Schnelle Diagnose der Aviären Influenza Virus bei Wildvögeln: Verwendung eines tragbaren rRT-PCR und gefriergetrocknet Reagenzien in das Feld

Diese Studie beschreibt Diagnose der Aviären Influenza bei Wildvögeln mit einem tragbaren rRT-PCR-System. Die Methode nutzt die Vorteile der gefriergetrockneten Reagenzien auf Wildvögel in einem Nicht-Labor-Einstellung, die typisch für einen Ausbruch Szenario Bildschirm. Verwenden von molekularen Werkzeugen bietet genaue und empfindliche Alternativen für eine schnelle Diagnose.

Wildvögel haben in der Ausbreitung der hoch pathogenen aviären Influenza (HPAI) des Subtyps H5N1 in Verbindung gebracht, woraufhin die Überwachung an den Flugrouten. Probenahme von Wildvögeln auf Geflügelpest-Virus (AIV) wird oft in abgelegenen Regionen durchgeführt, aber die Ergebnisse sind oft wegen der Notwendigkeit, Proben an ein Labor für molekulare Tests ausgestattet Transport verzögert. Real-time-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RRT-PCR) ist eine molekulare Verfahren, das eine der genauesten und empfindlichsten Methoden für die Diagnose von AIV bietet. Die bisher strengen Labor-Protokolle für rRT-PCR benötigt werden derzeit für den Bereich angepasst. Entwicklung von gefriergetrockneten (lyophilisierten) Reagenzien, die keine Kühlkette, mit Sensibilität auf der Ebene der nassen Reagenzien gebracht hat Vor-Ort-Remote-Tests, um ein praktisches Ziel.

Hier präsentieren wir eine Methode zur schnellen Diagnose von AIV bei Wildvögeln mit einem rRT-PCR-Einheit (Ruggedized Erweiterte Pathogen Identification Device oder RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT), dass lyophilisierte Reagenzien beschäftigt (Influenza A Target 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Idaho Technologies). Die Reagenzien enthalten alle erforderlichen Komponenten für die Prüfung bei entsprechenden Konzentrationen in einem einzigen Rohr: Primer, Sonden, Enzyme, Puffer und interne positive Kontrolle, Beseitigung von Fehlern mit unsachgemäße Handhabung oder Lagerung von nassen Reagenzien verbunden. Das tragbare Gerät führt einen Bildschirm für die Influenza A, indem sie auf der Matrix-Gen und liefert Ergebnisse innerhalb von 2-3 Stunden. Genetische Subtypisierung ist auch mit H5-und H7-Primer möglichen Mengen, die auf das Hämagglutinin-Gen.

Geeignet ist das System für den Einsatz auf Kloake und oropharyngealen Proben von Wildvögeln, wie hier auf dem wandernden shorebird Arten nachgewiesen, die westliche Flussuferläufer (Calidrus mauri) in Nordkalifornien aufgenommen. Behandlung der Tiere folgten Protokolle durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss des US Geological Survey westlichen Ecological Research Center und erlaubt der US Geological Survey Vogel Banding Laboratory genehmigt. Der primäre Vorteil dieser Technik ist die Diagnose von Wildvögeln zu beschleunigen, die Erhöhung der Chancen der mit einem Ausbruch in einem Remote-Standort. On-site-Diagnose wäre auch nützlich für die Bestimmung und Analyse von infizierten Personen in Wildpopulationen. Die Möglichkeit, Informationen über die Host-Biologie (immunologische und physiologische Reaktion auf eine Infektion) und räumlicher Ökologie (wandernde Leistung von infizierten Vögeln) sammeln Einblicke in welchem ​​Maße Wildvögel können als Vektoren für AIV über lange Distanzen zu fungieren.

1. Wild Bird Capture mit Fangnetze

1. Für shorebird erfassen, richten Fangnetze auf eine aktive Nahrungssuche Website wie ein Sumpf, Ufer, oder Schlamm flach.
2. Slide Spiegelnetzen Leitungsschleifen von einem Ende des Nebels net um die Stange und legen Pol senkrecht in den Schlamm.
3. Streck net, legen zweite Pole durch Spiegelnetzen Schlaufen am anderen Ende der Nebel net und vertikal einfügen Pol in den Schlamm, um sicherzustellen, dass die Spiegel-Linien gelehrt werden.
4. Sobald ein Vogel gefangen, extrahieren Sie die Vögel aus dem Netz und Rückkehr zu den Streifen entfernt.

2. Kloakenabstriches Probenahme

1. Sammeln Kloakenabstriche unmittelbar nach der Aufnahme
2. Suchen Sie die Kloake und die Nutzung Fingerspitzen zurück zu drängen umgebenden Federn
3. Packen Sie eine sterile Dacron-oder Polyester-bestückte Tupfer, Stielende erste und befeuchten Sie die Spitze mit einem sterilen welches Transportmittel für größere Leichtigkeit in swabbing. Nach der Befeuchtung wird der gesamte Kopf des Tupfers vorsichtig in die Kloake eingeführt. Swab dem Innenumfang der Kloake durch langsam drehend den Tupfer und entfernen Sie den Tupfer aus Kloake.
4. Einsetzen der Tupferspitze direkt in das virale Transport Media Probenfläschchen, drehen Sie den Tupferschaft zwischen Daumen und Zeigefinger, während der Tupfer wird in den Medien. Haben ein Assistent den Vorgang abzuschließen, indem Sie die Spitze des Tupfers wieder aus dem Boden des Fläschchens ~ 1 cm und schneiden die Welle der Tupfer mit einer Schere so die Tupferspitze bleibt in der Flasche und die Welle nicht stören Verschlusskappe. Cap Röhrchen fest. Desinfizieren Sie die Schere mit Alkohol zwischen Schneiden Tupfer Wellen.
5. Legen Sie die Flaschen in einer Tiefkühltruhe, die entweder Trockeneis oder Kühlakkus.

3. Oropharyngeale Tupfer Probenahme

1. Öffnen Sie vorsichtig die Vogelschnabel, so dass die Choanen Schlitz sichtbar ist
2. Packen Sie ein sauberes Wattestäbchen aus dem Paket, Stielende erste und befeuchten Sie die Spitze mit viralen Transportmedium für größere Leichtigkeit in swabbing
3. Ohne Berührung der Spitze auf andere Oberflächen, stecken Sie ihn in den Mund und Tupfer der Choanen Eröffnung auf dem Dach des Mundes und weiter zurück in Richtung des Mund-Rachen-oder Halsbereich
4. Legen Sie die Tupferspitze direkt in das virale Transport Media Durchstechflasche. Drehen Sie den Tupfer Welle zwischen Daumen und Zeigefinger, während der Tupfer wird in den Medien. Wie oben erwähnt, ein Assistent ziehen die Spitze des Tupfers wieder aus dem Boden des Fläschchens ~ 1 cm und schneiden die Welle der Tupfer mit einer Schere so die Tupferspitze bleibt in der Flasche und die Welle nicht mit Kappe stören Schließung. Cap Röhrchen fest. Desinfizieren Sie die Schere mit Alkohol zwischen Schneiden Tupfer Wellen.
5. Legen Sie die Flaschen in einem Gefrierschrank Box mit Trockeneis oder Kühlakkus.

4. Vogel Handhabung und Release

1. Zurück Vogel auf der Website von Erfassung und Freigabe rechtzeitig (<20 Minuten). Hundeführer müssen sich bewusst sein, die Grundsätze des Tierschutzes und der Hut sein auf Anzeichen von Vogel leidet während der Probenahme (dh Abschürfungen, erfassen Myopathie und Hypo-oder Hyperthermie). Ein Erste-Hilfe-Kit sollte in der Liste der Geräte aufgenommen werden.

5. Prüfeinrichtungen

1. Die Proben können in jeder umschlossene Raum, wie ein Forschungs-Wohnwagen oder Zelt getestet werden, mit einer Stromversorgung (Spannung-regulierten Strom-Generator), die PCR-Einheit und die angeschlossenen Computer ausgeführt werden.

6. RNA-Extraktion

1. RNA-Extraktion wurde mit dem RNeasy Mini Kit mit geringfügigen Änderungen zu den Anweisungen des Herstellers folgende Spackman et al. ¹
2. Vortex den Tupfer Medium für 3-5 s und übertragen 350 ul einer 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Bewahren Rest Probe auf Eis bei PCR-positiven Proben nachgesiebt oder H5 Test muss ausgeführt werden müssen.
3. Add 350 ul RLT-Puffer (mit β-me) und Vortex für 5 s.
4. Add 350 ul RNA grade 70% Ethanol.
5. Zentrifuge bei 5.000 xg für 5 min.
6. Add 600 ul des Überstandes auf eine Spin-Säule in ein 2 ml Sammel-Tube gestellt. Bewahren Sie die verbleibende Probe in Reagenzglas-Rack.
7. Zentrifuge für 20 s bei 10.000 xg und entsorgen Durchströmung.
8. Wiederholen Sie die Schritte 17-18, bis alle die Probe durch Spin-Säule verabschiedet worden.
9. Ort Spin-Säule in ein sauberes 2 ml Sammel-Tube.
10. Add 700 ul RW1 Puffer in die Spin-Säule und zentrifugieren 25 s bei 10.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
11. Add 500 ul RPE Puffer, um die Spin-Säule und zentrifugieren Sie für 25 s bei 10.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
12. Wiederholen Sie Schritt 22 für insgesamt zwei Waschgänge mit RPE-Puffer.
13. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule für eine weitere 2 Minuten bei 14.000 x g. Discard Sammelrohr.
14. Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 50 ul Nuklease-freies Wasser. Inkubieren bei Raumtemperatur für 60 s.
15. Eluieren RNA durch Spinnen für 60 s bei 10.000 xgfoder 60 s. Legen gereinigte Probe auf Eis.

7. Vorbereitung negativen Kontrollen

1. Lyophilisierte Reagenzien wurden für den Einsatz in der PCR-Assay gemäß den Anweisungen des Idaho Technologies lyophilisierte Reagenz Detection Kit für TaqMan Sonden Influenza A Target 1 (Asay-ASY-0109) vorbereitet.
2. Centrifuge negativen Kontrollreagenz Fläschchen (rot) für 3 s, um sicherzustellen, Pellets sind an der Unterseite.
3. Kappe abnehmen, optisch stellen Sie sicher, Pellets sind an der Unterseite.
4. Fügen Sie 20 ul 2 X Rekonstitutionspuffer und 20 ul Reinstwasser.
5. Recap und Vortex für 5 s bei maximaler Geschwindigkeit.
6. Zentrifuge für 3 s, um Flüssigkeit zu Boden des Fläschchens.
7. Sichtprüfung der Pellet wurde rehydriert, wenn nicht wiederholen Sie die Schritte 31-32.
8. Pipette 19 ul der hydratisierten Mischung in einem LightCycler Kapillare, wiederholen Pipette Schritt in eine zweite Kapillare, um ein Duplikat zu erhalten.

8. Vorbereitung Proben

1. Centrifuge die unbekannten Reagenz Fläschchen (blau) für 3 Sekunden, um sicherzustellen, Pellets sind an der Unterseite.
2. Kappe abnehmen, optisch stellen Sie sicher, Pellets sind an der Unterseite.
3. Add 40 ul gereinigte RNA.
4. Recap und Vortex für 5 s bei maximaler Geschwindigkeit.
5. Zentrifuge für 3 s, um Flüssigkeit zu Boden des Fläschchens.
6. Sichtprüfung der Pellet wurde rehydriert, wenn nicht wiederholen Sie die Schritte 38-39.
7. Pipette 19 ul der hydratisierten Mischung in einem LightCycler Kapillare, wiederholen Pipette Schritt in eine zweite Kapillare, um ein Duplikat zu erhalten.

9. Vorbereitung positive Kontrollen

1. Centrifuge die positive Kontrolle Reagenz Fläschchen (grün) für 3 s, um sicherzustellen, Pellets sind an der Unterseite.
2. Kappe abnehmen, optisch stellen Sie sicher, Pellets sind an der Unterseite.
3. Fügen Sie 20 ul 2 X Rekonstitutionspuffer und 20 ul Reinstwasser.
4. Recap und Vortex für 5 s bei maximaler Geschwindigkeit.
5. Zentrifuge für 3 s, um Flüssigkeit zu Boden des Fläschchens.
6. Sichtprüfung der Pellet wurde rehydriert, wenn nicht wiederholen Sie die Schritte 45-46.
7. Pipette 19 ul der hydratisierten Mischung in einem LightCycler Kapillare, wiederholen Pipette Schritt in eine zweite Kapillare, um ein Duplikat zu erhalten.

10. Zentrifugieren der Kapillaren

1. Sobald alle Kapillaren für die Batch hergestellt worden laden sie in die Mini-Zentrifuge mit Kapillar-Adaptern ausgestattet.
2. Zentrifuge bei der niedrigsten Einstellung, indem Sie den Puls Taste für 1 s. Diese Transfers Flüssigkeit auf den Boden in der Vorbereitung für die Prüfung.

11. Die Bedienung des RAPID

1. Erstellen einer neuen Datei. Label positive Kontrolle, Negativ-Kontrolle und Proben (durch ihre ID-Nummer).
2. Programm 1: RNA-Probenvorbereitung Halten
   1. Cycles = 1
   2. Analyse-Modus = None
   3. Target Temperature = 40
   4. Incubation Time = 30 min
   5. Temperature Transition Rate = 20 ° C / s (Standard)
   6. Sekundäre Temperatur Target = 0 (Standard)
   7. Step Size = 0 (Standard)
   8. Step Delay = 0 (Standard)
   9. Acquisition Mode = None (Standard)
3. Programm 2: RNA Denaturierung
   1. Cycles = 1
   2. Analyse-Modus = None
   3. Target Temperature = 94
   4. Inkubationszeit = 120s
   5. Temperature Transition Rate = 20 ° C / s (Standard)
   6. Sekundäre Temperatur Target = 0 (Standard)
   7. Step Size = 0 (Standard)
   8. Step Delay = 0 (Standard)
   9. Acquisition Mode = None (Standard)
4. Programm 3: RNA-Amplifikation
   1. Cycles = 45
   2. Analysis Mode = Auto Analysis
   3. Soll-Temperatur, Segment 1 = 94; Segment 2 = 60
   4. Inkubationszeit, Segment 1 = 0 s, Segment 2 = 20 s
   5. Temperature Transition Rate, Seg 1 & 2 = 20 ° C / s (Standard)
   6. Sekundäre Temperatur Target, Seg 1 & 2 = 0 (Standard)
   7. Step Size, Seg 1 & 2 = 0 (Standard)
   8. Step Delay, Seg 1 & 2 = 0 (Standard)
   9. Acquisition Mode, Segment 1 = keine; Segment 2 = single
5. Fluoreszenz-Parameter
   1. Anzeige Modus: Fluoreszenz-Kanal 2 (Kanal 2 / 1)
      Gewinne:
      1. Ch 1 (F1) = 1
      2. Ch 2 (F2) = 8
      3. CH 3 (F3) = 1
   2. Zur Anzeige der Echtzeit-Fluoreszenz-Daten für jede Probe, wählen Sie die Probe und klicken Sie auf den "Show Graph"-Button am unteren Rand des Bildschirms
6. Für jede Kapillare, die Ergebnisse wie folgt:
   • # - Identifiziert das Karussell Position des Karussells
   • Sample name - gibt den Namen der Probe
   • Control - indentifies der Art der Probe für jede Probe
   • Score - errechnet das Verhältnis zwischen der Probe Fluoreszenz und das Niveau der Hintergrundfluoreszenz in der Probe
   • Ergebnis - zeigt das Gesamtergebnis für die Probe

12. Repräsentative Ergebnisse:

Mögliche Ergebnisse sind:
Present: A red 'anwesend' Forderung nach einem Test / unbekannten Probe zeigt, dass das Ziel in dieser Probe wurde identifiziert und die Kontrollen waren erfolgreich.
Nicht erkannt: Ein grünes "nicht erkannt" Forderung nach einem Test / unbekannten Probe zeigt, dass das Ziel nicht in die Probe identifiziert und der Test steuert erfolgreich waren.
Bitte wiederholen: A 'bitte wiederholen "bedeutet, dass die positive oder negative Kontrolle versagt.

Ein Beispiel für eine erfolgreiche Analyse durch die RAPID 7200 ist in Abbildung 4 dargestellt. Die positive Kontrolle wird verstärkt und erzeugt nachweisbare Fluoreszenz (y-Achse) bei etwa 25 Zyklen (x-Achse). Ein Zyklus Schwelle (CT)> 35 ist die vereinbarte cut-off für die meisten AIV Referenzlaboratorien. Deshalb produziert die positive Kontrollen für diese Methode ein Fluoreszenz-Signal innerhalb der zulässigen Anzahl von Zyklen (0-35) für AIV-Erkennung. Im Gegensatz dazu wird die Negativ-Kontrolle nicht zu einer Fluoreszenz-Signal auch nach 45 Zyklen. Ebenso haben die zwölf Proben aus dem westlichen Strandläufer gesammelten nicht erzeugen ein Fluoreszenzsignal darauf hinweist, dass die Vögel negativ waren für AIV. Follow-up Tests aller positiven Proben in einem traditionellen Labor wird aufgefordert, sicherzustellen, dass keine False Positives irrtümlich produziert werden.

Abbildung 1. Shorebird Capture mit Fangnetze.

Abbildung 2. Sammlung von Kloake und oropharyngealen Proben von mindestens Strandläufer.

Abbildung 3. Programmierung der RAPID 7200 für RNA-Amplifikation.

Abbildung 4. Fluorogram erzeugt durch die RAPID 7200 portable rRT-PCR zeigen, wie positive und negative Kontrollen sollten in einem erfolgreichen Test erscheinen. Klicken Sie hier, um die volle Größe Bild in

Die Methode der schnellen Diagnose hier vorgestellten erleichtert zeiteffizient und genaue Prüfung von Wildvögeln Proben für die Überwachung von AIV. Die viel weniger strenge Probe Storage-Anforderungen von tragbaren rRT-PCR eignen sich für Situationen, in denen Remote-Wartung einer Kühlkette unpraktisch sein kann, wenn flüssigem Stickstoff Verlader oder Trockeneis ist nicht verfügbar. Darüber hinaus fanden wir, dass die Probenanalyse mit gefriergetrockneten Reagenzien war einfach genug, um von Feldbiologen mit minimalen Kenntnissen von Labor-basierte molekulare Analyse durchgeführt werden. Die Technik wurde zeit-und auch kostengünstiger. Mit einem Operator, war es möglich, drei Chargen laufen, was in 42 Vorführungen für AIV jeden Tag in einem Feld Einstellung. Wir festgestellt, dass alle benötigten Materialien zu diesem System laufen zu jedem beliebigen Ort und die Methode könnte an einen Betreiber im Laufe des Tages unterrichtet werden könnten erhoben werden. Der limitierende Faktor in abgelegenen Gebiet Situationen ist die Stromversorgung benötigt, um die tragbaren rRT-PCR-Einheit und die angeschlossenen Computer ausführen, aber diese kann durch die Verwendung einer Spannung reguliert tragbaren Stromgenerator gemildert werden. Darüber hinaus Sequenzierung der extrahierten RNA oder der ursprünglichen Probe ist nur möglich in Fällen, in denen Kühlkette vorübergehend bis zur Übergabe an ein Labor gehalten werden kann.

Unsere bisherigen Analysen zeigten, dass die tragbare rRT-PCR-Einheit identisch Spezifität (100%) und vergleichbare Sensitivität (98%) zur Virusisolierung in einem Labor Einst.2 durchgeführt hatte. Vorherige Validierungsstudien haben gezeigt, dass falsch negative Ergebnisse der häufigste Fehler mit rRT-PCR, weil das große Potenzial für unsachgemäße Probenvorbereitung, die Anwesenheit von PCR-Inhibitoren in Fäkalien oder Abbau der lyophilisierte Reagenz bead ^1,3-4 sind. Ein weiterer Nachteil dieser Technik ist die Empfindlichkeit der lyophilisierten Reagenzien im Hinblick auf die neu entstehenden Stämme von AIV. Das Virus ist in einem ständigen Zustand der genomischen Umschichtung, wo Gastgeber überlappen, eine Hypothese durch zahlreiche phylogenetische Studien ^5-8 unterstützt. Daher Primer und Sonden für den Einsatz mit tragbaren rRT-PCR ausgestellt erfordern eine ständige Re-Validierung. Zum Beispiel sind Reagenzien spezifisch für amerikanische und eurasische Linien der Subtypen H5 und H7 jetzt empfohlen, da die Divergenz des Virus nach biogeografischen Region ^9. Wie bei allen anderen Feldtest Verdacht HPAIV Positiven sollte zu einer genehmigten Anlage zur endgültigen Bestätigung Tests mit VI für höchste Spezifität und Sensitivität ¹⁰ transportiert werden.

Zusammenfassend zeigte diese Studie, dass tragbare rRT-PCR geeignet ist für den Zweck des Screenings cloacal Proben von Wildvögeln für AIV in Nicht-Labor-Einstellungen. Der primäre Vorteil dieser Technik ist die Diagnose von Wildvögeln zu beschleunigen, die Erhöhung der Chancen der mit einem Ausbruch in einem entfernten Standort mit einem schnelleren Reaktionszeit. Tragbare rRT-PCR stellt auch ein Durchbruch für die Forscher, dass die Rolle der Wildvögel bei der Verbreitung von AIV zu entwirren versuchen. Die Fähigkeit, Host-Status zum Zeitpunkt der Probenahme zu diagnostizieren macht es möglich, biologische Informationen zu sammeln, um wichtige Fragen zu immunologischen und physiologischen Reaktionen ¹¹ bis Infektionen oder genetische Merkmale mit natürlichen Resistenz bei Wildvögeln ¹² zugeordnet Adresse. Darüber hinaus würde den Einsatz kostspieliger Satellitensendern auf bestätigte Gastgeber, um ihre Bewegungen zu verfolgen unschätzbarem Wert für die Identifizierung der Arten dienen als Langstrecken-Carrier der AIV sowie die Beurteilung ihrer wandernden Leistung, Lebensraum Vorlieben und Ebenen der Interaktion mit Geflügel. Künftige operationelle Tests in den Bereichen von internationalem Belang für HPAIV, wie Zentral-und Südasien ^13, wäre abschließend zu bestimmen, wie schnell rRT-PCR-Einheiten unter Ausbruch Szenarien durchzuführen, wenn die Diagnose einer großen Zahl der positiven Proben ist zeitkritisch.

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir möchten M. Scullion und R. Crisp of Idaho Technologies für den technischen Support und der USGS westlichen Ecological Research Center für die Finanzierung (S. Schwarzbach) und Hilfe (K. Spragens, T. Graham) zu danken. Institut für Verteidigung und Homeland Security (www.idhs.org), zur Unterstützung des Department of Defense und Air Force Research Laboratory - Diese Arbeit wurde unter der Schirmherrschaft des Zentrums für Innovative Technology durchgeführt. Behandlung der Tiere folgten Protokolle durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss des US Geological Survey westlichen Ecological Research Center und erlaubt der US Geological Survey Vogel Banding Laboratory genehmigt. Jegliche Nutzung des Handels-, Produkt-oder Firmennamen in dieser Publikation ist lediglich für beschreibende Zwecke und nicht die Billigung durch die US-Regierung.