El diagnóstico rápido del virus de la influenza aviar en aves silvestres: El uso de un portátil de RT-PCR y reactivos liofilizados en el campo

Este estudio describe el diagnóstico de la gripe aviar en aves silvestres con un portátil de RT-PCR sistema. El método tiene la ventaja de liofilizado reactivos para detectar las aves silvestres en un entorno ajeno al laboratorio, propio de un escenario de brote. Uso de herramientas moleculares ofrece alternativas precisas y sensibles para el diagnóstico rápido.

Las aves silvestres han sido implicados en la propagación de la influenza aviar altamente patógena (IAAP) del subtipo H5N1, lo que provocó la vigilancia a lo largo de las rutas migratorias. El muestreo de aves silvestres para el virus de la gripe aviar (AIV) se realiza a menudo en regiones remotas, pero los resultados son a menudo se retrasa debido a la necesidad de transportar las muestras a un laboratorio equipado para las pruebas moleculares. En tiempo real de la transcriptasa inversa reacción de polimerasa en cadena (RT-PCR) es una técnica molecular que ofrece uno de los métodos más precisos y sensibles para el diagnóstico de la AIV. Los protocolos de laboratorio previamente estrictamente necesario para la RT-PCR se están adaptando para el campo. El desarrollo de reactivos liofilizados (liofilizado) que no requieren cadena de frío, con una sensibilidad a nivel de los reactivos húmedos ha llevado a pruebas en el lugar remoto a un objetivo práctico.

Aquí presentamos un método para el diagnóstico rápido de la AIV en aves silvestres con una unidad de RT-PCR (Ruggedized avanzada de dispositivos de identificación de patógenos o rápida, las tecnologías de Idaho, Salt Lake City, UT), que cuenta con los reactivos liofilizados (Influenza A Meta 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Tecnologías de Idaho). Los reactivos contienen todos los componentes necesarios para las pruebas en las concentraciones adecuadas en un solo tubo: primers, sondas, las enzimas, los tampones y los controles internos positivos, eliminando los errores asociados con el almacenamiento o manejo inadecuado de los reactivos mojado. La unidad portátil realiza una pantalla para la gripe A por objetivo el gen de la matriz y los resultados de los rendimientos en 2-3 horas. Subtipos genéticos también es posible con imprimación H5 y H7, establece que se dirigen al gen de la hemaglutinina.

El sistema es adecuado para su uso en muestras cloacales y orofaríngeos procedentes de aves silvestres, como se ha demostrado aquí en el especies de aves playeras migratorias, el playero occidental (Calidrus mauri) capturados en el norte de California. Manejo de los animales siguieron los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo de los EE.UU. Geological Survey Centro Occidental de Investigación Ecológica y los permisos de las Aves Servicio Geológico de EE.UU. Laboratorio de Anillamiento. La principal ventaja de esta técnica es acelerar el diagnóstico de las aves silvestres, lo que aumenta las posibilidades de contener un brote en una ubicación remota. Sobre el terreno diagnóstico también podrían ser útiles para la identificación y estudio de las personas infectadas en las poblaciones silvestres. La oportunidad de recoger información sobre la biología de acogida (la respuesta inmunológica y fisiológica a la infección) y la ecología espacial (el rendimiento de las aves migratorias infectadas) se proporciona una visión de la medida en que las aves silvestres pueden actuar como vectores para AIV a largas distancias.

1. La captura de aves silvestres con redes de niebla

1. Para la captura de aves playeras, establecer redes de niebla en un sitio activo alimentación como un pantano, del litoral o de barro plana.
2. Deslice la línea de trasmallo bucles de un extremo de la red de niebla alrededor del poste y poste de inserción vertical en el barro.
3. Extiende la red, inserte el segundo polo a través de lazos de trasmallo en el otro extremo de la red de niebla y verticalmente insertar pole en el barro, asegurándose de que las líneas de trasmallo se les enseña.
4. Una vez que el pájaro es capturado, el extracto de las aves de la red y volver a la estación de anillamiento.

2. Hisopos cloacales de muestreo

1. Recoger hisopos cloacales inmediatamente después de la captura
2. Localizar la cloaca y el uso de los dedos para hacer retroceder a las plumas de los alrededores
3. Separar un Dacron o estériles de poliéster hisopo, madre primer extremo, y humedecer la punta estéril con medio de transporte viral para una mayor facilidad en el hisopado. Después de humedecer, toda la cabeza del hisopo es insertado en la cloaca. Limpie la circunferencia interior de la cloaca girando lentamente el hisopo y retire el hisopo de cloaca.
4. La inserción de la punta del hisopo directamente en el vial de la muestra de transporte viral medios de comunicación; girar el hisopo entre el pulgar y el índice mientras el aplicador está en los medios de comunicación. Tener un asistente de completar el procedimiento tirando de la punta de la espalda hisopo de la parte inferior del vial aproximadamente 1 cm y cortar el eje del hisopo con un par de tijeras para que la punta del hisopo se queda en el vial y el eje no interfiere con tapa de cierre. Tapón del vial con fuerza. Desinfectar las tijeras con alcohol en el corte entre los ejes hisopo.
5. Colocar los frascos en una caja de congelador que contienen hielo seco o hielo.

3. Orofaríngea técnica de hisopo

1. Abra cuidadosamente el pico del pájaro, de modo que la ranura de coanas es visible
2. Separar un hisopo limpio del paquete, el tallo primero, y humedecer la punta con los medios de transporte viral para una mayor facilidad en el hisopado
3. Sin tocar la punta a cualquier otras superficies, se insertan en la boca y el hisopo de la apertura de coanas en el techo de la boca y volver de nuevo hacia la región orofaríngea o la garganta
4. Coloque la punta del hisopo directamente en el transporte viral vial medios de comunicación. Gire el hisopo entre el pulgar y el índice mientras el aplicador está en los medios de comunicación. Como el anterior, tiene un asistente tirar de la punta de la parte de atrás hisopo de la parte inferior del vial aproximadamente 1 cm y cortar el eje de la esponja con un par de tijeras para que la punta del hisopo se queda en el vial y el eje no interfiera con la tapa cierre. Tapón del vial con fuerza. Desinfectar las tijeras con alcohol en el corte entre los ejes hisopo.
5. Colocar los frascos en una caja que contiene el congelador hielo seco o hielo.

4. Manipulación y la liberación de aves

1. Retorno de aves en el lugar de captura y liberación en el momento oportuno (<20 minutos). Manipuladores deben ser conscientes de los principios de bienestar animal y estar alerta para detectar signos de sufrimiento durante el muestreo de aves (abrasiones, es decir, la captura de miopatía e hipo o hipertermia). Un botiquín de primeros auxilios deben ser incluidos en la lista de equipo.

5. Instalaciones de prueba

1. Las muestras se pueden probar en cualquier espacio cerrado, como un remolque de investigación o tienda de campaña, con una fuente de alimentación (voltaje regulado generador de energía) para ejecutar la unidad de PCR y el ordenador conectado.

6. La extracción de RNA

1. Extracción de RNA se realizó con el kit RNeasy Mini con modificaciones menores a las instrucciones del fabricante después de Spackman et al ^1.
2. Vortex el hisopo medio de 5.3 s, y la transferencia de 350 l con un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Nota: Mantenga la muestra restante en el hielo en el caso de PCR muestras positivas deben ser controlados de nuevo o probar H5 necesita ser ejecutado.
3. Añadir 350 l de tampón RLT (con β-me) y agitar durante 5 s.
4. Añadir 350 l de ARN grado de etanol al 70%.
5. Se centrifuga a 5.000 g durante 5 min.
6. Añadir 600 l del sobrenadante a una columna de centrifugación en un tubo de recogida de 2 ml. Conservar el resto de la muestra en el bastidor de tubo de ensayo.
7. Centrifugar durante 20 s a 10.000 xg y descartar el filtrado.
8. Repita los pasos 17-18 hasta que la muestra ha sido pasado a través de spin columna.
9. Lugar spin columna en un tubo de recogida limpio de 2 ml.
10. Añadir 700 l de buffer RW1 a la columna de centrifugación y centrifugar 25 s de 10.000 x g. Deseche el flujo continuo.
11. Añadir 500 l buffer RPE a la columna de centrifugación y centrifugar durante 25 s de 10.000 x g. Deseche el flujo continuo.
12. Repita el paso 22 para un total de dos lavados con buffer RPE.
13. Centrifugar la columna de centrifugación durante 2 minutos a 14.000 x g. Deseche el tubo de recogida.
14. Colocar la columna de giro en un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 ml y añadir 50μl de agua libre de nucleasa. Incubar a temperatura ambiente durante 60 s.
15. Eluyen ARN girando durante 60 s de 10.000 xgfo 60 s. Lugar purificado de la muestra en hielo.

7. Preparación de los controles negativos

1. Reactivos liofilizados fueron preparados para su utilización en el ensayo de PCR de acuerdo a las instrucciones de las Tecnologías de Idaho liofilizado kit de detección de reactivos para la gripe sondas TaqMan Un objetivo 1 (Asay-ASY-0109).
2. Centrífuga vial reactivo de control negativo (rojo) durante 3 s para asegurar pellets se encuentran en la parte inferior.
3. Quite la tapa, visualmente hacer bolitas que están en el fondo.
4. Añadir 20 l de tampón de reconstitución X 2 y 20 l de agua de grado reactivo.
5. Recapitulación y agitar durante 5 s en velocidad máxima.
6. Centrifugar durante 3 s para llevar líquido a la parte inferior del vial.
7. Compruebe visualmente el pellet se rehidrata, si no, repita los pasos 31-32.
8. Pipeta 19 ul de la mezcla hidratada en un tubo capilar LightCycler, repita el paso a una segunda pipeta capilar para obtener un duplicado.

8. Preparación de muestras de ensayo

1. Centrifugar el vial desconocido (azul) durante 3 segundos para asegurarse de pellets se encuentran en la parte inferior.
2. Quite la tapa, visualmente hacer bolitas que están en el fondo.
3. Añadir 40 ml de ARN purificado.
4. Recapitulación y agitar durante 5 s en velocidad máxima.
5. Centrifugar durante 3 s para llevar líquido a la parte inferior del vial.
6. Compruebe visualmente el pellet se rehidrata, si no, repita los pasos 38-39.
7. Pipeta de 19 l de mezcla hidratada en un tubo capilar LightCycler, repita el paso a una segunda pipeta capilar para obtener un duplicado.

9. Preparación de controles positivos

1. Centrifugar el vial de control reactivo positivo (verde) durante 3 s para asegurarse de pellets se encuentran en la parte inferior.
2. Quite la tapa, visualmente hacer bolitas que están en el fondo.
3. Añadir 20 l de tampón de reconstitución X 2 y 20 l de agua de grado reactivo.
4. Recapitulación y agitar durante 5 s en velocidad máxima.
5. Centrifugar durante 3 s para llevar líquido a la parte inferior del vial.
6. Compruebe visualmente el pellet se rehidrata, si no, repita los pasos 45-46.
7. Pipeta 19 ul de la mezcla hidratada en un tubo capilar LightCycler, repita el paso a una segunda pipeta capilar para obtener un duplicado.

10. Centrifugar los tubos capilares

1. Una vez que todos los tubos capilares para el lote ha sido preparado cargarlos en el mini-centrifugadora equipados con adaptadores capilar.
2. Centrifugadoras en el nivel más bajo manteniendo pulsado el botón de pulso durante 1 s. Esta transferencia de líquido hacia el fondo en la preparación para la prueba.

11. Funcionamiento del RAPID

1. Crear un nuevo archivo. Etiqueta de control positivo, control negativo, y las muestras (por su número de identificación).
2. Programa 1: Ejemplo de ARN Mantenga Preparación
   1. Ciclos = 1
   2. Modo de análisis = None
   3. Temperatura objetivo = 40
   4. El tiempo de incubación = 30 min
   5. Temperatura de la tasa de transición = 20 ° C / s (por defecto)
   6. Objetivo secundario de temperatura = 0 (por defecto)
   7. Tamaño de paso = 0 (por defecto)
   8. Retardo de paso = 0 (por defecto)
   9. Modo de adquisición = None (por defecto)
3. Programa 2: desnaturalización del ARN
   1. Ciclos = 1
   2. Modo de análisis = None
   3. Temperatura objetivo = 94
   4. El tiempo de incubación = 120s
   5. Temperatura de la tasa de transición = 20 ° C / s (por defecto)
   6. Objetivo secundario de temperatura = 0 (por defecto)
   7. Tamaño de paso = 0 (por defecto)
   8. Retardo de paso = 0 (por defecto)
   9. Modo de adquisición = None (por defecto)
4. Programa 3: Amplificación del ARN
   1. Ciclos = 45
   2. Modo de análisis = Auto Análisis
   3. Temperatura de destino, Segmento 1 = 94, Segmento 2 = 60
   4. El tiempo de incubación, Segmento 1 = 0 s, Segmento 2 = 20 s
   5. Temperatura de la tasa de transición, Seg 1 y 2 = 20 ° C / s (por defecto)
   6. Temperatura de destino secundario, Seg 1 y 2 = 0 (por defecto)
   7. Tamaño de paso, Seg 1 y 2 = 0 (por defecto)
   8. Retardo de paso, Seg 1 y 2 = 0 (por defecto)
   9. Modo de adquisición, Segmento 1 = Ninguno, Segmento 2 = solo
5. Los parámetros de fluorescencia
   1. Presentación: canal de fluorescencia 2 (CH2 / 1)
      Ganancias:
      1. Ch 1 (F1) = 1
      2. Ch 2 (F2) = 8
      3. CH 3 (F3) = 1
   2. Para visualizar los datos de fluorescencia en tiempo real para cada muestra, seleccionar la muestra de interés y haga clic en el botón "Mostrar gráfico" en la parte inferior de la pantalla
6. Para cada capilar, los resultados son los siguientes:
   • # - Identifica la posición del carrusel del carrusel
   • Nombre de la muestra - proporciona el nombre de la muestra
   • Control - identifica el tipo de muestra para cada muestra
   • Score - calcula utilizando la relación entre la fluorescencia de la muestra y el nivel de fluorescencia de fondo en la muestra
   • Resultados - muestra el resultado global de la muestra

12. Los resultados representativos:

Resultados de posibles incluyen lo siguiente:
Presente: "presente" Un rojo llamado para una prueba / muestra desconocida indica que el objetivo se identificó en la muestra y los controles fueron exitosos.
No detectado: Un verde "no detectado" llamada para una prueba / muestra desconocida indica que el objetivo no fue identificado en la muestra y la prueba de los controles tuvieron éxito.
Por favor, repita: A 'por favor, repita' indica que el control positivo o negativo no.

Un ejemplo de un análisis exitoso por el RAPID 7200 se muestra en la Figura 4. El control positivo se amplifica y se genera fluorescencia detectable (eje Y) a unos 25 ciclos (eje x). Un ciclo umbral (CT)> 35 es el límite acordado para la mayoría de los laboratorios de referencia VIA. Por lo tanto, los controles positivos de este método produce una señal fluorescente en el número de aceptación de los ciclos (0-35) para la detección de VIA. Por el contrario, el control negativo no genera una señal fluorescente, incluso después de 45 ciclos. Del mismo modo, los doce muestras recogidas en el playero occidental no generar una señal fluorescente que indica que las aves fueron negativas para la AIV. Las pruebas de control de todas las muestras positivas en un laboratorio tradicional se anima a asegurar que no los falsos positivos son erróneamente producido.

Figura 1. Aves Playeras de captura con redes de niebla.

Figura 2. Recogida de muestras cloacales y orofaríngeos de por lo menos playeros.

Figura 3. Programación de la RAPID 7200 para la amplificación del ARN.

Figura 4. Fluorogram generado por el portátil RAPID 7200 RT-PCR que muestran cómo los controles positivos y negativos que aparecen en un ensayo de éxito. Haga clic aquí para ver la imagen en tamaño completo

El método de diagnóstico rápido que aquí se presenta facilita la prueba de tiempo-eficiente y preciso de muestras de aves silvestres para la vigilancia de la AIV. Los requisitos de muestra mucho menos estrictas de almacenamiento portátil de RT-PCR son adecuadas para situaciones remotas donde el mantenimiento de la cadena de frío puede ser poco práctico, si los cargadores de nitrógeno líquido o hielo seco no está disponible. Además, encontramos que el análisis de las muestras con los reactivos liofilizados fue bastante sencillo para llevar a cabo por biólogos de campo con conocimientos mínimos de laboratorio basado en el análisis molecular. La técnica fue eficiente en tiempo y costo-efectiva. Con un operador, que era factible realizar tres lotes, lo que resulta en 42 pruebas de detección de AIV cada día en condiciones de campo. Se evaluó que todos los materiales necesarios para ejecutar este sistema podría ser llevado a cualquier lugar y la metodología se puede enseñar a un operador en el transcurso de un día. El factor limitante en situaciones de campo a distancia es la fuente de alimentación necesaria para ejecutar el portátil de RT-PCR unidad y el ordenador conectado, sin embargo, esto puede ser mitigado mediante el uso de un voltaje regulado generador portátil de energía eléctrica. Además, la secuenciación del ARN extraído la muestra original o sólo es factible en los casos en que puede ser la cadena de frío mantenerse temporalmente hasta la entrega en un laboratorio.

Nuestro análisis anterior indica que el portátil de RT-PCR unidad tenía idéntica especificidad (100%) y una sensibilidad comparable (98%) para el aislamiento del virus a cabo en un laboratorio Ajuste2. Estudios de validación previos han demostrado que los falsos negativos son el error más común con la RT-PCR, debido a las grandes posibilidades para la preparación inadecuada de la muestra, la presencia de inhibidores de la PCR en la materia fecal o la degradación de los reactivos liofilizados cordón ^1,3-4. Otro inconveniente de esta técnica es la sensibilidad de los reactivos liofilizados en vista de las cepas emergentes de la AIV. El virus se encuentra en un estado constante de reorganización genómica donde los ejércitos se superponen, una hipótesis apoyada por numerosos estudios filogenéticos ^5-8. Por lo tanto cebadores y sondas emitió para su uso con portátiles de RT-PCR requieren una constante revalidación. Por ejemplo, reactivos específicos para los americanos y euroasiáticos linajes de los subtipos H5 y H7 se recomienda actualmente, debido a la divergencia de los virus de acuerdo a la región biogeográfica ^9. Al igual que con todas las pruebas de campo otros, presuntos positivos HPAIV debe ser transportado a una instalación autorizada para la prueba de confirmación final con VI para la más alta especificidad y sensibilidad ^10.

En conclusión, este estudio demostró que los portátiles de RT-PCR es adecuado para el propósito de la revisión de muestras cloacales de aves silvestres para AIV en entornos fuera del laboratorio. La principal ventaja de esta técnica es acelerar el diagnóstico de las aves silvestres, lo que aumenta las posibilidades de contener un brote en una ubicación remota con un tiempo de respuesta más rápido. Portable RT-PCR también representa un gran avance para los investigadores que tratan de desentrañar el papel de las aves silvestres en la propagación de la AIV. La capacidad para diagnosticar el estado de acogida en el momento de la toma de muestras hace que sea posible reunir la información biológica para tratar las cuestiones clave sobre las respuestas inmunológicas y fisiológicas ¹¹ a la infección, o de características genéticas asociadas con la resistencia natural de las aves silvestres ^12. Por otra parte, el despliegue de costosos transmisores de satélite en los hosts confirmó el seguimiento de sus movimientos serían de gran utilidad para la identificación de las especies que actúan como portadores de larga distancia de la AIV, así como la evaluación de su desempeño migratorias, las preferencias de hábitat y niveles de interacción con aves de corral. Futuras pruebas de funcionamiento en las áreas de interés internacional para HPAIV, como Centro y Sur de Asia ^13, de manera concluyente que determine la forma rápida RT-PCR unidades realizan en caso de un brote cuando el diagnóstico de un gran número de muestras positivas es de tiempo crítico.

No hay conflictos de interés declarado.

Deseamos agradecer a M. y R. Scullion Crujiente de las Tecnologías de Idaho para el apoyo técnico y el USGS Western Centro de Investigaciones Ecológicas de financiación (S. Schwarzbach) y asistencia (K. Spragens, T. Graham). Esta investigación se realizó bajo los auspicios del Centro para la Innovación Tecnológica - Instituto para la Defensa y Seguridad Nacional (www.idhs.org), en apoyo del Departamento de Defensa y la Fuerza Aérea Laboratorio de Investigación. Manejo de los animales siguieron los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo de los EE.UU. Geological Survey Centro Occidental de Investigación Ecológica y los permisos de las Aves Servicio Geológico de EE.UU. Laboratorio de Anillamiento. Cualquier uso de nombres comerciales, productos, o de una empresa en esta publicación es sólo con fines descriptivos y no implica reconocimiento alguno por parte del gobierno de EE.UU..