Пресинаптически Тихая Синапсы Учился с световой микроскопии

Глутаматергической синапсов может переключаться с активного режима в режим без звука. Мы показываем, что пресинаптические статус активности в культуре диссоциированных нейронов грызунов визуализируется использованием поправимо форме FM1-43 красителя для визуализации активных синапсов и иммуноокрашивания с vGluT-1 антител визуализировать все глутамата синапсов.

Синаптической пластичности вероятно, лежит в основе способности нервной системы, чтобы узнать и запомнить, а также может представлять приспособляемости, который предотвращает повреждения в противном случае оскорбления стать нейротоксическое. Мы изучали форму пресинаптической пластичности что интересно отчасти потому, что выражается в виде цифровых включение и выключение способности пресинаптических терминал с выпустить пузырьки содержащей нейромедиатора глутамата. Здесь показано, протокол для визуализации статуса активности пресинаптических терминалах в диссоциированных культурах клеток получают из грызунов гиппокампе. Метод основан на выявлении активных синапсов использованием окрашивания поправимо форме стирил красителя FM1-43, который обычно используется для обозначения синаптических пузырьков. Это окрашивание профиля по сравнению с иммунной одного и того же терминалы с антителами, направленными против везикулярного транспортера глутамата 1 (vGluT-1), пятна, направленных на этикетке все глутамата синапсов, независимо от состояния активации. Мы считаем, что деполяризующего раздражители вызывают пресинаптических глушителей. Население синапсов, в котором отсутствуют в исходных условий могут быть активированы длительной электрической заставить замолчать или путем активации цАМФ сигнальных путей.

Культура подготовки

1. Подготовка диссоциированных культурах клеток крысы или мыши гиппокампа клетки от послеродовой день от 0 до 3 животных ^1. Наши нейроны придерживаться основных астроцитов монослоя, который в свою очередь придерживается коллагена слой распространяется на номер 0 толщина покровного. Пластина нейронов при плотности около 500 клеток на квадратный сантиметр.
2. Разрешить культур расти в течение 10-14 дней, чтобы синаптических развития и созревания. Лечить культур в день в пробирке 4 с антимитотическим AraC на прекращение дальнейшего роста глиальных. Накормите их на день в пробирке из 5 с половиной обмена среде с Neurobasal средний плюс B27 дополнения к повышению нейронов выживания.
3. Во время периода культивирования, ввести процедуры, направленные на изменение числа функционально замолчать синапсов. Мы обнаружили, что один удобный способ, чтобы заставить замолчать большой процент (~ 80%) глутамата синапсов 4-часовой обработки с 30 мМ калий. Более инкубации с более слабыми стимулами побудить деполяризующего аналогичным ² глушителя. 4-часовой стимуляции 50 мкмоль форсколин, активатор циклаз аденилил, может быть использовано, чтобы пробудить население молчит терминалы в начале исследования ^3.

Визуализация молчать синапсов

1. Клетки должны иметь относительно низкой плотности с хорошо разделенными процессами neuritic в день в пробирке 10-14 с тем чтобы облегчить визуализации дискретных синаптических терминалов с помощью флуоресцентной микроскопии.
2. Подготовка исходного раствора, 5 мМ FM1-43FX в дистиллированной воде. Акции должны быть сохранены в темноте при 4 ° C. Все эксперименты с использованием FM1-43FX также должна быть выполнена в темно.
3. Вызов культур в течение 2 минут с 45 мМ хлористого калия в HEPES-солевой буфер раствор, содержащий 100 мМ хлорида натрия, 2 мМ хлорида кальция, 1 мМ хлорид магния, 10 мМ глюкозы, и 10 мкМ FM1-43FX. Это решение должно также содержать 1 мкМ NBQX и 25 мкМ D-APV блокировать постсинаптические рецепторы и профилактики повторных сигнализации. Эта задача будет этикетке синаптических терминалов, которые способны экзоцитоз и эндоцитоз. Вызов времени и сил призваны вызвать по крайней мере один раунд экзоцитоза все имеющиеся пузырьки в ⁴ бассейна утилизации. Тем не менее, задача заключается не достаточно, чтобы вызвать дополнительный глушитель терминалов.
4. Вымойте культуры от 3 ​​до 5 секунд, используя те же HEPES-солевой буфер без хлористого калия, но с 500 мкМ Advasep-7 для удаления неспецифических красителя ^5. Обратите внимание, что сроки этого шага является критическим, как длительное применение Advasep-7 приведет к потере всех FM1-43FX маркировки. Следующая мыться в HEPES-солевой буфер без Advasep-7 в течение пяти 2-минутных интервалов.
5. Fix клетки с 4% параформальдегида и 0,2% глутаральдегида в PBS, рН 7,4 в течение 10 минут. Вымойте клетки раз кратко PBS, затем инкубировать в течение 15 минут в блокировании раствор, содержащий 4% нормальной козьей сывороткой и 0,04% Тритон Х-100 в PBS. Обратите внимание, что FM1-43FX также очень чувствительна к количеству Тритон Х-100 используется здесь и в последующих действиях. Вообще говоря, FM1-43FX маркировки является лучшим в отсутствие каких-либо Тритон Х-100, но некоторые моющие средства необходимо permeabilize клеток для последующей иммунной окраски. Мы определили, что эмпирически 0,04% Тритон Х-100 является оптимальным для изучения пресинаптически молчать синапсов.
6. Развести первичной vGluT-1 антител в блокировании решения в концентрации 1:2500. Инкубируйте клетки с осторожном встряхивании / поворот в разбавленных vGluT-1 антител в течение 3 часов при комнатной температуре. Будьте уверены, чтобы покрыть ваши блюда культуры с фольгой, чтобы отбеливание FM1-43FX красителя.
7. Вымойте клетки дважды в PBS, а затем инкубируют клетки с анти-морская свинка антител сопряженных с флуорофора с различными спектральными характеристиками от FM1-43FX различать два пятна. Для нашего эксперимента, мы будем использовать Alexa 555-сопряженных анти-морская свинка антитела при 1:500 в блокировании решения. Инкубируйте клетки с вторичным антителом при встряхивании в течение 30 минут при комнатной температуре.
8. Вымойте клетки еще четыре раза в ФСБ, а затем установите крышку поскользнуться на стекло с помощью небольшой капли Fluoromount-G. Будьте уверены, чтобы ориентироваться покровное так, чтобы клетки лицо слайда. Разрешить слайды для высыхания на ночь.
9. Теперь мы готовы приобрести образы активных и неактивных синапсов. Подготовка 60 х нефти объектива с числовой апертурой 1,4 по конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Место скользят по сцене, гарантируя, что стороны покровного сталкивается цели. После фокусировки слайд, находить области невриты, что не слишком плотными. Рекомендуется также, чтобы избежать визуализации возле ячейки сомы, как остаточные FM1-43FX красителя может оставаться там даже после тщательной промывки. Для наших экспериментальных образов, которые мы обычно увеличить на поле размером 51 51 микрон.
10. ПриобретатьZ-Stack данного поля покрытия глубиной 7,8 мкм с 27 0,3-микронной шагов. Этот диапазон достаточно для покрытия толщиной нейритов в нашей культуре. Для каждого шага в Z-Stack, сканирования сначала с лазерным светом, который возбуждает иммунофлюоресценции из vGluT-1 антитела для выявления всех глутаматергической синапсов в поле микроскопа. Же области повторно сканировать на каждом шаге для FM1-43FX флуоресценции. Установить нейтральной плотности и фильтрации ФЭУ доходы последовательно среди всех покровные для данного эксперимента, избегая при этом насыщенность сигнала. Мы обычно приобретают ≥ 5 полей в состояние для каждого эксперимента.
11. Использование программного обеспечения для анализа, конвертировать Z-Stack в композитных одной плоскости изображения. Процесса мы используем для этого преобразования производит изображения на основе максимальной интенсивностью от любой плоскости в каждой точке. Композитные изображения thresholded и vGluT-1 терминалов определены для анализа, без ссылки на FM1-43FX пятно. Витражи областях, именуемых puncta, отмечены как области интереса. Как правило, мы выбрать 10 puncta на поле. Следующая FM1-43FX канал thresholded и регионах, представляющих интерес накладываются. Программное обеспечение для анализа используется для количественной оценки интенсивности флуоресценции каждого сигнала, а также площадь каждого Punctum. Абсолютный критерий пиксель или критерий процент пикселей может быть использован для отличать активных от неактивных синапсов.

Представитель Результаты

1. В нашей культуре, мы находим, что 70-80% глутамата синапсов, определяется vGluT-1 окрашивания, проявляют обнаружить FM1-43 окрашивание ^{2, 6-8.} В накладными изображениями зеленых FM1-43 и красной флуоресценции vGluT-1 окрашивания это нашло свое отражение как обилие желтых puncta: синапсы с со-локализованы маркеров. Это показано стрелками.
2. Примерно 20-30% (красный) vGluT-1 положительных puncta не сможет иметь (зеленый) FM1-43 флуоресценции выше базового уровня. Эти неактивные пресинаптических терминалах, а также пример указывает стрелка.
3. Третий населения синапсов будет наблюдаться. Это положительный (зеленый) FM1-43 флуоресценции, но лишенный (красный) vGluT-1 окрашивания. Это активные ГАМКергических синапсов и пример указывается звездочкой. Они исключены из большинства наших анализов, но может быть явно изучались с помощью везикулярного транспортера ГАМК антител в месте vGluT-1 антител.

Значение

1. Обычно синапсов, как считается, работают, выпуская передатчик с измеримые вероятности. Работа по себе и другим, делает очевидным тот факт, что некоторые синапсы к выпуску огнеупорных нейромедиатор, несмотря на полный комплект везикулярного транспортера нейротрансмиттера и других ключевых пресинаптических маркеров ^{2, 6-8.} Ранее нами было показано, что базальная сетевой активности в нейронах, имеет решающее значение для поддержания этой группы населения неактивных синапсов.

Критические шаги

1. Включение краткой мыть с 500 мкМ Advasep-7 значительно повышает качество FM1-43FX окрашивания. Однако даже небольшое увеличение сроков этой переливаться через 5 секунд приведет к потере FM1-43FX маркировки.
2. FM1-43FX очень чувствительна к количеству Тритон Х-100, используемых в иммунной часть протокола. FM1-43FX маркировки является лучшим в отсутствие каких-либо Тритон Х-100, но некоторые моющие средства необходимо permeabilize клеток для vGluT-1 иммунной окраски. Мы определили, эмпирически, что на 0,4% Тритон Х-100 является оптимальным для изучения пресинаптически молчать синапсов.

Изменения

1. Можно использовать в качестве маркера постсинаптических ^3-й пятно для обеспечения vGluT-1 окрашивания представляет добросовестных синапсов: точки соприкосновения пузырьков нагруженные терминалов и постсинаптических рецепторов кластеров.
2. Можно также выбрать использование других пресинаптических маркеров антитела, такие как пан-синаптические маркер, SV2, или vGAT.

Эта работа была поддержана грантами NIH DA018109 и MH78823 и NIH Neuroscience Blueprint Основные Грант P30NS057105 в Вашингтонском университете.