סינפסות שקט Presynaptically למד עם מיקרוסקופ אור

סינפסות Glutamatergic יכול לעבור ממצב פעיל למצב שקט. אנו מראים כי מצב פעילות presynaptic בתרבות ניתק של נוירונים מכרסם הוא מדמיין באמצעות טופס ניתן לתקן של צבע FM1-43 לדמיין סינפסות פעיל immunostaining עם נוגדן vGluT 1-לדמיין כל סינפסות הגלוטמט.

פלסטיות בבסיס Synaptic סביר היכולת של מערכת העצבים ללמוד ולזכור ואולי גם לייצג ההסתגלות שמונעת אחרת עלבונות פגיעה מלהפוך neurotoxic. אנחנו כבר לומדים צורה של פלסטיות presynaptic כי הוא מעניין, בין השאר משום שהוא מבוטא מיתוג דיגיטלי לסירוגין היכולת מסוף s presynaptic לשחרר שלפוחית ​​המכילה את הנוירוטרנסמיטר גלוטמט. כאן אנו להדגים פרוטוקול המאפשר הדמיה מצב הפעילות של מסופי presynaptic בתרביות תאים ניתק מוכן מן ההיפוקמפוס מכרסמים. השיטה מסתמכת על גילוי סינפסות פעיל באמצעות מכתים עם צורה ניתן לתקן את צבע styryl FM1-43, נפוץ תווית שלפוחית ​​סינפטית. פרופיל זה מכתים הוא בהשוואה immunostaining של המסופים אותו עם נוגדן כנגד המשלח גלוטמט שלפוחי 1 (vGluT-1), כתם נועד תווית כל סינפסות הגלוטמט ללא קשר למצב ההפעלה. אנו מוצאים כי גירויים depolarizing להשרות השתקה presynaptic. האוכלוסייה של סינפסות כי הוא שותק בתנאי ההתחלה יכול להיות מופעל על ידי השתקת חשמל ממושכת או על ידי הפעלה של מסלולי איתות cAMP.

תרבות הכנה

1. הכנת תרביות תאים ניתק של תאים בהיפוקמפוס חולדה או עכבר מיום הלידה 0-3 חיות ^1. הנוירונים שלנו לדבוק monolayer astrocyte הבסיסית, אשר בתורו שומרת על שכבת קולגן להתפשט על coverslip 0 מספר עובי. פלייט הנוירונים בצפיפות של כ 500 תאים לסנטימטר מרובע.
2. אפשר תרבויות לגדול במשך 10-14 ימים כדי לאפשר פיתוח התבגרות הסינפטי ו. פנקו את התרבויות ביום במבחנה 4 עם AraC antimitotic לעצור צמיחה גליה נוספת. הזנת אותם יום במבחנה 5 עם חילופי בינוני וחצי עם Neurobasal בינוני פלוס תוסף B27 כדי לשפר את ההישרדות עצביים.
3. במהלך התקופה תרבות, להציג טיפולים שנועדו לשנות את מספר הסינפסות השתיק תפקודית. אנו מוצאים כי אחד דרך נוחה להשתיק אחוז גדול (~ 80%) של סינפסות הגלוטמט הוא טיפול של 4 שעות עם אשלגן 30 מ"מ. Incubations ארוכים עם גירויים depolarizing חלש להשרות ² השתקה דומה. גירוי של 4 שעות עם 50 מיקרומטר forskolin, activator של cyclases adenylyl, יכול לשמש כדי לעורר את האוכלוסייה של מסופי שקט בתחילת המחקר ^3.

לדמיין סינפסות שותק

1. תאים צריך צפיפות נמוכה יחסית עם מופרדים היטב תהליכים מדלקת עצבים ביום במבחנה 10-14 כדי לאפשר ויזואליזציה של המסופים הסינפטיים בדידה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
2. הכן פתרון המניות של 5 מ"מ FM1-43FX במים מזוקקים. המניה יש לשמור בחושך ב 4 ° C. כל הניסויים באמצעות FM1-43FX צריך גם להתבצע בחושך.
3. אתגר התרבויות במשך 2 דקות עם אשלגן כלוריד 45 מ"מ מלוחים פתרון HEPES שנאגרו המכיל נתרן 100 mM כלוריד, סידן כלוריד 2 מ"מ, מגנזיום כלוריד 1 מ"מ, 10 גלוקוז מ"מ, ו - 10 מיקרומטר FM1-43FX. פתרון זה אמור גם להכיל 1 מיקרומטר NBQX ו -25 מיקרומטר D-APV לחסום קולטנים postsynaptic ולמנוע איתות חוזרת. אתגר זה יהיה תווית המסופים הסינפטיים המסוגלים exocytosis ו אנדוציטוזה. השעה אתגר וכוח נועדו לגרום לפחות סיבוב אחד של exocytosis של כל שלפוחית ​​זמין ⁴ הבריכה מיחזור. עם זאת, האתגר אינו מספיק כדי לגרום השתקה נוספת של מסופי.
4. שטפו את התרבות במשך 3 עד 5 שניות בלבד, תוך שימוש באותו HEPES שנאגרו מלוחים ללא אשלגן כלורי, אבל עם 500 מיקרומטר Advasep-7 להסיר צבע ספציפי ^5. ראוי לציין, כי העיתוי של הצעד הזה היא קריטית כיישום ממושכת של Advasep-7 תגרום לאובדן של תיוג FM1-43FX כל. לשטוף הבאה HEPES שנאגרו מלוחים ללא Advasep-7 2 במשך חמש דקות.
5. תקן תאים עם paraformaldehyde 4% ו 0.2% ב glutaraldehyde PBS, pH 7.4 למשך 10 דקות. לשטוף את התאים לאחר זמן קצר עם PBS, אז דגירה במשך 15 דקות בתמיסה המכילה חוסם 4% נסיוב עז נורמלי טריטון 0.04% X-100 ב PBS. שים לב FM1-43FX הוא גם רגיש מאוד לסכום של טריטון X-100 השתמשו כאן ב צעדים מאוחר יותר. ככלל, FM1-43FX תיוג הוא הטוב ביותר בהיעדר טריטון X-100, אך חומר ניקוי כלשהו יש צורך permeabilize תאים immunostaining הבאים. יש לנו נקבעים אמפירית כי 0.04% Triton X-100 הוא אופטימלי לבדיקה של סינפסות שקט presynaptically.
6. לדלל את הנוגדן העיקרי vGluT-1 בחסימת פתרון בריכוז של 1:2500. דגירה התאים עם סיבוב עדין רועד / ב בדילול vGluT-1 נוגדנים במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. הקפידו לכסות מנות התרבות שלך עם רדיד כדי למנוע הלבנת של צבע FM1-43FX.
7. לשטוף את התאים פעמיים PBS ואז דגירה התאים עם הנוגדנים נגד ניסיונות חזיר מצומדות כדי fluorophore עם מאפיינים ספקטרליים שונים FM1-43FX להבחין בשני כתמים. לצורך ניסוי שלנו, נשתמש אלקסה 555-מצומדות נגד ניסיונות נוגדן חזיר בשעה 1:500 בחסימת פתרון. דגירה התאים עם הנוגדנים המשני תוך רעד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
8. לשטוף את התאים ארבע פעמים יותר PBS ואז הר להחליק לכסות על זכוכית שקופית באמצעות ירידה קטנה של Fluoromount-G. הקפד coverslip להתמצא כך התאים פני שקופיות. אפשר השקופיות לייבוש למשך הלילה.
9. כעת אנחנו מוכנים לרכוש תמונות של סינפסות פעיל פעיל. הכן אובייקטיבית שמן x 60 עם צמצם 1.4 מספרית על מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. המקום שקופיות על הבמה, על מנת להבטיח כי הצד coverslip פונה המטרה. לאחר התמקדות השקופית, למצוא שדה neurites זה לא צפוף מדי. מומלץ גם להימנע הדמיה סומה ליד התא, כמו צבע שיורי FM1-43FX יכול להישאר שם גם אחרי כביסה נרחב. לקבלת תמונות הניסוי שלנו, אנו בדרך כלל זום לגודל שדה של 51 51 מיקרון.
10. לרכושZ-ערימה של שדה נתון כיסוי לעומק של 7.8 מיקרון עם 27 0.3 מיקרון צעדים. טווח זה מספיק כדי לכסות את עובי של neurites בתרבות שלנו. לכל שלב בערימה-z, סרוק הראשון עם אור לייזר זה מלהיב immunofluorescence של נוגדן vGluT 1-לזהות את כל הסינפסות glutamatergic בתחום מיקרוסקופ. השדה אותו מחדש סרק בכל שלב של הקרינה FM1-43FX. הגדר סינון צפיפות ניטרלי ורווחי מכפיל בעקביות בין כל coverslips לניסוי נתון, תוך הימנעות הרוויה של האות. אנחנו בדרך כלל לרכוש ≥ 5 שדות לכל תנאי כל ניסוי.
11. באמצעות תוכנת ניתוח, להמיר את Z-מחסנית לתוך תמונה מטוס בודד מרוכבים. תהליך אנו משתמשים עבור המרה זו מייצרת דימוי המבוסס על עוצמת מקסימום מהמטוס כל כל פיקסל. הדימוי מורכב הוא thresholded ו vGluT-1 מסופי מזוהים לניתוח, ללא התייחסות FM1-43FX הכתם. אזורים ויטראז, המכונה puncta, מסומנים כמו אזורים של עניין. אנחנו בדרך כלל לבחור 10 puncta לכל שדה. הבא בערוץ FM1-43FX הוא thresholded לבין אזורים של עניין הן על גבי. תוכנת הניתוח משמש לכמת את עוצמת הקרינה של כל אות, כמו גם את השטח של כל פונקטום. קריטריון פיקסל מוחלט או קריטריון פיקסל אחוז יכול לשמש כדי להבדיל בין הסינפסות פעיל פעיל.

נציג תוצאות

1. בתרבויות שלנו, אנו מוצאים כי 70-80% של סינפסות הגלוטמט, שהוגדר על ידי מכתים vGluT 1-, התערוכה לזיהוי FM1-43 מכתים ^{2, 6-8.} בתמונות כיסו של ירוק FM1-43 פלואורסצנטי אדום vGluT-1 מכתים זו כפי שהיא משתקפת שפע של puncta צהוב: סינפסות עם שותף מקומי סמנים. אלו מסומנים על ידי החצים.
2. כ 20-30% של (אדום) puncta vGluT 1-חיובי ייכשל להיות (ירוק) FM1-43 הקרינה מעל הבסיס. אלה הם מסופי presynaptic פעילים, דוגמה מצוינת באמצעות ראש החץ.
3. האוכלוסייה השלישית של סינפסות יהיה גם ציין. אלו הן חיוביות (ירוק) FM1-43 הקרינה אך ללא מכתים vGluT-1 (אדום). אלו סינפסות GABAergic פעיל דוגמה מצוינת באמצעות הכוכבית. אלו אינן נכללות מרבית הניתוחים שלנו, אבל ניתן ללמוד במפורש באמצעות נוגדן טרנספורטר שלפוחי GABA במקום את הנוגדן vGluT 1.

משמעות

1. בדרך כלל סינפסות נחשבים פועלים על ידי שחרור משדר בהסתברות למדידה. עבודה על ידי עצמנו ואחרים עושה את זה ברור כי הסינפסות חלקם עקשן שחרור הנוירוטרנסמיטר, למרות מערך מלא של טרנספורטר הנוירוטרנסמיטר שלפוחי ושאר סמנים presynaptic מפתח ^{2, 6-8.} הראינו בעבר כי פעילות הרשת הבסיס בנוירונים הוא קריטי כדי לשמור על אוכלוסייה זו של סינפסות פעיל.

צעדים קריטיים

1. הכללת לשטוף קצר עם 500 מיקרומטר Advasep-7 משפר באופן משמעותי את איכות מכתים FM1-43FX. עם זאת, אפילו עלייה קלה עיתוי לשטוף זה מעל 5 שניות תגרום לאובדן של תיוג FM1-43FX.
2. FM1-43FX הוא רגיש מאוד בסכום של טריטון X-100 בשימוש בחלק immunostaining של הפרוטוקול. FM1-43FX תיוג הוא הטוב ביותר בהיעדר טריטון X-100, אך חומר ניקוי כלשהו יש צורך permeabilize תאים immunostaining vGluT 1. יש לנו נקבעים אמפירית כי 0.4% Triton X-100 הוא אופטימלי לבדיקה של סינפסות שקט presynaptically.

שינויים

1. אפשר להשתמש בסמן postsynaptic כמו 3 ^rd כתם על מנת להבטיח vGluT-1 מכתים מייצג סינפסות שבתום לב: נקודות מגע בין שלפוחית ​​עמוס מסופים אשכולות קולטן postsynaptic.
2. אפשר גם לבחור להשתמש סמנים אחרים נוגדן presynaptic כגון סמן הפאן סינפטי, SV2, או vGAT.

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים DA018109 ו MH78823, ו-NIH Neuroscience Blueprint Core גרנט P30NS057105 כדי אוניברסיטת וושינגטון.