденным уходу и использованию животных комитета Геологической службы США Западная экологический центр исследований и разрешения американского Геологического Обзора кольцевание птиц лаборатории. Любое использование торговых, продуктов и фирменных наименований в данной публикации, в описательных целях и не подразумевает одобрения правительства США.