라이트 현미경과 연구 Presynaptically 사일런트 시냅스

Glutamatergic 시냅스는 자동 모드로 활성 모드에서 전환할 수 있습니다. 우리는 쥐 뉴런의 dissociated 문화에 presynaptic 활동 상태를 보여주는 것은 적극적인 시냅스를 시각화하는 FM1 -​​ 43 염료의 고칠수 양식을 사용하여 모든 글루 탐 산염 시냅스를 시각화하는 vGluT - 1 항체와 immunostaining 시각이다.

시냅스 소성 가능성 underlies 학습과 기억 또한 neurotoxic되는 것을 달리 손상 모욕을 방지 적응력을 나타내는 5 신경계의 능력. 그것이 신경 전달 물질의 글루 탐 산염을 포함한 vesicles 발표 presynaptic 터미널의 능력의 디지털 전환 및 해제로 표현되기 때문에 우리는 부분적으로 흥미로운 presynaptic 소성의 형태를 공부하고 있습니다. 여기서 우리는 설치류의 해마에서 준비 dissociated 셀 문화에 presynaptic 터미널의 활동 상태를 시각화를위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 메서드는 일반적으로 시냅스 vesicles 레이블을하는 데 사용되는 styryl 염료의 고칠수 형태 FM1 -​​ 43와 얼룩을 사용하여 활성 시냅스를 감지에 의존합니다. 이 얼룩 프로필은 기공을 갖는 글루 탐 산염 수송 1 (vGluT - 1)에 관계없이 정품 인증 상태의 라벨 모두 글루 탐 산염 시냅스를위한 얼룩에 대한 감독 항체와 같은 단말기의 immunostaining와 비교됩니다. 우리는 depolarizing 자극이 presynaptic 입을를 유도 것을 발견했습니다. 기준 조건 하에서 침묵 시냅스의 인구는 장시간 전기 입을 또는 CAMP 신호 통로의 활성화에 의해 활성화할 수 있습니다.

문화 준비

1. 출생 후의 일 0-3 ^{동물에게 1에서} 쥐가 드나 마우스 hippocampal 세포의 세포 dissociated 문화를 준비합니다. 우리의 뉴런은에 숫자 0이 두께 coverslip에 보급 콜라겐 층을 준수 돌려 기본 astrocyte monolayer에 준수. cm2 당 약 500 세포의 밀도에 신경 플레이트.
2. 문화가 시냅스 개발과 성숙을 할 수 10~14일위한 성장을 허용합니다. 더 glial 성장을 체포하기 위해 antimitotic의 AraC과 함께 체외 4 일에있는 문화를 처리합니다. 의 연결을 생존을 향상시키기 위해 Neurobasal 중간 플러스 B27 보충과 반 중간 교환과 체외 5 일에서 그들을 먹여 살리지.
3. 문화 기간 동안 기능 침묵 시냅스의 숫자를 변경하기위한 트리 트먼트를 소개합니다. 우리는 글루 탐 산염 시냅스의 큰 비율 (~ 80 %) 침묵 한 편리한 방법 30 MM의 칼륨과 함께 4 시간 치료는 것을 발견했습니다. 약한 depolarizing 자극과 함께 더 이상 incubations 유사한 입을 ^2를 유발. 50 μm의 forskolin, adenylyl의 cyclases의 활성과 4 시간 자극은 기본 ³ 무성 터미널의 인구를 각성하는 데 사용할 수 있습니다.

자동 시냅스를 떠올리

1. 세포는 형광 현미경을 사용하여 개별 시냅스 터미널의 시각화를 촉진을 줄 수있는만큼 체외 10-14에서 하루 잘 분리 neuritic 프로세스와 상대적으로 낮은 밀도를 가지고해야합니다.
2. 증류수 5 MM FM1 -​​ 43FX의 주식 솔루션을 준비합니다. 주식은 4 어둠 속에서 유지되어야 ° C. FM1 -​​ 43FX를 사용하여 모든 실험도 어둠 속에서 수행되어야합니다.
3. 100 MM 나트륨 염화물, 2 MM의 염화칼슘, 1 MM 마그네슘 염화물, 10 MM 포도당 및 10 μm의 FM1 -​​ 43FX를 포함하는 HEPES - 버퍼 생리 식염수 45 MM 염화칼륨 2 분 동안 문화를 도전한다. 이 솔루션은 또한 postsynaptic 수용체를 차단하고 반복 신호를 방지하기 위해 1 μm의 NBQX 25 μm의 D - APV를 포함해야합니다. 이 과제는 exocytosis와 endocytosis 능력이 시냅스 터미널 레이블을 것입니다. 도전의 시간과 강도는 재활용 풀 ⁴ 사용 가능한 모든 vesicles의 exocytosis 중 적어도 한 라운드를 일으킬 수 있도록 설계되었습니다. 그러나, 문제는 단말기의 추가 입을를 일으킬 수있는 충분한되지 않습니다.
4. 염화칼륨없이 생리 HEPES - 버퍼지만, 500 μm의와 Advasep - 7 특이 현상이 염료, ^5를 제거하는 똑같은를 사용하여, 오직 3-5초에 대한 문화를 씻으십시오. 이 단계의 타이밍이 모든 FM1 -​​ 43FX 라벨의 손실됩니다 Advasep - 7의 장기간 응용 프로그램으로 중요합니다. 에서 다음 세척 오 2 분 간격을위한 Advasep - 7 않고 생리 HEPES는 버퍼.
5. 10 분 4 % paraformaldehyde와 PBS, pH를 7.4에서 0.2 % 글루 타 알데히드와 세포를 수정. 일단 간단히 PBS로 세포를 씻어 후 PBS에 4% 정상 염소 혈청과 0.04 % 트리톤 X - 100을 포함 차단 솔루션에서 15 분 동안 품어. FM1 -​​ 43FX 또한 트리톤은 X - 100 여기 이상의 단계에서 사용의 양을 매우 민감합니다. 일반적으로, FM1 -​​ 43FX 라벨은 트리톤 Triton X - 100의 부재에서 최고이지만, 일부 세제는 다음 immunostaining에 대한 세포를 permeabilize 필요합니다. 우리는 0.04 % 트리톤 X - 100 presynaptically 침묵 시냅스의 시험에 최적입니다 경험적으로 결정했습니다.
6. 1:2500의 농도에 솔루션을 차단의 기본 vGluT - 1 항체를 희석. 상온에서 3 시간 동안 vGluT - 1 항체 희석의 부드러운 흔들림 / 회전 세포를 품어. FM1 -​​ 43FX 색소의 표백 방지하기 위해 호일와 문화 요리를 커버해야합니다.
7. 두 번 PBS로 세포를 세척 후 두 얼룩을 구분하는 FM1 -​​ 43FX 다른 스펙트럼 특성 형광단에 복합 방지 실험용 돼지 항체와 세포를 품어. 우리의 실험을 위해, 우리는 솔루션을 차단에 1:500에서 555 - 복합 백신 실험용 돼지 항체 알렉사을 사용합니다. 실온에서 30 분 동안 흔들림 보조 항체와 세포를 품어.
8. 세포에게 PBS에서 네번 번 이상 씻으 후 Fluoromount - G의 작은 방울을 사용하여 유리 슬라이드에 커버 슬립을 탑재합니다. 세포 슬라이드를 얼굴 있도록 방향 coverslip해야합니다. 슬라이드가 밤새 건조하도록 허용합니다.
9. 우리는 지금 활성 및 비활성 시냅스의 이미지를 얻기위한 준비가되어 있습니다. 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 1.4 조리개 수치와 60 X 오일 목표를 준비합니다. coverslip 측면이 목적에 직면 있도록, 무대에 슬라이드를 삽입합니다. 슬라이드를 집중하면, 지나치게 밀도되지 neurites의 필드를 찾으십시오. 잔여 FM1 -​​ 43FX의 염색도 광범위한 세척 후 남아 수 있으므로 이것은 또한, 셀 소마 근처 이미징을 방지하는 것이 좋습니다. 우리의 실험 이미지의 경우, 우리는 일반적으로 51 51 미크론의 필드 크기에 확대.
10. 수집27 0.3 - 마이크론 단계로 7.8 미크론의 깊이에 걸쳐 해당 분야의 Z - 스택. 이 범위는 우리 문화의 neurites의 두께를 충당하기 위해 충분하다. Z - 스택의 각 단계에, 현미경 분야의 모든 glutamatergic 시냅스를 식별하는 vGluT - 1 항체의 immunofluorescence 자극 레이저 빛을 처음에 스캔. 동일한 필드가 FM1 -​​ 43FX의 형광 각 단계에서 다시 스캔합니다. 신호의 채도를 피할 수 있지만, 주어진 실험에 대한 모든 coverslips 중에서 지속적으로 중립적인 밀도 필터링 및 photomultiplier 향상을 설정합니다. 우리는 일반적으로 각 실험 조건마다 ≥ 5 필드를 취득.
11. 분석 소프트웨어를 사용하여 복합 단일 평면 이미지로 Z - 스택을 변환합니다. 우리가이 변환에 사용 과정은 각 픽셀에 어떤 비행기에서 최대 강도에 따라 이미지를 생성합니다. 합성 이미지 thresholded하고 vGluT - 1 터미널은 FM1 -​​ 43FX 참조 얼룩없이 분석 식별됩니다. puncta로 불리는 스테인드 영역, 흥미 영역으로 표시됩니다. 우리는 일반적으로 현장 지당 10 puncta을 선택합니다. 다음 FM1 -​​ 43FX 채널이 thresholded하고 관심의 영역은 겹쳐 있습니다. 분석 소프트웨어는 각 신호의 형광 강도뿐만 아니라 각 punctum의 영역을 계량하는 데 사용됩니다. 절대 픽셀 기준 또는 퍼센트 픽셀 기준 비활성 시냅스에서 활성화 구별하는 데 사용할 수 있습니다.

대표 결과

1. 우리 문화, 우리는 vGluT - 1 염색법에 의해 정의된 글루 탐 산염 시냅스의 70~80%은, 감지 FM1 - 43 ^{얼룩이, 6-8을} 전시 것을 발견했습니다. 의 중첩 이미지 녹색 FM1 -​​ 43 형광 붉은 vGluT - 1이이 노란색 puncta 풍부한으로 반영되어 얼룩 : 공동화된 마커와 시냅스. 이들은 화살표로 표시됩니다.
2. (적색) vGluT - 1 양성 puncta의 약 20-30%은 기본 위 (녹색) FM1 -​​ 43 형광을 가지고 실패합니다. 이들은 비활성 presynaptic 터미널이며, 예제는 화살촉으로 표시됩니다.
3. 시냅스의 3 분의 1 인구도 관찰됩니다. 이들에 대한 (녹색) FM1 -​​ 43 형광하지만 (적색) vGluT - 1 얼룩는 없음. 양수 이들은 활성 GABAergic 시냅스이며, 예제는 별표로 표시됩니다. 이들은 우리의 분석의 대부분에서 제외되지만 명시적으로 vGluT - 1 항체의 자리에 기공을 갖는 GABA의 전송 항체를 사용하여 공부하실 수 있습니다.

의미

1. 일반적으로 시냅스는 측정 확률과 송신기를 출시하여 작동하는 생각되고 있습니다. 자신과 다른 사람이 작업은 기공을 갖는 신경 전달 물질의 수송과 다른 주요 presynaptic 마커 ^{2, 6-8의} 전체 보완에도 불구하고, 일부 시냅스가 신경 전달 물질을 방출하는 내화물하는 그것이 분명합니다. 우리는 뉴런의 기초 네트워크 활동이 비활성 시냅스의 인구를 유지하는 것이 중요합니다 그 이전에 보여주었다.

중요 단계

1. 500 μm의 Advasep - 7과 함께 간단한 세척을 포함 상당히 FM1 -​​ 43FX 얼룩의 품질을 향상시킵니다. 그러나, 오초 이상이 세척의 타이밍도 약간 증가 FM1 -​​ 43FX 라벨의 손실을 초래합니다.
2. FM1 -​​ 43FX는 Triton X - 100 프로토콜의 immunostaining 부분에 사용되는 양을 매우 민감합니다. FM1 -​​ 43FX 상표는 트리톤 X - 100의 부재에서 최고이지만, 일부 세제는 vGluT - 1 immunostaining에 대한 세포를 permeabilize 필요합니다. 우리는 0.4 % 트리톤 X - 100 presynaptically 침묵 시냅스의 시험에 최적입니다 경험적으로 결정했습니다.

수정

1. 3 ^차가 vGluT - 1 얼룩은 타고난 시냅스를 대표하기 위해 얼룩처럼 하나는 postsynaptic 마커를 사용할 수 있습니다 : 소포 - 라덴 터미널과 postsynaptic 수용체 클러스터 사이의 연락 지점을.
2. 하나는 또한 팬 시냅스 마커, SV2, 또는 vGAT 같은 다른 presynaptic 항체 마커를 사용하도록 선택할 수 있습니다.

이 작품은 워싱턴 대학에 NIH 보조금 DA018109과 MH78823, 그리고 NIH 신경 과학 청사진 코어 부여 P30NS057105에 의해 지원되었다.