Method Article
Это исследование описывает диагностики птичьего гриппа у диких птиц с помощью портативного-ПЦР системы. Метод использует лиофилизированной реагентов для скрининга диких птиц в не лабораторных условиях, характерных для вспышки сценарию. Использование молекулярных инструментов обеспечивает точные и чувствительные альтернатив для экспресс-диагностики.
Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.
1. Дикие птицы захвата использованием тумана сетей
2. Клоаки тампоном выборки
3. Ротоглотки выборки тампоном
4. Обработке птицы и выпуска
5. Тестирование объектов
6. Выделения РНК
7. Подготовка отрицательного контроля
8. Подготовка тестовых образцов
9. Подготовка положительного контроля
10. Центрифугирование капилляров
11. Операционная RAPID
12. Представитель результаты:
Возможные результаты включают в себя следующее:
Присутствовали: "настоящее" вызов красный для испытаний и / или неизвестных образцов показывает, что цель была выявлена в том, что пробы и контроля были успешными.
Не обнаружено: "не обнаружен" назвать зеленым испытаний и / или неизвестных образцов показывает, что цель не была, определенных в этом образце и тест контроля были успешными.
Пожалуйста, повторите: "пожалуйста, повторите 'показывает, что положительный или отрицательный контроль не удалось.
Примером успешного анализа RAPID 7200 показана на рисунке 4. Положительный контроль усиливается и создает обнаружить флуоресценции (оси ординат) примерно 25 циклов (оси Х). Цикл порог (КТ)> 35, согласились отсечки для большинства лабораторий ВГП, ссылки. Таким образом, положительного контроля для этого метода производится флуоресцентного сигнала в рамках принятой число циклов (0-35) для обнаружения ВГП. В отличие от отрицательного контроля не генерирует флуоресцентный сигнал, даже после 45 циклов. Кроме того, двенадцать образцов, взятых из западных куликов не генерировать флуоресцентный сигнал о том, что птицы были отрицательными для AIV. Последующие испытания всех положительных проб в традиционной лаборатории рекомендуется обеспечить, чтобы без ложных срабатываний ошибочно производится.
Рисунок 1. Shorebird захвата использованием тумана сетей.
Рисунок 2. Сборник клоаки и ротоглотки образцы из наименее куликов.
Рисунок 3. Программирование RAPID 7200 для амплификации РНК.
Рисунок 4. Флюорограмма порожденных RAPID 7200 портативный-ПЦР, показывающие, как положительный и отрицательный контроль должен появиться в успешной анализа. Щелкните здесь для просмотра полного размера изображения
Метод экспресс-диагностики, представленные здесь облегчает эффективный по времени и точное тестирование образцов диких птиц для наблюдения ВГП. Гораздо менее строгие требования к хранению образцов переносного-ПЦР подходят для удаленных ситуациях, когда поддержание холодовой цепи может оказаться нецелесообразным, если жидкость грузоотправителей азота или сухого льда не доступен. Кроме того, мы обнаружили, что анализ образцов с лиофилизированной реагентов был достаточно простым, чтобы быть выполнена поле биологи с минимальным знанием лабораторных молекулярного анализа. Техника пришло время эффективных и экономически рентабельным. С одним оператором, что практически можно запустить три партии, в результате чего 42 фильмов для ВГП, каждый день в поле настройки. Мы оценили, что все материалы, необходимые для запуска этой системы может быть доведена до любого места и методология может научить оператора в течение дня. Ограничивающим фактором в отдаленных ситуаций поле питания, необходимые для запуска портативной-ПЦР единицы и придает компьютеру, однако, это может быть смягчен за счет использования регулируемого напряжения портативный электрический генератор энергии. Кроме того, последовательность извлеченные РНК или исходного образца возможно только в случаях, когда холодовой цепи может быть временно сохраняется до доставки в лабораторию.
Наш предыдущий анализ показал, что портативный-ПЦР единицы имели одинаковые специфичность (100%) и сопоставимой чувствительности (98%) до выделения вируса выполняется в лаборатории setting2. Предыдущие исследования проверки показали, что ложные негативы Самая распространенная ошибка при ОТ-ПЦР из-за большой потенциал для неправильного приготовления образца, наличие ингибиторов ПЦР в фекалии или деградации лиофилизированного реагента 1,3-4 шарик. Другим недостатком метода является чувствительность лиофилизированные реагенты с учетом появляющихся новых штаммов ВГП. Вирус находится в постоянном состоянии геномной перестановки там, где хостов перекрываются, что подтверждается результатами многочисленных исследований филогенетических 5-8. Следовательно, праймеры и зонды выпускаемая для использования с портативными-ПЦР требует постоянного повторного подтверждения. Например, реагенты, специфичные для американской и евразийской линий из подтипов H5 и H7 теперь рекомендуется из-за расхождения вирус в соответствии с биогеографического региона 9. Как и во всех других полевых испытаний, подозреваемых HPAIV срабатываний должны быть доставлены в утвержденный объекта для окончательного тестирования подтверждение с VI по высокой специфичностью и чувствительностью 10.
В заключение, данное исследование показало, что портативный-ПЦР подходит для скрининга клоаки образцы от диких птиц к ВГП, в не лабораторных условиях. Основным преимуществом этого метода является для ускорения диагностики диких птиц, увеличивая шансы содержащие вспышки в удаленном месте с более быстрым временем отклика. Портативная-ПЦР также представляет собой прорыв для исследователей, которые стремятся раскрыть роль диких птиц в распространении ВГП. Возможность диагностировать состояние хоста в момент выборки позволяет собрать биологическую информацию для решения ключевых вопросов о иммунологических и физиологических реакций от 11 до инфекции, или генетических характеристик, связанных с естественной резистентности у диких птиц 12. Более того, развертывание дорогостоящих передатчиков спутника подтвердили хостов, чтобы отследить их движение будет иметь неоценимое значение для определения того, какие виды выступают в качестве междугородних перевозчиков ВГП, а также оценки их миграционного производительности, среде обитания предпочтения и уровни взаимодействия с домашней птицей. Будущее опытной эксплуатации в районах, имеющих международное значение для HPAIV, например, в Центральной и Южной Азии, 13, будет окончательно определить, как быстро-ПЦР единиц выступать под вспышки сценариев, когда диагноз большое количество положительных проб срочных.
Нет конфликта интересов объявлены.
Мы хотели бы поблагодарить М. Скаллион и Р. Крисп Айдахо технологии для технической поддержки и USGS западных экологических исследований Центра финансирования (С. Шварцбах) и помощь (К. Spragens, Т. Грэм). Это исследование проводилось под эгидой Центра инновационных технологий - Институт по вопросам обороны и Национальная Безопаность (www.idhs.org), в поддержке Министерства обороны и Исследовательская лаборатория ВВС. Животное обработки протоколов следуют утвержденным уходу и использованию животных комитета Геологической службы США Западная экологический центр исследований и разрешения американского Геологического Обзора кольцевание птиц лаборатории. Любое использование торговых, продуктов и фирменных наименований в данной публикации, в описательных целях и не подразумевает одобрения правительства США.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии (необязательно) |
---|---|---|---|
RNeasy спина мини-колонки | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
Коллекция трубок (1,5 и 2 мл) | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
Буфера RLT | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
Буфер RW1 | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
Буфер НПП | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
РНКазы без воды | Qiagen | 74106 | Входит в комплект мини RNeasy |
14,3 M β-меркаптоэтанол решение | Fisher Scientific | BP176100 | |
100% этаноле | Fisher Scientific | NC9602322 | |
Genie Vortex 2, 120В | Научно Industries | SI-0236 | |
Taqman гриппа Задача 1 (гидролиз Probe) | Айдахо Технологии | Асей-ASY-0109 | |
LightCycler 20мл капилляров | Roche Applied Science | 04929292001 | |
Микро-центрифуга с ротатором для 2 мл пробирок | Айдахо Технологии | Входит в комплект RAPID | |
Повышенной прочности Расширенный Возбудитель идентификации устройства (РАПИД) 7200 | Айдахо Технологии | Входит в комплект RAPID | |
Pentium основе ноутбука с Windows XP Professional | Айдахо Технологии | Входит в комплект RAPID | |
LightCycler Анализ данных программного обеспечения | Айдахо Технологии | Входит в комплект RAPID |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены