Анализ кальция Биолюминесценция для функционального анализа Mosquito ( Aedes aegypti) И Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G-белком рецепторы

Этот протокол содержит инструкции по клональной-клеточной селекции линии и анализа биолюминесценции кальция для анализа структуры и активности синтезированных членистоногих нейропептидов на их родственные GPCRs. Этот анализ может быть использован для deorphanization рецепторов и структура-активность для исследования отношения синтетический аналог дизайн и пептид / наркотиков привести открытие.

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.

The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.

This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

1. Создание стабильных клеточных линий

1. Клонировать ваши GPCR интересов и вставьте его в вектор экспрессии включающий 5 'Козак консенсусной последовательности (GCCA / GCCATGG) вокруг стартовый кодон для оптимального связывания рибосом в системе млекопитающих (Козак, 1986). Здесь мы используем плазмиды pcDNA3.1/Bm-KR за тик кининовой рецепторов, и плазмиды pcDNA3.1/Aedae-KR для комаров рецепторов кининовой (Holmes и др., 2003;. Pietrantonio и др., 2005.). PcDNA3.1 (-) вектор кодирует ампициллину отбора у бактерий и неомицин (G418) сопротивления для выбора в клетках млекопитающих.
2. Расти СНО-К1 пустых ячеек (без плазмид) (АТСС, Манассас, Вирджиния, США) или другую нужную линию клеток в Т-25 колбе (BD Falcon) при 37 ° С в 5% СО ₂ инкубатора увлажненный (Holmes и др. ., 2003). Все дальнейшие инкубации должно быть сделано в этих условиях, если не указано иное. Поддерживать пустых ячеек в ростовой среде (F12K среде с 10% эмбриональной телячьей сыворотки) с 1X противогрибковым антибиотикам (Invitrogen, Калифорния).
3. Чтобы разделить клетки, разогреть все решения до 37 ° C. Удалить старые среды в Т-25 колбы и промыть 5 мл PBS, а затем удалить PBS. Для trypsinize клетки, добавьте 2 мл PBS-Трипсин-EDTA (34 мл PBS, 2 мл 7,5% бикарбоната натрия, 4 мл 10X трипсина-EDTA) в течение 2 мин. Добавьте 3 мл среды и аспирации среду вверх и вниз, смешать клетки. Передача среды с клетками в конической трубе и центрифуги в течение 2 мин при температуре ~ 200-300 г (1.000 оборотов в минуту). Удалите супернатант и вновь приостановить клетки в 5 мл среды. Развести ресуспендировали клетки концентрации 1:05 или 1:10 свежей средой и передачи 5 мл в новые Т-25 колбу.
4. После клетки растут здоровыми (около 2-3 дней), семян CHO-K1 клеток в Т-25 колб культуре ткани и выращивать их на ночь в ростовой среде без антибиотиков, пока они примерно на 30% сливной (примерно 18 часов). Степень слияния может быть определена путем наблюдения клеток под перевернутой флуоресцентной микроскопии.
5. Подготовка следующей смеси для каждого образца:
   1. Комбинат 1-2 мкг ДНК (например: использование 4μl из 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) с 100 мкл Opti-MEM я уменьшил сыворотки Средняя (Invitrogen).
   2. Смешать 6 мкл реагента липофектина (InvitrogenTM) в 100 мкл F12K бессывороточной среде, что делает соотношении 1:1 из липофектина с ДНК. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30-45 мин.
   Аккуратно перемешайте решений от 1.5.1 с 1.5.2 по каплям моды (общий объем = 200 мкл). Дайте постоять при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
6. Удалите старый средний рост из клеток и промыть клетки с 5 мл F12K бессывороточной среде, а затем удалить F12K бессывороточной среды. В 15 мл трубки, осторожно перемешать трансфекции смесь в 1,8 мл свежей среды F12K в каплям моды. Затем, промывают клетки с шага 1.5 с PBS и добавить это новое решение для трансфекции клеток. Инкубируйте в течение 18 часов.
7. Изменение средних F12K средний плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки без антибиотиков и инкубировать в течение ночи. Разделение на две клетки Т-25 колб с F12K средний плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки без антибиотиков еще на 18 часов (для разделения клетки см. шаг 1.3).
8. Замените среду с селективной средой (F12K средний плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки с 800μg/ml генетицину, Invitrogen). Культуры клеток с использованием селективной среде в течение 3-4 недель. Со временем это будет выбрать для клеток, которые стабильно включены плазмиды в их геномной ДНК. Дальнейшая поддержка клеток с использованием обслуживание среды (F12K средний плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки с 400μg/ml генетицину). Периодически замораживания клеточных линий с соотношением 1:1 замораживания средств массовой информации (селективной среде с 20% ДМСО), чтобы предотвратить потери в случае неожиданного загрязнения.
9. Выбор клональных клеточных линий: в качестве первого шага, trypsinize и центрифуги клетки шагом 1,8 с обеспечением среде, как в шаге 1.3. Повторное приостановить клеток в 5 средних обслуживание мл, принимать по 0,5 мл ячейки приостановить и добавить 4,5 мл свежей среды, техническое обслуживание, чтобы сделать 10-кратным разбавлением. Трансфер 10-кратным разбавлением на 12 лунки 96-луночного планшета, добавив 100 мкл в каждую лунку, чтобы выбрать для одиночных клеток.
10. Продолжайте делать 10x серийные разведения этих клеток для теоретического окончательное приостановление одной клетки на 100 мкл (как правило, конечное разведение будет находиться в диапазоне от 10 ^-11 до 10 ^-19; общее количество 10x серийные разведения составляет ^~ 19) . Сразу же после каждого разбавления, передача 100 мкл разведения на 12 скважинах 96 ячейках. После 18 часов инкубации, соблюдать 96-луночных под перевернутой света флуоресценции или скважин микроскопом и отметить, что по всей видимости, содержать только одну ячейку или содержать две клетки, которые, очевидно, разделились из одной единственной клетки. Продолжайте наблюдение каждый день, и изменение среды каждые три дня.
11. Когда скважин на 80% confluЛОР (около недели), промыть отмечен скважин с 200 мкл PBS и trypsinize их с 100 мкл PBS-трипсина-EDTA решение. Передача клетки от каждого отмечен также в одну лунку 6-луночный планшет с 1 средний обслуживание мл. Вырастить эти клетки в течение 3 дней, после чего передача клеток в отдельных T25 колбу. Проверьте эти клетки, используя анализ кальция биолюминесценции с агонистом пептидов (см. раздел 2).
12. Выберите один из клеточной линии шагом 1,11 с самым высоким ответ в пластине анализа биолюминесценции кальция и выполнять во второй раз одну ячейку выбор следующие шаги 1.9-1.11. Периодически замораживания клеточных линий.
13. Из вторичного выделения, описанных в пункте 1.12, выбрать 2-3 клеточные линии с высоким ответ в пластине анализа биолюминесценции кальция и поддерживать их в культуре для дальнейших анализов биолюминесценции кальция пластины. Следите за проход чисел. Время от времени, замораживать клеточные линии с раннего проходы так, что вы всегда можете вернуться к ним, если клеточных линий с более проходов прекратить выполнение последовательно.

2. Пластины кальция биолюминесценции анализа

1. Лигировать репортер гена в вектор экспрессии. Здесь мы использовали aequorin плазмиды mtAEQ/pcDNA1 (подарок от доктора. CJP Grimmelikhuijzen и Майкл Уильямсон, Копенгагенский университет, Дания). Преобразование плазмиды в E. кишечной клетки MC1061/PS (Invitrogen) и очищать их с помощью QIAprep спина miniprep комплект (Qiagen Inc.) На заключительном этапе вымывается плазмиду с Tris буфера без ЭДТА, а не воды.
2. Расти клеточных линиях, начиная с шага 1,13 выразить желаемое рецепторов в поддержании среды. Когда клетки на 90% сливающиеся, trypsinize, центрифуги, а затем снова приостановить клетки в 5 мл обслуживания среды как в шаге 1.3. Развести клетки (около 10 раз с сохранением среды) и подсчитать количество клеток с сотовыми счетчик (Bright-Line Hemacytometer) под микроскопом. Настройте номер ячейки примерно 2 х 10 ⁵ клеток / мл (в среднем 20 ячеек в одном из 9 квадратов показали в Hemacytometer). Семенной 2 мл разбавленной клеток в средствах массовой информации в каждую лунку шесть хорошо пластины. Инкубируйте в течение 24 часов (клетки должны составить около 60% слияния после инкубации).
3. Изменение информации в 6 пластины скважин OPTI-MEM среде. Для каждой скважины, смешайте 96 мкл OPTI-MEM с 4 мкл FuGENE 6 Трансфекция реагента (Roche Biochemicals) в микроцентрифужную трубку и пусть сидят при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 1 мкг aequorin / pcDNA 1 плазмида ДНК в каждой пробирке, а затем аккуратно встряхнуть образца в течение 1 мин, инкубировать при комнатной температуре в течение 15-20 мин. Добавить каждой смеси в каждую лунку в моде в то время как по каплям осторожно встряхивая и пластины. Инкубируйте пластин в течение 6 часов и изменение средних F12K среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки без антибиотика.
4. После инкубации клеток в шесть хорошо пластине в течение 24 часов, trypsinize, центрифугу и вновь приостановить клетки шагом 1.3. Граф номер ячейки до 400000 клеток / мл, как шаг 2,1 и передачи 100 мкл (всего 40000 cells/100 мкл) в каждую лунку 96-луночного белой тонкой нижней планшет (Costar 3610). Инкубируйте в течение еще 24 часов, пока около 80% слияния ячейки. Это оптимальная концентрация клеток для биолюминесценции анализа.
5. Подготовка 90μl/well из кальция, свободных средств массовой информации DMEM (Invitrogen), содержащий 5 мкМ coelenterazine (Invitrogen) в темноте (coelenterazine является светочувствительным). Возьмите пластину с 2,4, удалите старые медиа и добавьте эту 90μl в каждую лунку. Инкубируйте пластин в течение 3 часов в темноте при 37 ° С и 5% CO _2, после чего клетки пластины готовы к тестированию.

3. Эксплуатация прибора и анализа данных

1. Каждый читатель биолюминесценции пластина отличается. Мы выполняем наши методом с использованием NOVOstar (BMG Labtechnologies) ридер в bioluminensence режиме. Если вы используете другой инструмент, необходимо адаптировать протокол.
2. Чистки ридер насосов (или премьер-НАСОСЫ) перед использованием. Выключите свет в комнате, прежде чем положить пластинку на пластине держателя. Как только пластина держателя закрыл, включить свет.
3. Солюбилизации пептидов (в 1,5 мл Eppendorf трубки) в кальция, свободных средств массовой информации DMEM. Установить "Аспирируйте Глубина» и «определение местоположения» пептида раствор перед использованием. Вызов ячейки с 10 мкл (10x) различной концентрации пептидов (FFFSWG-NH2, Aedes-К1-3, или другой желаемой пептид) и сразу же начать запись светового излучения. Мы создали инструмент для записи светового излучения (465 нм) для каждой скважины каждые 2 секунды в течение всего времени 50 секунд.
4. Обязательно укажите положительного контроля, такие как активный аналоговый (аналоговый FFFSWGa была использована, Taneja-Bageshwar и соавт., 2009) и отрицательного контроля, такие как вектор только трансфекции клеток. Отрицательного контроля необходимо во время анализа данных, чтобы установить базовые порога (см. представитель результатов).Не связаны, неактивный пептид также может быть добавлен в качестве отрицательного контроля.
5. После запуска завершен, промывайте инструмент насоса (или премьер-насосы), то место вашего следующего образца пептида. Сохраните данные и промыть насос снова.
6. Обработка данных: Передача данных светового излучения из каждой лунки в лист Microsoft Excel данных.
7. Вставить данные из Excel в Призма программного обеспечения от 4,0 GraphPad Software Inc (Сан-Диего, Калифорния, США). Различных концентрациях пептида по оси Х и биолюминесценции единиц Y-оси. Для нормализации данных, участок лог-ответ кривой. Выберите нелинейной регрессии кривая соответствует анализа (сигмоидального доза-реакция уравнения с переменным наклоном), чтобы получить реакции на концентрацию кривые для каждого пептида. Программа участки значения, в конце концов и дает ЕС _50.
8. Каждый эксперимент следует повторить три раза для анализа данных.

4. Представитель Результаты:

При выраженных в СНО-К1 клетки, комаров Aedes aegypti кининовой рецептор вел себя как multiligand рецепторов и функционально ответил на таких низких концентрациях, как 1 нМ из трех endogenours Aedes кинины, Aedae кинины 1-3, испытаны отдельно использованием пластин кальцием биолюминесценции анализа . На рисунке 1 показано, что ранг порядке потенции полученный Aedae-К-3> Aedae-К-2> Aedae-K-1, основанного на соответствующих ЭК ₅₀ значений Aedae-К-3, 16,04 нм; Aedae-K- 2, 26,6 нМ и Aedae-К-1, 48,85 нм, что было статистически значимо отличается (P <0,05) (Pietrantonio и соавт., 2005).

Мы также использовали этот анализ, чтобы определить, какие кининовой остатков имеют решающее значение для кининовой пептид-рецепторного взаимодействия. Пептиды насекомых кининовой доля С-концевой пентапептида, который представляет минимальную последовательность, необходимые для биологической активности, также известный как ядро. В таблице 1, кининовой аналогов основных пептида были синтезированы, как аланин серии замена основных кининовой пентапептида FFSWGa и проверены пластины кальцием биолюминесценции анализа (Taneja-Bageshwar и соавт., 2006). Мы обнаружили, что аминокислоты Phe ¹ и Trp ⁴ имеют существенное значение для деятельности насекомых кинины для обоих рецепторов.

Анализ также может быть использован для тестирования пептидов предназначен для расширения биостойкость. Таблица 2 показывает, предназначенные кининовой аналогов содержащие аминокислоты изомасляной кислоты (AIB) проверено на тик рекомбинантный рецептор кининовой и Рисунок 2 показывает активность сравнение шести альфа-амино изомасляной аналогов кислоты на рецепторы тик кининовой выражения СНО-К1 клеточной линии от кальция биолюминесценции пластины анализа (Taneja-Bageshwar и соавт., 2009). Гексапептид аналоговых FFFSWGa добавляется для положительного контроля для активности рецепторов. Аналоговые FF [Айб] WGA привел более активно, чем это гексапептид аналогового управления. Аналоговый с двумя заменами aminoisobutyric кислота, [Айб] FF [Айб] WGA, был самым мощным из двойной замены аналогов испытания (табл. 2 и рис 2).

Дополнительные примеры того, как этот анализ был и может быть применен видеть Нахмана и Pietantonio (2010), Нахмана и соавт. (2009), Taneja-Bageshwar и соавт. (2008a), а Taneja-Bageshwar и соавт. (2008b).

Рисунок 1. Оценка Aedes кинины эффективной концентрации (ЕС ₅₀₎ на СНО-К1 E10 клеток кальцием биолюминесценции пластины теста. Оси ординат в реакции на концентрацию кривых была получена из биолюминесценции единиц выражается в процентах от максимальной реакция, наблюдаемая для каждого пептида. Данные точки представляют собой в среднем по шесть повторяет, полученные в ходе трех независимых экспериментах. Столбики показывают стандартную ошибку. () Оценка Aedae-K1 ЕС ₅₀ = 48 нМ. (В) Оценка Aedae-K2 ЕС ₅₀ = 26 нМ. (C) Оценка Aedae-K3 ЕС ₅₀ = 16 нМ. ЭК ₅₀ Aedae-K3 <ЭК ₅₀ Aedae-K2 <ЭК ₅₀ Aedae-К1, р <0,05. Статистический анализ и графики были с программным обеспечением GraphPad Призма 4.0.

Рисунок 2. Активность сравнение шести альфа-амино изомасляной аналогов кислоты на тик кининовой рецептор выразив СНО-К1 клеточной линии на пластине анализа биолюминесценции кальция. Оси ординат представляет процент максимальной единицы биолюминесценции для каждого аналогового выраженное в процентах биолюминесценции наблюдается при концентрации по сравнению с максимальным реакция, наблюдаемая среди всех протестированных концентраций для каждого аналога. Статистический анализ и графики были выполнены с GraphPad программного обеспечения Призма 4.0.

Таблица 1. Расчетное потенции (ЕС ₅₀₎ и максимальный ответ биолюминесценции всех пептидов протестирован на клещей и комаров рецепторов трансфекции клеточных линий *.

* ЕС ₅₀ оценки концентрации, необходимой, чтобы вызвать полумаксимальной ответ. Я: не активизированы, если биолюминесценции ответа составляет менее 300 единиц (уровень вектор-только трансфекции клеток). : Положение, когда соответствующие остатки в пептидных FFSWGa был заменен аланина. Н. Д.: аналоговый была протестирована, но либо не очень активны или не активны в нижней molarities, таким образом, EC50 не может быть определен.

Таблица 2. Кининовой аналогов (К), содержащего аминокислоты изомасляной кислоты (AIB) проверено на тик рекомбинантный кининовой рецепторов. Ac: ацетил; α мне: α метил-фенилаланин; β3F: β3-фенилаланин;: амида.

Мы были в состоянии выполнять функциональные характеристики первого рецептор нейропептида обнаружил из паукообразных (клещи, клещи и пауки), рецептор тик кининовой, с помощью этого протокола. Этот метод имеет три основных приложений. Во-первых, методика может быть применена для рецепторов deorphanization путем измерений лиганд деятельности. Во-вторых, анализ может решить лиганд-рецепторных структур и активности (SAR). В-третьих, методы могут быть использованы в лекарственных препаратах. Кроме того, этот протокол может быть использован для изучения активности агонистов или антагонистов практически на любой GPCR. Мы начинаем адаптировать этот протокол для скрининга малых библиотек. Линия клеток мы использовали не выражает вездесущий белка G G _16. Нам не нужно, потому что членистоногих кининовой рецепторов сигнал через Gq белка и внутриклеточный каскад кальция и они сохраняют эту сигнализацию свойства в клетках млекопитающих, как показано здесь.

Др. CJP Grimmelikhuijzen и Майкл Уильямсон из Университета Копенгагена (Дания) ценятся за предоставление aequorin плазмиды. Наш сотрудник, доктор Рональд Дж. Нахмана из ARS-USDA (штат Техас, США), признается для синтеза пептидов и за предоставление читателю NOVOstar пластины.